腺相关病毒介导的血管内皮生长因子基因与骨髓间充质干细胞联合治疗大鼠肢体缺血的研究

目的 探讨腺相关病毒(rAAV)介导的人血管内皮生长因子(VEGF)165基因转染大鼠骨髓间充质干细胞(MSC)移植对血管新生的影响.比较单纯干细胞移植与联合基因治疗的疗效.方法 全骨髓培养法提取培养MSC;rAAV-VEGF165转染MSC中,酶联免疫吸附试验(ELISA)及反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测VEGF的表达;以近交系大鼠建立骨骼肌缺血模型,40只大鼠随机分为4组,每组10只.对照组注射磷酸盐缓冲液(PBS);干细胞组移植等量MSC,转染术后7 d组和转染术后10 d组分别于结扎7 d和10 d后的缺血区移植转染VEGF基因的MSC,移植6周后做Ⅷ因子染色检测血管新生情况.结果成功培养出MSC,免疫组化CD44阳性表达,CD34阴性表达;流式细胞术CD90阳性表达.在转染rAAV-VEGF165后转染组1、3、5、7、9 d上清液中VEGF165分泌水平分别为(131.98±6.00)、(263.96±4.58)、(540.85±5.97)、(208.98±5.06)、(174.45±5.00)ng/L,明显高于未转染组的(68.72±1.99)、(76.47±4.98)、(89.86±1.99)、(84.93±8.97)、(68.71±5.98)ng/L[t值分别为14.14、51.16、79.28、27.56、26.07,(均P＜0.05)],且5 d时达到高峰,此后表达开始下降.琼脂糖凝胶电泳可见在579 bp处见到高亮度条带,证明rAAV-VEGF165成功转染进MSC细胞中.转染后的生长曲线及细胞形态较未转染组无明显变化.Ⅷ因子染色示转染术后10 d组动物缺血区毛细血管密度[(9.35±2.72)条/视野]明显高于对照组[(1.05±0.50)条/视野]和干细胞组[(3.10±1.43)条/视野](均P＜0.01),较转染术后7 d组[(6.95±1.69)条/视野]亦有一定程度的升高(P＜0.05).结论 MSC有利于VEGF基因的稳定表达,可作为VEGF基因的良好细胞载体,且联合应用效果高于单独移植MSC,移植最佳时间为术后10 d.     

重组腺相关病毒介导人血管内皮生长因子165基因在大鼠骨髓间充质干细胞中的表达

目的探讨以腺相关病毒(rAAV)为血管内皮细胞生长因子165基因(VEGIF165)载体,在体外转染大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs),并研究其相关特性。方法 (1)全骨髓培养法提取培养MSCs,利用免疫组化法检测MSCs表面标志CD34、CD44;流式细胞分析法检测CD90。(2)rAAV-VEGF165转染MSCs,采用ELISA及PCR检测VEGF的表达,比较转染前后细胞的变化情况,观察VEGF165基因转染对MSCs的影响。结果 (1)成功培养出MSCs,CD44阳性表达,CD34阴性表达,CD90阳性表达。(2)在转染rAAV-VEGF165后转染组上清中VFGF165分泌水平明显高于未转染组(p<0.05),5 d时达到高峰,此后表达开始下降。琼脂糖凝胶电泳可见高亮度条带。表明rAAv-VEGF165成功转染进MSCs细胞中,绘制生长曲线,显示rAAV-VEGF165基因转染后对MSC生长无影响。结论rAAV-VEGF表达载体可有效感染MSCs,并在体外高效表达,为MSCs联合基因治疗提供了实验依据。     

人舌癌移植瘤模型中血管内皮细胞来源的实验研究

目的 观察人舌癌裸鼠皮下移植瘤模型中肿瘤新生血管内皮细胞的来源.方法 通过皮下移植人舌癌Tca8113-Ml细胞建立人舌癌裸鼠移植肿瘤模型,并于肿瘤生长至直径1cm时切除肿瘤,对移植瘤进行病理组织学观察,利用免疫组织化学方法检测移植瘤内新生血管内皮细胞的来源,抗体为鼠抗人单克隆抗体CD34和大鼠抗小鼠单克隆抗体CD34;并进行微血管密度(microvessel density,MVD)计数及血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表达检测.结果 右腋窝皮下接种人舌癌Tca8113-Ml细胞2周后,6只裸鼠的肿瘤直径都达到1 cm 以上,切片HE染色可见肿瘤组织病理形态为鳞状上皮细胞癌,MVD平均值为10.72±2.12,其中肿瘤新生血管内皮细胞大鼠抗小鼠CD34免疫组化结果是阳性,而鼠抗人CD34阴性.VEGF在6例移植瘤标本中均阳性表达, 平均阳性率为(67±5.6)%.结论 人舌癌移植瘤模型中血管内皮细胞主要来源于宿主裸鼠,并且可能与肿瘤细胞分泌的VFGE诱导有关.     

血管内皮生长因子基因转染内皮祖细胞移植于大鼠缺血心肌的研究

目的:将编码有血管内皮生长因子基因的腺病毒(Ad.VEGF)转染诱导培养的骨髓内皮祖细胞(EPCs),移植于大鼠缺血心肌,评价其对心功能的保护和促血管再生作用。方法:Ficoll离心分离大鼠骨髓单个核细胞,诱导培养EPCs;在50倍的转染倍数(病毒数/靶细胞)下,用Ad.VEGF转染诱导的EPCs。然后将其移植于结扎冠状动脉前降支的Lewis大鼠缺血心肌内(组Ⅰ),同时设置单纯细胞移植组(组Ⅱ)和基因治疗组(组Ⅲ),以注射磷酸盐缓冲液的大鼠为对照组(组Ⅳ)。术后4周通过血流动力学指标评价其对心功能的保护作用;另外通过免疫组化染色观察移植细胞存活、分化和血管再生情况。结果:骨髓EPCs移植于缺血心肌4周后,缺血区的移植细胞部分分化为血管内皮细胞,组Ⅰ心功能明显好于组Ⅱ、组Ⅲ和组Ⅳ(P<0.01),在促血管新生方面,组Ⅰ也明显优于以上3组[组Ⅰ(32.2±3.5)、组Ⅱ(17.6±2.7)、组Ⅲ(19.4±3.3)、组Ⅳ(5.9±1.2)个/高倍视野]。结论:转染Ad.VEGF后的EPCs移植于缺血心肌后,可促进缺血心肌再血管化,更好地保护和改善心脏功能。     

氯沙坦对残肾大鼠肾小球毛细血管内皮细胞的保护作用

目的探讨血管紧张素受体拮抗剂氯沙坦对残肾大鼠肾小球毛细血管内皮细胞的保护作用及可能机制。方法 32只SD大鼠分成3组:氯沙坦组[n=12,氯沙坦25mg/(kg·d)灌胃];残肾模型组(n=12,等量生理盐水灌胃);假手术组(n=8,等量生理盐水灌胃)。药物干预15周后,收集24h尿量。取肾组织,用于组织病理、CD31和小鼠抗大鼠内皮细胞抗原1(RECA-1)免疫组化染色,比较3组大鼠肾小球纤维化程度和毛细血管内皮细胞密度;并取肾组织检测血管内皮生长因子(VEGF)和血小板反应蛋白(TSP-1)基因和蛋白表达水平。结果与残肾模型组相比,氯沙坦组血肌酐[(73.4±6.1)比(103.3±11.5)μmol/L]、血脂水平及24h尿蛋白定量[(14.0±1.2)比(92.7±14.1)mg]明显下降(均P<0.05)。肾组织免疫组化显示,残肾模型组肾小球毛细血管内皮细胞密度明显低于假手术组(P<0.05),氯沙坦明显增加了残肾大鼠肾小球毛细血管内皮细胞密度(P<0.05)。氯沙坦明显增加了残肾大鼠肾皮质VEGF的表达,降低了TSP-1的表达(P<0.01)。结论氯沙坦减轻了残肾大鼠肾小球毛细血管内皮细胞的损伤、改善了肾功能,其机制可能与其调节VEGF与TSP-1的表达有关。     

内皮祖细胞移植治疗大鼠急性心肌梗死的实验研究

目的探讨大鼠内皮祖细胞(EPCs)移植于梗死心肌的增殖分化情况及对心功能的影响。方法分离培养大鼠EPCs,免疫荧光法检测其CD34+、CD133+和Flk-1+的表达。将SD大鼠冠状动脉左前降支结扎制造急性心肌梗死模型后,在梗死心肌处植入DAPI标记的EPCs(实验组)或M 199培养液(对照组)。移植后1周及4周,心脏超声检查心功能,并对梗死区心肌组织进行移植细胞形态学检查及毛细血管密度测定,逆转录聚合酶链反应及酶联免疫吸附测定梗死周边区血管内皮生长因子(VEGF)的表达。结果培养获得EPCs,其表型为CD34+、CD133+和Flk-1+。植入梗死区的EPCs可以分化为血管内皮细胞,实验组梗死心肌处血管密度较对照组明显增高(P<0.01),并且VEGF基因及蛋白表达在移植后1周均较对照组明显增高(P<0.01)。移植后4周,实验组大鼠左心室射血分数及左心室短轴缩短率较对照组明显提高(P<0.01);而移植后1周,两组大鼠超声检测心功能各指标变化不明显。结论同种异体EPCs移植到梗死心肌大鼠缺血心肌能分化为毛细血管内皮细胞,促进梗死后心肌血管新生,改善心功能。     

血管内皮生长因子基因转染对肝细胞移植的影响

目的探讨VEGF基因转染对移植后血管组织形成的作用及对移植细胞增殖的影响.方法SD大鼠pcDNA3VEGF121转染肝细胞移植10d后取样,行微血管密度(MVD)计数及增殖细胞核抗原(PCNA)染色.结果在体外VEGF转染肝细胞能产生足够的转基因蛋白诱导内皮细胞的增殖.而体内可形成大量移植细胞克隆及再生肝组织.各组MVD计数差异并无显著性,P>005;在VEGF基因转染组PCNA指数较pcDNA3对照组与非转染组显著升高,为13.13±275、475±1.58和4.63±1.41,P<0.01.提示在体内移植血管组织形成存在多重因素的影响.而VEGF基因表达可促进移植细胞增殖和再生肝组织形成.结论VEGF间接体内基因转染是诱导移植肝再生一有效方法.     

血管内皮生长因子基因转染骨髓间充质干细胞移植促进缺血心肌血管生成的研究

目的研究血管内皮生长因子(vascularendothelial growth factor,VEGF)基因转染骨髓间充质干细胞(mesenchymalstem cells,MSCs)移植对缺血心肌的血管生成作用。方法于2004年5月至2005年8月取第四军医大学西京医院分离、培养Wistar大鼠的MSCs,用真核表达载体pcDNA3.1(-)/hVEGF165转染MSCs。45只近交系Wistar大鼠随机均分为转染组(MSCs/VEGF组)、对照组(MSCs组)、无血清培养基组(DMEM组),结扎前降支建立急性心肌梗死模型后在梗死区边缘区行5×106细胞移植,DMEM组行等量培养基注射。细胞移植前行CM-DiI标记。移植1个月后行心脏B超测量射血分数值,组织化学染色评价新生血管密度。结果培养的MSCs呈典型贴壁生长成纤维样外观,pcDNA3.1(-)/hVEGF165能有效转染大鼠MSCs,移植1个月后MSCs/VEGF组较其余各组左室射血分数(LVEF),再生血管密度明显增加,差异均有显著性(P<0.01)。结论VEGF基因转染MSCs移植能显著促进缺血心肌血管再生,进而改善心脏功能。     

基质血管碎片凝胶对移植脂肪组织存活率的影响

目的探讨基质血管碎片凝胶(SVF-GEL)对移植脂肪组织存活率的影响。方法制备SVF-GEL和脂肪颗粒。大鼠分组及处理:将96只大鼠根据随机数字法分为SVF-GEL组和对照组,每组48只,SVF-GEL组大鼠移植0.3 ml脂肪颗粒和0.1 ml SVF-GEL;对照组大鼠移植0.3 ml脂肪颗粒和0.1 ml生理盐水。术后2 w,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定移植脂肪组织血管内皮生长因子(VEGF)水平,采用CD34免疫组化染色观察移植脂肪组织血管数量,采用Perilipin A免疫荧光法测定移植脂肪细胞存活率和小脂肪细胞数量。术后12 w,采用苏木素-伊红(HE)染色观察移植脂肪组织存活情况,计算移植脂肪组织长期存活率。结果术后2 w时,SVF-GEL组移植脂肪组织中VEGF水平和血管数量明显高于对照组(P0.05),SVF-GEL组移植脂肪组织中脂肪细胞存活率和小脂肪细胞数量明显高于对照组(P0.05)。术后12 w,HE染色显示:SVF-GEL组炎症细胞较少,脂肪细胞大小均匀,囊泡少,纤维间隔少;对照组可见较多炎症细胞,脂肪细胞大小不等,囊泡和纤维间隔较多。SVF-GEL组炎症评分、纤维化评分和囊泡评分均明显低于对照组(P0.05);SVF-GEL组移植脂肪组织长期存活率明显高于对照组(P0.05)。结论 SVF-GEL可促进移植脂肪组织血管生成和脂肪细胞存活,提高移植脂肪组织长期存活率。     

细胞表面磷酸化糖蛋白表达对小鼠肿瘤血管生长的影响

目的 探讨细胞表面磷酸化糖蛋白（CD34）表达对肿瘤血管生长的影响。方法 将40只小鼠分为四组,均建立小鼠肿瘤模型。其中空白对照组、实验对照组不用血管抑素（AS）,高剂量实验组、低剂量实验组术后均用AS。用免疫组化法测定CD34表达,了解肿瘤血管生长情况。结果 CD34染色显示,四组肿瘤间质血管均着色。对照组肿瘤间质微血管密度（MVD）极高,肿瘤细胞均沿间质血管排列。高剂量及低剂量实验组MVD极低,且内皮细胞形态不完整,与对照组比较有显著差异（P〈0．01）。结论 CD34可表达肿瘤MVD,AS可限制肿瘤血管生长。     

Effects of Estrogen Level on the Function of Vascular Endothelial Cells and Expression of Vascular Cell Adhesion Molecule-1(?)

Objectives To ob-serve the effect of different estrogen levels on the secretory function of vascular endothelial cells of female rats, and study the effect of modulation of estrogen level on the expression of vascular cell adhesion molecule - 1 and the concentration of estrogen receptor in vascular endothelial cells. Methods Radioim-munology was used to measure the serum concentration of endothelin and PGI2, and copper - cadmium reduction was employed to measure the serum content of nitrogen monoxide. Radioligand binding and flowcy-tometry were used to measure the expression of estrogen receptor and vascular cell adhesion molecule (VCAM - 1) of vascular endothelial cells respectively. Results 1. The serum concentration of nitric oxide and PGI2 decreased when the ovaries of female rats were removed. In ovariectomized rats, given estrogen, the concentration rose ( P < 0. 05), but the plasma concentration of endothelin was adverse to it. 2. The concentration of estrogen receptor of vascular endothelial cel     

缺氧条件下血管活性因子对血管内皮细胞中血管内皮生长因子表达的影响

目的　探讨在缺氧条件下人脐静脉血管内皮细胞血管内皮生长因子 (VEGF)表达及缩血管活性物质内皮素 ,舒血管活性物质NO和NO抑制剂LNNA对VEGF基因表达的影响。方法　体外培养人脐静脉血管内皮细胞 ,经缺氧及血管活性物质处理 ,Northern杂交、酶联免疫检测和计算机图像分析等观察VEGFmRNA和蛋白表达水平。结果　缺氧 6h内皮细胞可见VEGF表达。ET可促进VEGFmRNA的表达 ,NO可明显抑制VEGFmRNA的表达 ,NO抑制剂LNNA也影响VEGFmRNA的表达。ELISA检测VEGF蛋白水平分别为 6h组 (8 2± 1 1) μg/L ,ET +6h组 (9 37± 1 0 2 ) μg/L ,NO +6h组 (2 86± 0 91) μg/L ,LNNA +6h组 (14 75± 1 87)μg/L。 结论　缺氧可诱导人脐静脉血管内皮细胞分泌VEGF并受血管活性物质的调控 ,ET促进其表达 ,NO抑制其表达。     

颌面部血管瘤VEGF及其受体的表达及意义

为探讨血管内皮生长因子（VEGF）及其受体（VEGFR／KDR）在颌面部血管瘤发生、发展中的作用，采用二步En Vision免疫组织化学方法，分别检测11例血管瘤（HA）和8例血管畸形（VM）组织中VEGF和VEGFR／KDR的表达；同时采用原位杂交Gene Point法检测VEGF mRNA的表达。结果显示，VEGF和VEGFR／KDR在HA中高表达，而在VM中低表达，两者差异有显著性（P＜0.01）；VEGF和VEGF mRNA在血管瘤细胞及周围间质细胞明显表达，VEGF／KDR主要表达于HA中内皮细胞膜上。提示VEGF可通过自分泌和旁分泌的形式影响HA内皮细胞的增殖，可能与HA发生、发展和退化密切相关。     

VEGF-A及其受体在多种恶性血液病中的研究进展

血管内皮生长因子A(VEGF-A)是一种具有血管通透性的糖蛋白,属血管内皮生长因子家族中的一员,通过与靶器官相应的受体结合发生二聚体化和自身磷酸化发挥作用。VEGF-A可协同其它细胞因子促使内皮细胞的生长、增殖、迁移,导致大量新生血管的形成,为白血病细胞对淋巴网状组织的侵袭提供了充足的养分,不仅起到抑制树突细胞成熟的作用,还可以触发破骨溶骨活动及诱发破骨细胞的趋化现象,使内皮细胞和残留的基质细胞产生趋化作用。因此,在各种恶性血液病中,VEGF-A及其受体表达的高低与疾病的发生、发展、预后有着密切的联系。本文就VEGF-A及其受体与各种血液系统恶性肿瘤的相关研究进展作一综述。     

高频超声检测脑梗死与短暂性脑缺血发作患者血管内皮功能的探讨

目的:研究脑梗死、短暂性脑缺血发作(TIA)患者颈动脉内-中膜厚度、血管弹性与肱动脉血管内皮功能.方法:研究对象分为3组:脑梗死患者、TIA患者、正常同龄人,每组各30例.用高频超声测量颈动脉内-中膜厚度、收缩期颈动脉内径(DS)、舒张期颈动脉内径(DD),计算颈总动脉壁弹性的相关参数:可扩张度(DC)、顺应性(CC)...     

Elevation of vascular endothelial growth factor production and its effect on revascularization and function of graft islets in diabetic rats

AIM: To determine whether the elevated vascular endothelial growth factor (VEGF) expression produced by the transfected vascular endothelial cells (VECs) could stimulate angiogenesis of the graft islets and exert its effect on the graft function. METHODS: Thirty diabetic recipient rats were divided into three groups (n=10 per group). In the control group, 300 IEQ islets were transplanted in each rat under the capsule of the right kidney, which were considered as marginal grafts. In the VEC group, VEC together with the islets were transplanted in each rat. In the VEGF group, VEC transfected by pIRES2-EGFP/VEGF165 plasmid and the islets were transplanted in each rat. Blood glucose and insulin levels were evaluated every other day after operation. Intravenous glucose tolerance test (IVGTT) was performed 10 d after the transplantation. Hematoxylin and eosin (HE) staining was used to evaluate the histological features of the graft islets. Immunohistochemical staining was used to detect insulin-6, VEGF and CD34 (MVD) expression in the graft islets. RESULTS: Blood glucose and insulin levels in the VEGF group restored to normal 3 d after transplantation. In contrast, diabetic rats receiving the same islets with or without normal VECs displayed moderate hyperglycemia and insulin, without a significant difference between these two groups. IVGTT showed that both the amplitude of blood glucose induction and the kinetics of blood glucose in the VEGF group restored to normal after transplantation. H&E and immunohistochemical staining showed the presence of a large amount of graft islets under the capsule of the kidney, which were positively stained with insulin-6 and VEGF antibodies in the VEGF group. In the cell masses, CD34-stained VECs were observed. The similar masses were also seen in the other two groups, but with a fewer positive cells stained with insulin-6 and CD34 antibodies. No VEGF-positive cells appeared in these groups. Microvessel density (MVD) was significantly higher in the VEGF group compared to the other two groups. CONCLUSION: Elevated VEGF production by transfected vascular endothelial cells in the site of islet transplantation stimulates angiogenesis of the islet grafts. The accelerated islet revascularization in early stage could improve the outcome of islet transplantation, and enhance the graft survival.     

Overexpression of vascular endothelial growth factor in restenoticabdominal aorta of rabbits

INTRODUCTIONVascularendothelialgrowthfactor（VEGF），alsoknownasvascularpermeabilityfactor（VPF）orvasculotropin（VAS），isa３４to４６kDahep－arin－bindingsecretedgrowthfactorthatisangiogenicinvitroandinvivo，andhasauniquetargetcellspecificityforvasculare     

VEGF/VEGFR2信号转导通路在抗肿瘤血管生成中的作用

以肿瘤血管内皮细胞为靶点抑制肿瘤血管生成从而阻断肿瘤血液供应已成为当前抗肿瘤生长和转移的研究热点.其中,VEGF/VEGFR2信号转导通路在肿瘤周围血管生成起主要作用.阻断该信号通路,能够抑制实体瘤的生长和转移.本文就VEGF/VEGFR2信号通路在抗肿瘤生长和转移中的研究进展作一概述.     

血管内皮生长因子抑制同型半胱氨酸所致血管内皮细胞生长停滞的研究

目的:研究血管内皮生长因子(VEGF)对同型半胱氨酸所致血管内皮细胞生长停滞的作用及其分子机制。方法:用[3H]-胸腺嘧啶脱氧核苷掺入法测定细胞DNA合成率,基因表达测定采用RT-PCR。结果:①同型半胱氨酸诱导血管内皮细胞生长停滞、CHOP基因表达升高。VEGF能显著地抑制同型半胱氨酸诱导血管内皮细胞生长停滞,但不影响CHOP表达;②VEGF诱导核糖体蛋白RPS3a表达升高;③瞬时转染RPS3a基因抑制诱导血管内皮细胞生长停滞;④PI3K抑制剂wortmannin显著拮抗VEGF的作用,MEK抑制剂PD98059没有影响。结论:VEGF可通过PI3K信号途径上调RPS3a表达,抑制同型半胱氨酸诱导血管内皮细胞生长停滞,提示VEGF是一个潜在的抑制同型半胱氨酸所致动脉粥样硬化的药物。