大黄素促进人混合培养淋巴细胞凋亡的实验研究

目的:探讨大黄素是否可通过影响淋巴细胞内活性氧的产生,促进淋巴细胞的凋亡来发挥其免疫抑制作用.方法:分别提取健康成年人外周静脉血中淋巴细胞,建立混合淋巴细胞培养(MLC)模型,给予不同浓度的大黄素,并进行不同时间点干预,利用流式细胞技术检测淋巴细胞内活性氧的产生水平及淋巴细胞凋亡情况,并给予还原性谷胱甘肽清除细胞内活性氧,流式细胞技术再次观察细胞内活性氧水平及淋巴细胞凋亡情况.结果:在高、中、低浓度组,大黄素与混合培养淋巴细胞共培养24h、48h、72h后,淋巴细胞内活性氧产生水平增高,在1μmol/ml-100μmol/ml的浓度范围内,不同浓度大黄素组淋巴细胞凋亡率与对照组相比均有不同程度的升高(P<0.05),并呈现浓度和时间依赖性.结论:大黄素可能通过提高淋巴细胞内活性氧产生水平,进而促进淋巴细胞凋亡来发挥其免疫抑制作用.     

线粒体途径在大黄素促人混合培养淋巴细胞凋亡中的作用

目的:探讨大黄素促进人混合培养淋巴细胞凋亡的作用机制,为进一步研究大黄素的免疫抑制作用奠定实验基础。方法:建立混合淋巴细胞培养模型,给予不同浓度大黄素（1μmol/L、10μmol/L、100μmol/L）培养24、48、72h后检测各组淋巴细胞凋亡、细胞内活性氧及线粒体膜电位情况。Western blot法检测共培养48h后淋巴细胞中细胞色素C、caspase-3、caspase-9、Bcl-2/Bax蛋白表达变化。给予还原性谷胱甘肽（GSH）清除细胞内活性氧后,检测其对线粒体膜电位及淋巴细胞凋亡的影响。结果:随着培养时间和药物浓度的增加,大黄素对淋巴细胞增殖抑制和促凋亡作用逐渐增强,呈现浓度和时间依赖性。高浓度大黄素提高细胞内活性氧、降低线粒体膜电位水平,激活线粒体凋亡通路。使用还原性谷胱甘肽清除细胞内活性氧后,能够降低线粒体膜电位和淋巴细胞凋亡率。结论:线粒体信号途径的激活在大黄素促淋巴细胞凋亡中发挥重要作用。     

大黄素诱导胆管癌QBC939细胞凋亡的实验研究

 目的 探讨大黄素在体外诱导人胆管癌QBC939细胞凋亡的作用及机制。方法 采用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)法检测大黄素对细胞增殖的抑制作用;在荧光显微镜下观察凋亡细胞的形态学变化;运用流式细胞技术检测细胞凋亡率和细胞内活性氧水平;通过比色法测定细胞内caspase-9及caspase-3的相对活性。结果 大黄素以时间-剂量的方式抑制胆管癌QBC939细胞的增殖;在荧光显微镜下,凋亡的细胞呈现亮色,或核呈分叶、碎片状,细胞皱缩;QBC939细胞在30 µmol/L和50 µmol/L浓度的大黄素作用下,24 h的凋亡率分别为38.9%±9.07%及67.09%±4.08%（P<0.05）,30 min后细胞内活性氧的水平分别为对照组的1.65±0.08及2.28±0.04倍（P<0.05）;大黄素可激活caspase-9及caspase-3,导致其活性升高（P<0.05）。结论 大黄素能通过诱导凋亡来抑制胆管癌QBC939细胞的增殖,其机制与细胞的活性氧水平升高及caspase-9及caspase-3活化有关。     

白藜芦醇诱导MDA-MB-231细胞凋亡及其对活性氧和Caspase-3的影响

目的探讨白藜芦醇对MDA-MB-231细胞的凋亡诱导效应和对细胞内活性氧水平(reactive oxygen species,ROS)及Caspase-3的影响。方法用不同浓度的白藜芦醇诱导培养MDA-MB-231细胞24h后,采用流式细胞术(FCM)和DNA琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡,FCM测定细胞内活性氧(ROS)水平,免疫组织化学法检测Caspase-3蛋白的变化。结果白藜芦醇能诱导MDA-MB-231细胞凋亡,DNA电泳可见梯状条带出现,并呈现典型的凋亡改变,60μmol/L白藜芦醇作用MDA-MB-231细胞4、12和24h后细胞ROS生成量分别为:50.0±5.7、115.0±10.6、79.2±6.9;Caspase-3蛋白活性逐渐增加。结论白藜芦醇诱导MDA-MB-231细胞凋亡与细胞ROS水平升高和Caspase-3活化有关,可能是白藜芦醇诱导MDA-MB-231细胞凋亡机制之一。     

大黄素对人慢性髓细胞性白血病K562细胞增殖与凋亡及c-myc基因表达的影响

目的:观察中药大黄素对人慢性髓细胞性白血病K562细胞株的增殖与凋亡及c-myc基因表达的影响.方法:采用MTT法测定细胞的增殖抑制率,实验组、对照组和药物试验组应用荧光染色法观察不同浓度大黄素作用后细胞形态的改变判定凋亡效果,DNA琼脂糖凝胶电泳检测细胞内DNA的损伤程度,流式细胞仪分析细胞周期变化,RT-PCR法检测大黄素作用前后c-myc mRNA表达水平的变化.结果:大黄素对K562细胞具有明显的抑制作用,并呈浓度和时间依赖性(P＜0.01),其96 h半数抑制浓度(IC50)约为53.28 μmol/L.大黄素作用96 h后,荧光显微镜下可见细胞核不规则,核碎裂呈新月形改变,DNA琼脂糖凝胶电泳显示,基因组DNA显现典型的凋亡细胞的梯状图谱.流式细胞仪检测可见大黄素影响细胞周期,细胞阻滞于G0/G1期.RT-PCR法检测显示c-myc基因表达减弱(P＜0.01),100 μmol/L大黄素作用后表达强度较对照组减少54%.结论:大黄素能有效抑制K562细胞增殖并诱导其凋亡,其作用机制可能是使细胞受阻于G0/G1期而进入凋亡程序,c-myc表达降低可能是大黄素诱导白血病细胞凋亡重要途径之一.     

多烯紫杉醇诱导SPC-A1肺癌细胞凋亡与活性氧之间的关系

目的：探索多烯紫杉醇诱导SPC-A1肺癌细胞凋亡与细胞内活性氧之间的关系。方法：用含有10^-8mol／L多烯紫杉醇作用于体外培养的SPC-A1肺癌细胞24小时后，使用电子显微镜和荧光显微镜检测凋亡细胞形态；以2’，7’-二氯荧光素二乙酸盐和二氢乙啶对上述处理的细胞进行双染后，利用流式细胞仪测定细胞内活性氧水平和细胞周期。结果：10^-8mol／L多烯紫杉醇作用于SPC-A1肺癌细胞24小时后，在电子显微镜和荧光显微镜下出现了典型的凋亡细胞形态。流式细胞仪检测结果提示，细胞内活性氧水平较对照组增高，G2～M期细胞在整个细胞群中所占比例增加。结论：多烯紫杉醇通过将肺癌细胞阻滞于G2～M期并且使细胞内产生过多的活性氧诱导细胞凋亡来发挥抗癌作用。     

二烯丙基三硫诱导人胃癌细胞凋亡与活性氧之间的关系

目的:探讨二烯丙基三硫(diallytrisulfide,DATS)诱导人胃癌细胞系MGC-803凋亡与细胞内活性氧(re-active oxygen species,ROS)之间的关系。方法:用12mg/L的DATS作用于体外培养的MGC-803细胞24h后,用流式细胞术检测凋亡率及细胞内活性氧水平。结果:12mg/LDATS作用于MGC-803细胞24h后,细胞凋亡率明显上升;细胞内活性氧水平与DATS呈浓度依赖性升高。用抗氧化剂NAC预处理细胞,能抑制细胞内活性氧水平的升高及DATS诱导的细胞凋亡。结论:DATS诱导胃癌细胞凋亡与细胞内活性氧产生增加有关。     

维生素E琥珀酸酯通过氧化应激诱导胃癌SGC-7901细胞凋亡的研究

目的：研究维生素E琥珀酸酯（vitamin E succinate,VES）是否可通过氧化应激来诱导胃癌细胞凋亡及其可能机制。方法：分别用5、10和20μg/ml的VES处理胃癌SGC-7901细胞24h,同时设阴性对照组和甘露醇（活性氧抑制剂）预处理组。通过流式细胞技术、共聚焦技术和Western blot方法,检测了VES诱导SGC-7901细胞线粒体氧化损伤及细胞凋亡的情况,用相应的检测试剂盒检测细胞内活性氧和Ca^2＋含量变化情况。结果：不同浓度的VES对SGC-7901细胞均有诱导凋亡的作用。表现为随VES浓度的增加,SGC-7901细胞凋亡数量呈现增加的趋势,且SGC_7901细胞内活性氧含量及钙离子水平呈现增加的趋势,而线粒体膜电位逐渐下降。活性氧抑制剂甘露醇（1mmol/L）对VES诱导的胃癌细胞凋亡,和细胞内活性氧、钙浓度的增高及膜电位的降低均有显著抑制作用（P〈0.05）。随VES浓度的增加,SGC7901细胞内Bax蛋白的表达呈现上升的趋势,而Bcl-2蛋白的表达呈现下降趋势。甘露醇可显著降低胃癌SGC-7901细胞Bax蛋白的表达水平,同时增加Bcl-2蛋白的表达（P〈0.05）。结论：VES可显著促进胃癌细胞凋亡,并且随着VES剂量的增加,VES诱导胃癌细胞凋亡的作用越强。细胞内活性氧含量增加、细胞内钙超载所导致的线粒体氧化损伤作用可能是VES诱导细胞凋亡的机制之一。     

芦荟大黄素诱导胃癌细胞株MGC-803细胞凋亡药效学作用研究

目的:观察芦荟大黄素诱导人胃癌细胞株MGC-803凋亡药效作用研究.方法:用50、100、500、1000μmol/L浓度芦荟大黄素作用胃癌细胞株48h,倒置显微镜下观察细胞增殖情况;MTT法检测芦荟大黄素对细胞增殖的抑制作用;电镜观察、判定凋亡细胞;凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡.结果:倒置显微镜下,随着芦荟大黄素作用浓度升高,细胞增殖能力随之下降;MTT法亦检测到上述结果;当芦荟大黄素作用浓度是1000μmol/L时,可检测到明显的凋亡细胞.结论:高浓度的芦荟大黄素可诱导胃癌细胞株MGC-803细胞的凋亡.     

氧化应激在姜黄素诱导肺癌细胞凋亡中的作用

摘 要：［目的］ 探讨姜黄素诱导肺癌A549细胞凋亡中氧化应激的作用。［方法］ 将不同浓度(5~40μM)的姜黄素作用于肺癌细胞株A549细胞,以MTT法检测姜黄素不同浓度（5~40μM）在不同时间点（3、6、12、24、48 h）对A549细胞的抑制增殖率,流式细胞术检测细胞凋亡率;DCFH-DA探针染色流式检测细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)的变化,硫代巴比妥酸法检测丙二醛（malondialdehyde,MDA）,Western blot检测Bcl-2、Bax和HSP70的表达。［结果］ 20μM姜黄素作用细胞12h和24h时,细胞增殖抑制率分别为32.17% 和52.16%。姜黄素对A549细胞的生长抑制作用呈剂量和时间依赖性。A549细胞凋亡率和坏死率随着姜黄素的浓度增高而增加。经姜黄素处理后,细胞内活性氧显著性降低,丙二醛活性下降,HSP70活性下降,Bax/Bcl-2比值增高。［结论］姜黄素可调节肺癌细胞内氧化还原状态,从而促进肿瘤细胞凋亡。     

微囊藻毒素LR抑制小鼠淋巴细胞免疫功能的体外研究

目的：探讨微囊藻毒素LR（microcystin LR,MC-LR）抑制小鼠淋巴细胞免疫功能的可能机制。方法：分离小鼠脾淋巴细胞,分别用含MC-LR为0、1、3、5、10μg/ml的培养液,染毒脾淋巴细胞,MTT法检测MC-LR对小鼠T、B淋巴细胞增殖的影响;ELISA法测定淋巴细胞IL-2的含量;FCM法检测淋巴细胞凋亡率。结果：各MC-LR剂量组淋巴细胞的增殖指数均下降;1μg/mlMC-LR刺激淋巴细胞分泌IL-2,而5、10μg/mlMC-LR组却抑制淋巴细胞分泌IL-2;10μg/mlMC-LR组淋巴细胞凋亡率明显升高（P均〈0.05）。结论：体外培养条件下,MC-LR能明显抑制小鼠脾淋巴细胞增殖,降低淋巴细胞因子IL-2的含量并诱导淋巴细胞凋亡。     

非甾体类抗炎药对骨肉瘤细胞株增殖和凋亡的影响

目的 研究不同种类的非甾体类抗炎药（NSAIDs）对人骨肉瘤细胞株增殖和凋亡的影响.方法 采用有限稀释法,从人骨肉瘤细胞系MG-63中分离培养出细胞株,扩增培养后分为4个干预组：Cox-1特异性抑制剂组（小剂量阿司匹林,采用的浓度梯度分别为：0μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、15μg/ml、20μg/ml、25μg/ml）、Cox非选择性抑制剂组（双氯芬酸钠注射液,采用的浓度梯度分别为：0mg/L、0.3mg/L、0.6mg/L、0.9mg/L、1.2mg/L、1.5mg/L）、Cox-2选择性抑制剂组（美洛昔康注射液,采用的浓度梯度分别为：0μg/ml、0.4μg/ml、0.8μg/ml、1.2μg/ml、1.6μg/ml、2.0μg/ml）、Cox-2特异性抑制剂组（注射用帕瑞昔布,采用的浓度梯度分别为：0mg/L、0.3mg/L、0.6mg/L、0.9mg/L、1.2mg/L、1.5mg/L）,设培养液中不加药物的作为对照组,每组中的不同浓度均设6个重复孔,药物对细胞株干预72h后,采用四唑盐比色法（MTT）检测细胞增殖抑制率,流式细胞仪测定细胞凋亡率.结果 不同浓度的小剂量阿司匹林、双氯芬酸钠、美洛昔康、帕瑞昔布作用于骨肉瘤细胞株后均能不同程度地抑制细胞株的生长,各处理组与对照组之间具有显著性差异（P＜0.05）,在常见的血药浓度范围内,抑制率与浓度之间成正相关（P＜0.05）;不同浓度的小剂量阿司匹林、双氯芬酸钠、美洛昔康、帕瑞昔布也均能不同程度地促使细胞株凋亡,实验组的凋亡率明显高于对照组,其差异具有统计学意义（P＜0.05）,在常见血药浓度的范围内,浓度越高,凋亡率就越高（P＜0.05）.结论 4种不同种类的NSAIDs均能抑制骨肉瘤细胞的增殖和促使其凋亡,这种作用具有量效依赖关系.     

大黄素在体外诱导人肝癌细胞HepG2发生凋亡的初步研究

背景与目的:大黄素(3-甲基-1,6,8-三羟蒽醌)是大黄等多种中药的有效成分之一。研究表明大黄素对于乳腺癌细胞、肺癌细胞的生长具有抑制作用,但目前大黄素抗肿瘤的作用机理尚不明确。本研究拟讨论大黄素在体外对肝癌细胞HepG2的作用及其机理。方法:应用MTT、软琼脂克隆形成、DNAladder凝胶电泳及流式细胞术等方法,研究中药单体大黄素对肝癌细胞HepG2生长增殖的影响以及作用机理。结果:大黄素在较低浓度可抑制肿瘤细胞的生长,MTT实验测得的半数抑制浓度(IC50)为(36±2.6)μg/ml。在软琼脂实验中,大黄素可以浓度依赖的方式抑制细胞克隆的形成。经DNAladder及流式细胞仪检测发现,大黄素能诱导HepG2细胞凋亡,与阴性对照相比,随着药物浓度从10μg/ml增加到20μg/ml,AnnexinV染色细胞显著增多,由27.3%增至59.6%;当药物浓度增至40μg/ml时,培养液中几乎无活细胞,由碘化丙啶和AnnexinV双重标记的凋亡后期以继发性坏死细胞为主。结论:中药单体大黄素在体外能抑制肝癌细胞HepG2的生长增殖,并能诱导该细胞凋亡。     

大蒜素对结肠癌ＬｏＶｏ细胞增殖的影响

目的：观察大蒜素对结肠癌细胞ＬｏＶｏ生长、细胞凋亡及细胞周期的影响。方法：不同浓度的大蒜素作用于体外培养的ＬｏＶｏ细胞,倒置显微镜下观察ＬｏＶｏ细胞的形态学变化,采用ＭＴＴ法检测大蒜素对ＬｏＶｏ细胞增殖抑制能力,Ａｎ ｎｅｘｉｎＶ ＦＩＴＣ标记流式细胞术检测大蒜素对ＬｏＶｏ细胞的凋亡抑制率,流式细胞术检测大蒜素对ＬｏＶｏ细胞周期影响。结果：大蒜素可抑制人结肠癌ＬｏＶｏ细胞增殖,具有明显量效和时间依赖性,２４、４８和７２ｈ大蒜素抑制ＬｏＶｏ细胞的ＩＣ５０分别为３２.２３、１０.７４和６.５８μｇ／ｍｌ;大蒜素能够诱导ＬｏＶｏ细胞凋亡,作用２４ｈ其诱导凋亡率随着药物浓度的递增具有增高趋势,作用４８ｈ其诱导凋亡作用峰值浓度为８μｇ／ｍｌ,后再继续增加浓度凋亡率反而下降;大蒜素作用ＬｏＶｏ细胞２４ｈ后,大蒜素浓度低于４μｇ／ｍｌ时,ＬｏＶｏ细胞周期被阻滞于Ｇ２／Ｍ;     

Induction of apoptosis by 2-chloro-2'deoxyadenosine (2-CdA) alone and in combination with other cytotoxic drugs: synergistic effects on normal and neoplastic lymphocytes by addition of doxorubicin and mitoxantrone

2-CdA is active as a single agent in the treatment of low-grade lymphomas. We analyzed the induction of apoptosis by 2-CdA alone (n=5) and in combination with other drugs in peripheral lymphocytes from 25 patients with leukemic low-grade lymphomas and from 25 healthy volunteers. 2-CdA was tested in 4 escalating concentrations (0.05 microg/ml to 0.4 microg/ml). Linear regressions showed a dose dependent apoptosis rate of 0.29 x microg 2-CdA/ml + 0.11 (r2=0.88, p=0.006) in normal cells and 0.41 x microg 2-CdA/ml + 0.15 (r2=0.88, p=0.005) in leukemic cells. Intracellular metabolization of 2-CdA into 2-CdA-5'mono-, -di- and the active metabolite -triphosphate was analyzed by HPLC and paralleled the dose dependent increase of apoptosis. The combination of 2-CdA with doxorubicin or mitoxantrone had a synergistic effect on the induction of apoptosis (p<0.001) in both normal and neoplastic lymphocytes, whereas 2-CdA plus etoposide or cytosine arabinoside were only additive. Due to the flat slope of the dose response of 2-CdA concentration on apoptosis we assume that higher in vivo dosages of 2-CdA in the treatment of low-grade lymphomas may not result in a higher clinical efficacy. The synergistic lymphocytotoxic effect of 2-CdA combined with doxorubicin or mitoxantrone may be relevant for new treatment approaches.     

丙氨酰谷氨酰胺对结肠癌细胞功能性FasL基因表达的影响

目的：研究丙氨酰谷氨酰胺（A1a—Gln）对人结肠癌SW480细胞陆LmRNA表达及其诱导淋巴细胞凋亡的影响,为进一步研究和应用谷氨酰胺提供依据。方法：经体外培养结肠癌SW480细胞株,加入不同浓度的A1a—Gin后收集细胞。应用实时定量逆转录-聚合酶链反应（Real—TimeRT—PCR）法检测人结肠癌SW480细胞FasLmRNA的变化;应用流式细胞术检测SW480细胞诱导淋巴细胞凋亡率的变化。结果：Real—Timelit—PCR法检测结果显示,不同浓度A1a—Gin处理后SW480细胞FasLmRNA表达水平均明显低于对照组（P〈0．05）;而且FasLmRNA表达水平随A1a—Gin作用浓度增加而下调,A1a—Gin不同浓度组比较均有显著性差异（P〈0．05）;流式细胞术检测结果表明,随A1a～Gin作用浓度升高,SW480细胞诱导淋巴细胞凋亡率降低,不同浓度组比较均有显著性差异（P〈0．05）。结论：在-定浓度范围内,A1a—Gin可下调人结肠癌SW480细胞FasLmRNA的表达,并能抑制肿瘤细胞反向攻击淋巴细胞。     

重组人血管内皮抑素对肺腺癌A549细胞生长及凋亡的影响

目的：探讨重组人血管内皮抑素（恩度）对肺腺癌A549细胞生长及凋亡的影响。方法：应用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测恩度对肺腺癌A549细胞的生长抑制作用,流式细胞仪检测肺腺癌A549细胞的凋亡率,比较各浓度药物对肺腺癌A549细胞的诱导凋亡作用。结果：恩度可以抑制肺腺癌A549细胞的生长,且呈时间剂量依赖性。恩度可以诱导肺腺癌A549细胞的凋亡,随浓度增加、作用时间的延长,凋亡率增加,与对照组相比,差异有统计学意义（P〈0．001）。结论：恩度对肺腺癌A549细胞的生长具有明显的抑制作用,主要通过诱导肺腺癌A549细胞的凋亡引起。