转基因骨髓基质细胞对人脐血CD34+细胞体外扩增作用的研究

为探讨转染FL基因的人原代骨髓基质细胞对脐血CD34+ 细胞的体外扩增效应 ,建立了转基因骨髓基质细胞与人脐血CD34+ 细胞共培养体系。采用免疫磁珠法分离人脐血CD34+ 细胞 ,在不同的体外培养体系中进行培养并取样检测细胞总数 ,CFC和CD34+ 细胞百分率。结果表明 ,在不同组合的培养体系中 ,转基因骨髓基质细胞培养体系较骨髓基质细胞培养体系和无滋养层培养体系对有核细胞总数 ,CFC含量和CD34+ 细胞含量均具有明显的扩增作用 ,分别扩增了 12 2 .5± 4 .3,39.6± 2 .7和 11.8± 0 5 2倍 (P <0 .0 5 )。结论 :转染FL基因的人骨髓基质细胞协同其它细胞因子可增强对人脐血CD34+ 细胞的体外扩增作用。     

脐血和骨髓来源的CD34^＋细胞体外扩增巨核祖细胞差异的研究

本研究探讨脐血（CB）和骨髓（BM）来源的CD34^＋细胞体外扩增巨核祖细胞的差异。采用Ficoll—Hypaque分离法分离人CB及BM单个核细胞，免疫磁珠法制备CD34^＋细胞，在含血小板生成素（TPO）、TPO＋白介素11（IL—11）或TPO＋IL11＋肝素的无血清液体培养体系中培养14天。流式细胞术检测扩增产物（CD34^＋、CD41a^＋及CD34^＋CD41a^＋细胞）免疫表型、巨核细胞凋亡率及DNA含量，并以集落形成单位测定法进行粒巨-噬细胞集落形成单位（CFU—GM）、红系爆式集落形成单位（BFU—E）及巨核细胞集落形成单位（CFU—Mk）计数。结果表明：14天培养中，CB来源细胞在总细胞数、CD41a^＋及CD34^＋CD41a^＋细胞扩增倍数上均高于BM（P均〈0．05）。0天CB及BM来源CD34^＋细胞在CFU—GM、BFU—E及总的CFU—Mk的形成能力上无显著性差异（P均〉0．05），但CB来源CD34^＋细胞形成的CFU—Mk以大集落为主，其数量高于BM（P〈0．05）；在培养7、10和14天，CB及BM来源细胞CFU—GM扩增倍数无显著性差异（P均〉0．05），但CB来源细胞的BFU—E及总的CFU—Mk扩增倍数均高于BM（P均〈0．05）。14天培养中CB和BM来源巨核细胞的凋亡率无显著性差异（P均〉0．05）。DNA含量检测发现，14天培养中CB来源巨核细胞始终以2N细胞为主（比例〉90％），而BM来源巨核细胞随着培养时间延长，4N、8N及以上倍体巨核细胞比例逐渐增加。结论：CB来源CD34^＋细胞体外扩增巨核祖细胞能力高于BM，它可能是巨核祖细胞体外扩增较好的来源。     

PNH患者骨髓CD34^＋CD59^＋细胞体外扩增及植入体内重建造血的活性研究

本研究应用BALB／c裸鼠为移植模型探讨阵发性睡眠性血红蛋白尿症（paroxysmal nocturnal hemoglobin—uria，PNH）患者CD34^＋CD59^＋的增殖和重建造血的能力，为实现PNH患者自体骨髓移植或自体外周血造血干细胞移植提供实验依据。利用免疫磁珠双阳性分选法，从正常人及PNH患者骨髓中分离出两组CD34^＋CD59^＋细胞，分别进行体外扩增，并将体外扩增的正常人和PNH患者骨髓CD34^＋CD59^＋细胞分别输注给接受亚致死剂量照射的BALB／c裸鼠。应用流式细胞技术和DNA检测技术检测受鼠骨髓、脾脏和外周血中人CD45^＋细胞。结果表明：PNH组的CD34^＋CD59^＋细胞在体外生存、扩增能力似弱于正常人对照组。但CD34^＋CD59^＋细胞输注给受鼠后6周，在受鼠骨髓、脾脏和外周血中可检测到人CD45^＋细胞，PNH组受鼠CD45^＋细胞水平与正常人对照组相比，无统计学差异。结论：PNH患者CD34^＋CD59^＋细胞仍具有同正常人CD34^＋CD59^＋细胞相同的生物特性，能体外扩增并能保持正常干／祖细胞的特性。     

磁珠双阳性分选法在阵发性睡眠性血红蛋白尿症患者骨髓CD34+CD59+细胞体外扩增的应用

应用磁珠双阳性分选法在体外扩增阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)患的CD34 CD59 细胞，为实现PNH患进行临床自体骨髓移植(ABMT)或自体外周血干细胞移植(APBSCT)奠定基础。流式细胞术分选虽然经常用于细胞纯化，但难于满足大规模临床细胞分选的需要。本研究利用免疫磁珠系统，应用隔夜孵育法去除第一次分选时CD34 细胞吸附的磁珠，经过两次磁珠双阳性分选，从PNH患骨髓中分离出足够数量的CD34 CD59 细胞，用于体外培养扩增。结果显示：磁珠双阳性法分选的CD34 CD59 细胞与磁珠—流式细胞术二步分选法比较，在细胞生存、增殖、扩增及形成造血集落形成单位(CFU)的能力上均无显性差异。结论：磁珠双阳性分选法可能推广应用于其它双阳性或多阳性细胞的分离纯化，尤其是造血干／祖细胞的分离纯化。     

人参总皂甙协同造血生长因子体外诱导CD34+造血干/祖细胞扩增与分化的作用

为探讨人参总皂甙(total saponins of panax ginseng,TSPG)协同造血生长因子体外诱导CD34+造血干/祖细胞(HSC/HPC)扩增与分化的作用,收集人脐血、骨髓细胞并采用StemsepTM干细胞分选系统分离纯化CD34+HSC/HPC,用不同剂量TSPG加入不同组合的造血生长因子进行培养,检测细胞总数、CD34+细胞和CD33+细胞比例及集落形成细胞总数(CFC)、粒系祖细胞(CFU-GM)数量变化.结果显示10-70μg/ml TSPG均可不同程度地提高脐血细胞总数、CFC数和CD34+细胞数,50μg/ml是最佳刺激浓度,可使细胞总数、CFC数和CD34+细胞数分别增至(2470.5±79.96)×103、(53.96±4.29)×100%和(21.86±3.09)×100%;20μg/ml是液体培养诱导骨髓CD34+细胞向粒系分化的最佳浓度,可使细胞总数、CFU-GM和CD33+细胞分别增至(133.2±9.03)×103、(26.78±1.91)×100%和(16.98±1.73)×100%;甲基纤维素半固体培养检测显示,TSPG(10-50μg/ml)均能提高CD34+细胞形成CFU-GM的集落产率,以TSPG 20μg/ml效果最为明显.结论合适剂量的TSPG能够促进CD34+造血干/祖细胞体外扩增与定向诱导分化.     

基质细胞衍生因子-1和血小板第4因子对体外扩增后脐血CD34+细胞黏附特性和趋化功能的影响

为了研究基质细胞衍生因子-1（SDF—1）和血小板第4因子（PF4）对扩增后脐血CD34^＋细胞归巢相关功能的影响，将纯化的脐血CD34^＋细胞接种入无血清培养液中，加入不同组合的细胞因子FST（FL＋SCF＋TPO）、FST＋SDF—1、FST＋PF4或FST＋SDF—1＋PF4，分别于培养第7、10、14天检测CD34^＋细胞扩增倍数、集落形成能力、细胞的黏附分子表达、总黏附性、趋化功能。结果表明：①加入SDF—1的实验组CD34^＋细胞及造血祖细胞集落扩增倍数高于对照组；②加入SDF—1明显上调扩增的CD34^＋细胞CD49e的表达，加入PF4明显上调扩增的CD34^＋细胞CD49e、CD54的表达，在扩增体系中加入SDF—1或PF4均能够明显提高扩增的CD34^＋细胞的总黏附性；③在扩增体系中加入SDF—1能够明显提高扩增的CD34^＋细胞的自发迁移率，但导致CXCR-4的表达和SDF—1诱导迁移率降低；而PF4能够明显提高扩增的CD34^＋细胞的CXCR-4的表达和SDF—1诱导迁移率；在扩增体系中同时加入SDF—1和PF4能够明显提高扩增的CD34^＋细胞自发迁移率和SDF—1诱导迁移率。结论：体外扩增体系中加入SDF—1和PF4能够上调部分归巢相关黏附分子的表达，保持扩增的CD34^＋细胞的黏附和迁移能力，有利于降低体外扩增对造血干／祖细胞（HSPC）归巢相关功能的不利影响，维持扩增的HSPC的归巢潜能。     

Ex Vivo Bioactivity and HIV-1 Latency Reversal by Ingenol Dibenzoate and Panobinostat in Resting CD4+ T Cells from Aviremic Patients

The human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) latent reservoir in resting CD4⁺ T cells represents a major barrier to viral eradication. Small compounds capable of latency reversal have not demonstrated uniform responses across in vitro HIV-1 latency cell models. Characterizing compounds that demonstrate latency-reversing activity in resting CD4⁺ T cells from aviremic patients ex vivo will help inform pilot clinical trials aimed at HIV-1 eradication. We have optimized a rapid ex vivo assay using resting CD4⁺ T cells from aviremic HIV-1⁺ patients to evaluate both the bioactivity and latency-reversing potential of candidate latency-reversing agents (LRAs). Using this assay, we characterize the properties of two candidate compounds from promising LRA classes, ingenol 3,20-dibenzoate (a protein kinase C agonist) and panobinostat (a histone deacetylase inhibitor), in cells from HIV-1⁺ antiretroviral therapy (ART)-treated aviremic participants, including the effects on cellular activation and cytotoxicity. Ingenol induced viral release at levels similar to those of the positive control (CD3/28 receptor stimulation) in cells from a majority of participants and represents an exciting LRA candidate, as it combines a robust viral reactivation potential with a low toxicity profile. At concentrations that blocked histone deacetylation, panobinostat displayed a wide range of potency among participant samples and consistently induced significant levels of apoptosis. The protein kinase C agonist ingenol 3,20-dibenzoate demonstrated significant promise in a rapid ex vivo assay using resting CD4⁺ T cells from treated HIV-1-positive patients to measure latent HIV-1 reactivation.     

CD34+ Expansion With Delta-1 and HOXB4 Promotes Rapid Engraftment and Transfusion Independence in a Macaca nemestrina Cord Blood Transplant Model

Umbilical cord blood (CB) transplantation is a promising therapeutic approach but continues to be associated with delayed engraftment and infections. Here, we explored in our macaque CB transplant model expansion and engraftment kinetics of cells expanded with the combination of HOXB4 and Delta-1. CB cells were divided into two equal fractions; one fraction was transduced with HOXB4 yellow fluorescent protein (YFP) and expanded on control OP9 cells, and the other was transduced with HOXB4 green fluorescent protein (GFP) and expanded on Delta-expressing OP9 cells (OP9-DL1). Both fractions were transplanted into myeloablated subjects. Neutrophil and platelet recovery occurred within 7 and 19 days respectively, which was significantly earlier than in our previous study using cells expanded with HOXB4 alone, which resulted in neutrophil recovery within 12 days (P = 0.05) and platelet recovery within 37 days (P = 0.02). Furthermore, two of three animals in the current study remained fully transfusion-independent after transplantation. By day 30, reconstitution of lymphocytes was significantly greater with the HOXB4/OP9-DL1 expanded cells in all animals (P = 0.05). In conclusion, our data show that the combination of OP9-DL1 and HOXB4 can result in increased numbers of repopulating cells, thus leading to rapid engraftment and transfusion independence in macaques transplanted with autologous, expanded CB cells.     

慢性粒细胞性白血病患者骨髓源bcr/abl融合基因阳性Flk1+CD31-CD34-干细胞体外抗STI571机制的初步研究

为进一步了解STI571对慢性粒细胞性白血病（CML）患者体内bcr/abl融合基因阳性的原始及定向白血病干/祖细胞分化及增殖的影响,更深入阐明部分CML患者在经历一段血液学甚至是细胞遗传学水平上的完全缓解后复发及对STI571的耐药机制,利用从CML患者骨髓分离到的具有血管母细胞特性、bcr/abl融合基因阳性、免疫表型为Flk1＋CD31-CD34-细胞,体外检测了STI571对其在造血集落培养基中的分化及处于分化阶段时的增殖抑制作用.结果显示：浓度为5 μmol/L STI571,维持作用96小时（病人体内维持96小时的STI571浓度只可能达到1-2 μmol/L）,即可有效抑制定向造血祖细胞的增殖.没有充分的证据显示,相对原始的bcr/abl融合基因阳性、免疫表型为Flk1^＋CD31^-CD34^-细胞的分化及增殖受到明显的抑制作用.结论：CML患者体内的原始白血病干/祖细胞对STI571具有一定的抗性,临床上所观察到的CML患者在运用STI571一段时间后出现正常的造血恢复现象,可能仅仅是因为STI571杀死或抑制了定向恶性白血病祖细胞的增殖,但随着时间的推移,在经历了短暂的血液学甚至是细胞遗传学水平上的缓解后,对STI571耐药的原始白血病干/祖细胞终究会再次导致CML的复发.