类风湿关节炎患者外周血单个核细胞中环状RNA差异表达分析

目的:探讨环状RNA（circRNA）在RA PBMCs表达谱的差异及临床意义。方法:收集4例RA患者（T组）及4名健康体检者（C组）静脉血,运用Arraystar circRNA微阵列芯片检测2组PBMCs中circRNA表达谱,应用相关数据库进行生物信息学分析。采用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）验证表达失调c...     

类风湿关节炎患者外周血miR-203和MMP-3表达及其临床意义

目的探讨微小RNA203(miR-203)和基质金属蛋白酶3(MMP-3)在类风湿关节炎(RA)患者外周血中的表达及其临床意义。方法选取2016-11～2017-05在该院住院诊断为RA患者60例作为RA组,同期健康体检者30名作为健康对照组,QRT-PCR检测miR-203表达水平,ELISA法检测MMP-3表达水平。ROC曲线分析评价其对RA诊断灵敏度及特异度。结果 RA组miR-203和MMP-3表达均高于对照组,其在活动期升高更明显。相关性分析显示两者存在显著正相关关系(r=0. 700,P 0. 01); miR-203、MMP-3与类风湿因子(RF)、抗环瓜氨酸抗体(ACCP)、血沉(ESR)、C-反应蛋白(CRP)及28处关节疾病活动度评分(DAS28)存在正相关(r=0. 639、0. 474、0. 528、0. 518、0. 765、0. 816、0. 568、0. 520、0. 613、0. 594,P 0. 01)。ROC曲线分析表明血浆miR-203及MMP-3对RA具有较高的诊断灵敏度和特异度,联合检测能提高对RA的临床诊断能力。结论 miR-203及MMP-3在RA患者外周血中存在差异表达,并具有较强临床诊断能力,有望成为新的临床诊断指标。     

类风湿关节炎患者外周血单个核细胞蛋白质组学研究

目的 运用蛋白质组学的方法,比较正常人及早期活动性类风湿关节炎(RA)患者外周血单个核细胞(PBMCs)蛋白质的差异表达,寻找RA疾病相关致病蛋白质.方法 选取9例早期活动期RA患者以及9名健康成年志愿者,用淋巴细胞分离液分离PBMCs,抽提PBMCs中的蛋白,采用同相pH梯度(IPG)双向凝胶电泳(2-DE)分离正常人及RA患者PBMCs总蛋白质.凝胶经考马斯亮蓝染色显色后,PDQuest图像分析软件进行比较分析、识别差异表达的蛋白质,对差异蛋白质点用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)进行鉴定,运用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法验证部分差异蛋白质.结果 获得RA患者及正常人PBMCs蛋白质双向凝胶电泳图谱,平均蛋白质点数分别为556和579,匹配率分别为89.4%和 88.5%,通过比较分析,差异表达蛋白质点数为23,选取18个点进行质谱鉴定,成功鉴定14个蛋白质,其中a-肌动蛋白、纤维蛋白素原a-链、载脂蛋白A-I(ApoA-I)等9个蛋白质点在RA中表达上调,硫氧还蛋白-2、谷胱甘肽S-转移酶等6个蛋白质点在RA中表达下调,这些差异蛋白质的功能涉及物质代谢、抗氧化、信号传导、能量产生及细胞骨架.并用RT-PCR方法验证差异蛋白质ApoA-I.其结果与上述蛋白质差异表达结果相符.结论 在RA患者PBMCs中存在着差异表达蛋白质,这些差异蛋白质可能是RA发病的内在因素.其RT-PCR结果与蛋白质差异表达相符,证明蛋白质组研究的可靠性.     

重型肝炎患者外周血单个核细胞中微小RNA表达的分析

重型肝炎发病机制复杂,目前认为其发病与肠道菌群移位、机体受到内毒素血症的二次打击密切相关.微小RNA(miRNA)是一类非编码的小分子RNA,其源长度约为19～25个核苷酸.     

微小RNA-146a对类风湿关节炎患者滑膜成纤维细胞抑制作用的研究

目的 研究微小RNA-146a(miR-146a)对类风湿关节炎(RA)患者滑膜成纤维细胞增殖及细胞因子分泌的影响.方法 体外分离培养RA患者滑膜成纤维细胞,脂质体转染化学合成的miR-146a,~3H掺入法检测滑膜成纤维细胞增殖.酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测细胞上清白细胞介素(IL)-8及IL-6水平.实时定量聚合酶链反应(PCR)检测滑膜成纤维细胞中miR-146a靶分子肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)、IL-受体相关激酶(IRAKI)的mRNA水平.应用独立样本t检验进行统计学分析.结果 与阴性对照小RNA相比,miR-146a转染后的滑膜成纤维细胞增殖能力明显下降(2015±545与8799±1922,P<0.01),IL-8及IL-6分泌受到明显抑制[(153±49)pg/ml与(311±123)pg/ml,P<0.01和(295±95)pg/ml与(459±126)pg/ml,P<0.05].定量PCR检测IRAK1的mRNA水平显示,miR-146a转染可明显下调滑膜成纤维细胞IRAK1的表达(0.28±0.07与1,P<0.01).结论 miR-146a可能通过下调IRAKI表达,进而抑制滑膜成纤维细胞增殖及IL-8、IL-6等炎性细胞因子分泌,从而发挥抑制RA滑膜炎症的作用.     

类风湿关节炎患者外周血中B细胞凋亡的研究

目的 探讨类风湿关节炎(RA)患者外周血中B细胞的凋亡变化及临床意义.方法 流式细胞术检测81例RA患者(其中活动期51例,缓解期30例)及80名健康对照者外周血B细胞表达比例.免疫磁珠法分选出10例活动期RA患者、10例缓解期RA患者和10名健康对照者外周血中B细胞,进行体外培养;分别在24、48、72、96 h收集细胞,流式细胞术检测B细胞的凋亡率.采用单因素方差分析,t检验和Spearman相关分析进行统计分析.结果 以CD19、CD22为标记的B细胞在活动期、缓解期RA患者及健康对照者外周血中比例分别为:(26±11)％、(12±8)％、(10±6),(26±10)％、(12±8)％、(11±5)％;活动期RA患者外周血B细胞比例显著高于缓解期和健康对照组(P＜0.01).活动期RA患者外周血B细胞表达比例与疾病活动指数(DAS)28、血清IgG含量呈正相关(r=0.380,P=0.006;r=0.320,P=0.023),与其他临床参数无相关性.体外培养的活动期RA患者外周血B细胞凋亡率显著低于缓解期RA患者和健康对照组.结论 活动期RA外周血中B细胞凋亡途径受到抑制,可能导致其外周血B细胞比例显著增高,且B细胞增高比例与疾病活动度密切相关.     

MiR-155在类风湿关节炎滑膜成纤维细胞中的表达及功能研究

目的 检测miR-155在类风湿关节炎(RA)患者滑膜成纤维细胞(SFs)中的表达,探讨miR-155对RASFs细胞因子分泌、细胞增殖、侵袭能力的影响及其机制.方法 留取RA患者及骨关节炎(OA)患者各9份膝关节置换术后滑膜组织,分离培养滑膜成纤维细胞,取第3～5代细胞用于实验.①提取总RNA,利用实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)方法测定miR-155在RASFs和OASFs中固有性表达水平.②Lipo2000脂质体分别转染化学合成的miR-155类似物,miR-155抑制剂及无关序列小RNA对照.③转染48 h后通过酶联免疫吸附试验(E12SA)检测细胞上清基质金属蛋白酶(MMP)-3的分泌;通过3H掺入法检测细胞增殖;通过细胞侵袭试验(transwell)法检测细胞侵袭能力;通过RT-PCR法检测miR-155下游靶标IKBKE的mRNA表达水平.2组比较采用独立样本t检验,多组比较采用方差分析.结果 ①RA患者SFs中miR-155的表达明显高于OA组[分别为(1.79±1.94)和(0.11±0.17),P<0.05];②miR-155可抑制RASFs分泌MMP-3、细胞增殖和侵袭能力;③RASFs过表达miR-155后IKBKE的mRNA水平明显下调(P<0.05).结论 RASFs miR-155的表达上调,可能与滑膜局部的炎症环境相关;miR-155抑制RASFs增殖和降低侵袭能力可能是RASFs分泌MMP-3减少的原因之一,miR-155抑制RASFs分泌MMP-3可能与miR-1.55下调靶标IKBKE mRNA表达水平相关.     

陷阱因子3在类风湿关节炎患者血清及外周血单核细胞中的表达研究

目的 研究类风湿关节炎(RA)患者血清及外周血单核细胞中DcR3的表达情况.方法 选取已确诊的60例类风湿因子(RF)(+)的RA患者并按照DAS28评分将其分为RAa组和RAb组,以30名体检健康者作为对照,酶联免疫吸附试验( ELISA)法检测各组血清可溶性陷阱因子3(DcR3)的表达情况.同时荧光实时定量聚合酶链反应(PCR)检测各组外周血单核细胞中DcR3的表达情况.采用t检验和X2检验进行统计学分析.结果 DcR3血清表达水平在DAS28＞2.6的RAb组为(264+72) ng/ml较健康对照组为(48±39) ng/ml明显升高(r=0.251,P＜0.05).而在DAS28＜2.6的RAa组则没有差异.DcR3基因的扩增倍数在RAb组为23.5±5.4,健康对照组为8.3±3.6,差异具有统计学意义(r=0.336,P＜0.05).结论 DcR3在RA患者血清及外周血单核细胞中表达增高,而其血清表达水平在风湿活动较高的患者则更加明显.     

运用基因芯片初步研究类风湿关节炎患者外周血单个核细胞基因表达谱特征

目的运用基因芯片技术研究类风湿关节炎(RA)基因表达谱特征,从全基因组角度探讨RA相关致病基因。方法提取5例活动期RA患者和3名健康对照者外周血单个核细胞(PBMC)中总RNA,Illumina寡核苷酸基因芯片分析每个样本的48 000个基因变化。反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)验证芯片结果。结果RA患者与健康对照者相比2倍上调基因122个,2倍下调基因29个。分子及生物功能分析显示上调表达的基因涉及传递蛋白、蛋白翻译合成、代谢、转录调控、信号转导、趋化因子、细胞周期和凋亡相关基因等种类。结论RA涉及多环节的病理过程,基因芯片技术有利于进一步揭示RA分子机制,发现新的治疗靶标。     

类风湿关节炎外周血单个核细胞磷酸二酯酶活性的变化及与间质性肺疾病的关系

目的 观察类风湿关节炎(RA)外周血单个核细胞(PBMC)磷酸二酯酶(PDEs)活性的变化及与间质性肺疾病(ILD)的关系,探讨PDEs在RA及RA-ILD发病机制中的作用.方法 67例初治活动期RA患者分为RA-ILD组30例和单纯RA组37例,同时设健康对照组20名,高效液相色谱法测定PBMCs中环磷酸腺苷(cAMP) PDEs的活性变化,并与患者的临床、实验室及肺损伤指标进行相关性分析.采用单因素方差分析、Student-Newman-Keuls检验、t检验、Spearman相关分析进行统计学分析.结果 ①RA患者PBMC-cAMP-PDEs活性(51±11)高于对照组(34±8,P＜0.01),其中RA-ILD组PBMC-cAMP-PDEs活性(58±10)高于单纯RA组(46±7,P＜0.0l).②RA患者PBMC-cAMP-PDEs水平与晨僵时间、关节压痛数、关节肿胀数、X线分期、红细胞沉降率(ESR)、C反应蛋白(CRP)、类风湿因子(RF)以及28个关节疾病活动指数(DAS28)评分呈正相关(r值分别为0.432、0.441、0.527、0.430、0.466、0.616、0.662、0.519,P均＜0.01).③RA-ILD患者PBMC-cAMP-PDEs水平与ERS、CRP、RF、CT评分呈正相关(r值分别为0.466、0.616、0.662、0.488,P均＜0.01),与动脉血氧分压(PaO2)呈负相关(r=--0.563,P＜0.01),与肺活量(VC)及一氧化碳弥散吸收率(DLCO)无明显相关性(r值分别为0.118、-0.259,P＞0.05).结论 RA及RA-ILD患者免疫细胞内PDEs活性增高,并与RA疾病活动性及RA-ILD肺损伤严重程度有关,提示PDEs可能参与了RA及RA-ILD的发病过程.     

RA患者易感基因肽酰基精氨酸脱亚氨酶4mRNA的表达及其意义

目的检测酰基精氨酸脱亚氨酶4（PAD14）在类风湿关节炎（RA）患者外周血单个核细胞（PBMC）mRNA的表达，分析其与RA临床相关指标的相关性，探讨PAD14在RA发病机制中的作用。方法采用反转录聚合酶链反应（RT—PCR）实时荧光定量法对RA组（53例）、骨关节炎（OA）组（27例）及正常对照组（30名）PBMC中PAD14 mRNA表达进行检测，并分析其与抗环瓜氨酸（CCP）抗体、疾病活动关节评分28（DAS28）、患者病程的关系。结果RA组PAD14 mRNA表达明显高于OA组和正常对照组，差异有统计学意义（P〈0．05）；PAD14 mRNA的表达在OA组、正常对照组差异无统计学意义（P〉0．05）。RA组中PAD14 mRNA表达与抗CCP抗体和DAS28评分水平呈明显正相关（r=0．452．0．653，P均〈0．05），与病程呈负相关（r=-0．68，P〈0．05）。结论RA组PAD14 mRNA表达显著增高，并与DAS28评分和抗CCP抗体水平呈明显正相关，与病程呈负相关。提示RA患者PAD14 mRNA表达明显增高，与疾病活动程度和自身免疫功能异常相关。     

葡萄糖-6-磷酸异构酶mRNA在RA患者外周血单个核细胞中的表达及意义

目的探讨葡萄糖-6-磷酸异构酶（glucose-6-phosphate isomerase，GPI）mRNA在类风湿关节炎（RA）患者外周血单个核细胞（PBMCs）中的表达及其与RA疾病活动性的关系。方法对30例RA活动期患者、30例RA缓解期患者、30例其他风湿性疾病患者及30名健康体检者，采用反转录聚合酶链反应（RT—PCR）半定量检测PBMCs中GPImRNA的表达水平。结果RA活动期患者GPImRNA的表达水平明显高于RA缓解期患者、其他风湿性疾病患者及正常对照组（P〈0．05），在RA活动组和RA缓解组，差异亦有统计学意义（P〈0．05）。结论GPImRNA在部分RA患者中高表达，其可能在RA发病机制中起作用，并与疾病的活动性相关。     

白细胞介素-18在类风湿关节炎外周血单个核细胞中的表达

目的　探讨类风湿关节炎 (RA)外周血白细胞介素 18(IL 18)的表达及其与Th1/Th2平衡和疾病活动的关系。方法　以 β actin为内参照 ,用半定量反转录多聚酶链反应 (RT PCR)法测定 16例RA患者及 15名正常对照外周血单个核细胞 (PBMC)中IL 18、IL 4、IFN γmRNA水平 ,观察IL 18与IL 4、IFN γ及疾病活动指标红细胞沉降率 (ESR)、C反应蛋白 (CRP)的相关性。结果　①RA患者PBMC中IL 18mRNA表达与正常组相比增高非常显著 (1 82± 0 39比 0 45± 0 30 ,P <0 0 0 1)。②RA组IFN γ、IL 4均显著高于对照组 ,但IL 4/IFN γ显著低于对照组。③相关分析显示 :RA组IL 18mRNA与IFN γ、ESR显著正相关 (16例 ,r分别为 0 836 ,0 75 3,P均 <0 0 5 )。结论　RA患者外周血IL 18mRNA表达水平显著高于正常对照组 ,且与RA患者外周血IFN γ的产生及疾病活动性相关。     

来氟米特治疗类风湿关节炎血浆浓度与疗效关系的初步报告

目的 及C反应蛋白(CRP),并检查血尿常规、肝肾功能.结果 50 mg/d组,30 mg/d组3 d后的血药浓度分别为(19±14)、(18±15)μg/ml,两组间P＞0.05;20 mg/d组、10 mg/d组及10 mg隔日1次组1个月后血药浓度分别为(46±30)、(26±10)、(13±7)μg/ml,20 mg/d与10 mg/d两组比较、10 mg隔日1次组与20 mg/d及10 mg/d组比较差异均有统计学意义(P＜0.01).20 mg/d与10 mg/d组间RF改善率差异有统计学意义(P＜0.01).除了10 mg/d组晨僵改善不明显外,各组在治疗后RF、关节疼痛、压痛、肿胀、晨僵改善方面差异均有统计学意义(P＜0.01).由于观察时间较短,例数尚少,各组间不良反应差异不明显.结论 在一定范围内LEF血药浓度与剂量有关.50 mg/d与30 mg/d冲击治疗3 d,部分患者达到治疗RA的有效血浓度,缩短起效时间.为了持续维持有效治疗血药浓度,口服剂量至少10 mg/d,20 mg/d组RF改善率优于10 mg/d组.     

抗环瓜氨酸肽抗体阳性和阴性类风湿关节炎患者外周血单个核细胞基因表达谱差异的研究

目的 运用基因芯片技术研究抗环瓜氨酸肽(CCP)抗体阳性和阴性类风湿关节炎(RA)患者外周血单个核细胞(PBMC)基因表达谱差异,探索差异存在的基因表达基础.方法 提取各5例抗CCP抗体阳性、阴性RA患者、健康人PBMC中总RNA,运用Ⅲumina基因表达谱芯片分析每个样本47231个基因变化.结果 与健康对照组相比,抗CCP抗体阳性和阴性RA患者有88个差异表达基因,其中上调表达基因51个,下调表达基因37个,这些差异表达基因主要涉及细胞因子、细胞凋亡、细胞周期、细胞因子、信号转导、趋化因子等.抗CCP抗体阳性和阴性RA患者之间有20个基因表达差异有统计学意义,其中上调表达基因9个,下调表达基因11个,这些差异表达基因主要涉及传递蛋白、转录调控、信号转导、代谢、细胞周期等.结论 抗CCP抗体阳性和阴性RA患者之间存在差异表达基因,筛选到的差异基因如杀伤细胞免疫球蛋白受体基因、干扰素诱导基因、几丁质酶家族成员CHI3L1等为进一步研究RA发病机制及发现新治疗靶标提供重要线索.     

类风湿关节炎患者外周血及滑液NKp44+自然杀伤细胞的表达和临床意义探讨

目的 探讨类风湿关节炎(RA)患者外周血及滑液NKp44+自然杀伤细胞的临床意义.方法 采用流式细胞术检测20例活动期RA患者[疾病活动指数(DAS)28≥2.6]、15例缓解期RA患者(DAS28＜2.6)及20名健康对照者外周血NKp44+自然杀伤细胞比例及10例活动期RA患者滑液NKp44+自然杀伤细胞比例.多重非参数检验比较3组间NKp44+自然杀伤细胞比例差异.采用Spearmar相关分析NKp44+自然杀伤细胞与临床指标[DAS28评分、抗环瓜氨酸肽(CCP)抗体、类风湿因子(RF)]的相关性.结果 ①活动期、缓解期RA患者及健康对照者外周血NKp44+自然杀伤细胞比例分别为(1.480±4.750)%、(0.540±0.590)%、(0.000±0.000)%,活动期RA患者外周血NKp44+细胞比例明显高于缓解期和健康对照(x2=46.708,P=0.000).②10例活动期RA患者滑液NKp44+自然杀伤细胞比例为(15.6±11.7)%,明显高于其外周血NKp44+自然杀伤细胞比例(3.6±2.5)%(z=-3.780,P=0.000).③活动期RA患者外周血NKp44+自然杀伤细胞比例与DAS28评分、抗CCP抗体呈正相关(r=0.777,P=0.000;r=0.967,P=0.000),与RF无相关性(r=-0.343,P=0.138).滑液NKp44+自然杀伤细胞比例与DAS28评分、抗CCP抗体呈正相关(r=0.930,P=0.000;r=0.867,P=0.001),与RF无相关性(r=0.564,P=0.09).结论 NKp44+自然杀伤细胞在RA患者外周血及滑液中明显增高,且与DAS28评分、抗CCP抗体呈正相关,提示NKp44+自然杀伤细胞与疾病活动度和病情严重程度相关.

Abstract：

Objective To investigate the clinical significance of NKp44+NK cells in the peripheral blood and synovial fluid of rheumatoid arthritis (RA) patients.Methods The proportions of NKp44+NK cells in the PB of 20 active and 15 remission patients with RA and 20 healthy individuals were detected using flow cytometry.The proportions of NKp44+NK cells in the SF of 10 active patients were detected.Multiple nonparametric test was used to compared the difference of NKp44+NK cells proportions.Clinical data including DAS28,anti-CCP antibody and RF were collected.The relationship between NKp44+NK cells and clinical data was analyzed by Spearman correlation analysis.Results The proportions of NKp44+NK cells in PB of active and remission patients and healthy individuals were (1.480±4.750)%,(0.540±0.590)%,(0.000±0.000)%respectively.The proportion of NKp44+NK cells in PB of active patients was significantly higher than that of remission patients and healthy individuals (x2=46.708,P=0.000).The proportion of NKp44+NK cells in the SF of ten active RA patients was significantly higher than matched PB.There was positive correlation between NKp44+NK cells proportion in PB and SF of active patients and DAS 28 and anti-CCP antibody level.There was no correlation between NKp44+NK cells proportion in PB,SF and RF.Conclusion There is a marked increase in the proportion of NKp44+NK cells in PB and SF of RA patients.Moreover,NKp44+NK cells are positively correlated with DAS28 and anti-CCP antibody,suggesting that NKp44+NK cells may be correlated with disease activity and severity.