鞘氨醇-1-磷酸受体-1促进肿瘤转移与放疗抵抗的研究进展

远处转移是癌症治疗的主要障碍之一。鞘氨醇-1-磷酸受体-1（sphingosine-1-phosphate receptor 1,S1PR1）在恶性肿瘤中过度表达,通过激活下游信号通路增强细胞侵袭和迁移活性、调控上皮间质转化（EMT）以及诱导淋巴管与血管生成,最终导致肿瘤转移的发生。S1PR1与获得性放射抗性的产生也有密切关联。本文就S1PR1及其在肿瘤转移和放疗抵抗中的作用进行综述。     

1-磷酸鞘氨醇促进大鼠血管平滑肌细胞迁移的实验研究

目的探讨1-磷酸鞘氨醇（sphingosine 1-phosphate,S1P）对大鼠血管平滑肌细胞（rat vascular smooth mus-cle cells,rVSMc）迁移的作用机制,为肿瘤血管新生和心血管疾病发生机制的研究提供新的思路。方法体外分离培养、鉴定rVSMc细胞,建立低氧培养箱和氯化钴诱导的细胞低氧模型,应用RT-PCR方法对rVSMc细胞的S1P受体表达水平进行检测,运用微孔隔离室穿越方法研究S1P对rVSMc细胞迁移的作用,并用S1P受体阻断剂加以证实。结果与结论rVSMc细胞表达SPK1和S1P受体rS1P1、rS1P2和rS1P3,低氧状态下rVSMc细胞SPK1的表达和活性均高于对照,S1P主要通过与rS1P2受体结合促进rVSMc细胞的迁移。     

鞘氨醇激酶在免疫细胞中的作用

近年来,专家们越来越清楚地认识到神经鞘脂类是重要的信号传递分子。尤其是神经鞘脂类的代谢产物,比如神经酰胺和1-磷酸鞘氨醇(S1P),已经被认为是一类重要的生物活性分子,参与细胞内的各种生[1-2]     

鞘氨醇激酶调节细胞凋亡的研究进展

鞘磷脂衍生物神经酰胺(Cer)、鞘氨醇(Sp)及1-磷酸鞘氨醇(SIP)在调控细胞增殖、存活及凋亡中发挥着重要作用。鞘氨醇激酶(SPK1)是调控细胞内Cer、Sp、SIP代谢平衡的关键酶。SPK1磷酸化Sp生成SIP，SIP通过细胞内和细胞外作用机制调节细胞生长和凋亡。SPK1参与细胞因子的信号传递。高表达SPK1抑制半胱天冬酶的裂解并上调Bcl-2基因的表达。本文综述了SPK的结构、调控及对细胞凋亡的调节作用。     

鞘氨醇代谢物——肿瘤治疗的新靶点

神经鞘脂类是细胞膜的结构成分之一。其代谢产物如神经酰胺、鞘氨醇、1-磷酸鞘氨醇亦是具有生物活性的信号分子,可作为第一和（或）第二信使调控着细胞的生命活动,如细胞的增殖、存活、迁移、新生血管形成。鞘氨醇激酶1是调节神经酰胺、1-磷酸鞘氨醇平衡的限速酶。近年研究表明,神经酰胺、鞘氨醇激酶1、1-磷酸鞘氨醇可调控肿瘤细胞代谢的多个环节,由此提示神经鞘脂类代谢产物可作为肿瘤治疗的新靶点。     

高表达鞘氨醇激酶对胃癌细胞生物学特性的影响

目的研究高表达鞘氨醇激酶（SPK）对人胃癌细胞增殖、迁移和凋亡等细胞生物学行为的影响。方法以重组腺病毒为载体,将人野生型（rAd—SPK^WT）及突变体（rAd—SPK^DV）SPK基因导入人胃癌细胞BCC-823。以Western blot检测外源SPK基因的表达,以[γ^82P]ATP掺入法测定SPK酶活性,用迁移扩散盒技术测定细胞的迁移能力。结果重组腺病毒可有效介导SPK在人胃癌细胞BGC-823中的表达。酶活性分析表明野生型SPK基因可增强SPK活性,而突变体SPK基因抑制SPK活性;高表达野生型SPK可以促进胃癌细胞的迁移,抑制5-FU对胃癌细胞的细胞毒作用,而高表达突变体SPK可以抑制胃癌细胞的迁移,增强5FU对胃癌细胞的细胞毒作用。结论SPK可以抑制5-FU诱导的胃癌细胞凋亡,促进胃癌细胞迁移,有可能成为胃癌新的治疗靶点。     

鞘氨醇激酶1对氧自由基诱导心肌细胞损伤的保护作用研究

目的:研究鞘氨醇激酶1(SPK1)在氧自由基诱导心肌细胞损伤过程中的作用.方法:分离培养Wistar乳大鼠心肌细胞,用不同浓度过氧化氢(H2O2,0, 50, 100, 200, 400 μmol/L)处理细胞,检测乳酸脱氢酶(LDH)的释放和细胞SPK1酶活性变化;Northern 印迹方法分析SPK1催化产物1-磷酸鞘氨醇(S1P)受体的表达.用S1P预处理心肌细胞,然后加入100 μmol/L的H2O2继续作用48 h,检测细胞培养上清中LDH的活性;用携带人SPK1基因的复制缺陷型重组腺病毒载体(Ad-SPK1)感染Wistar乳大鼠心肌细胞,然后加入100 μmol/L的H2O2继续作用48 h,检测细胞培养上清中LDH的活性.分析外源性S1P或SPK1高表达对H2O2诱导心肌细胞损伤的保护作用.结果:H2O2作用于心肌细胞后,导致LDH释放增多,SPK1酶活性抑制,其作用呈剂量依赖性;H2O2刺激使S1P受体Edg-1表达水平升高,Edg-3表达水平降低.外源性S1P预处理使H2O2诱导的LDH释放减少,其作用呈剂量依赖性.与对照组相比,Ad-SPK1感染使心肌细胞SPK1酶活性明显升高,细胞培养上清中S1P含量增多,并明显抑制H2O2诱导心肌细胞LDH的释放.结论:SPK1高表达能保护H2O2导致的心肌细胞死亡,这种保护作用主要通过S1P的释放来实现.Edg-1和Edg-3可能参与SPK1对心肌细胞的保护作用.     

IL-6对人多发性骨髓瘤细胞鞘氨醇激酶的激活作用

目的：鞘氨醇激酶是细胞内合成磷酸鞘氨醇的激酶。该酶是细胞迁移、增殖及凋亡调节中发挥重要作用的信号分子。本研究拟确定鞘氨醇激酶在人多发性骨髓瘤细胞的表达及在IL-6信号途径中的作用。方法：采用RT-PCR方法鉴定了鞘氨醇激酶在骨髓瘤细胞的表达情况，通过鞘氨醇激酶活性测定确定IL-6对多发性骨髓瘤细胞鞘氨醇激酶的激活作用。结果：人多发性骨髓瘤细胞表达鞘氨醇激酶及S1P受体EDG1，3，5。IL-6通过PI-3K和MAPK激活鞘氨醇激酶。结论：在多发性骨髓瘤细胞中，鞘氨醇激酶参与IL-6的信号转导。鞘氨醇激酶有可能成为多发性骨髓瘤治疗的新靶点。     

鞘氨醇激酶——运动改善胰岛素抵抗的新靶点

随着生活水平的日益提高,肥胖、2型糖尿病(Type 2 Diabetes Mellitus,T2DM)等代谢性疾病发病率逐年上升,胰岛素抵抗(Insulin Resistance,IR)是诸多代谢性疾病的共同病理生理基础。运动通过提高机体外周组织代谢水平而显著改善IR已被广泛应用于代谢性疾病的防治。近年来,鞘氨醇激酶(Sphingosine kinases,SK)作为机体脂代谢的重要调控蛋白受到了广泛关注,其催化鞘氨醇(Sphingosine)合成鞘氨醇-1-磷酸(Sphingosine-1-Phosphate,S1P),SK及其S1P在运动调控机体脂代谢从而改善IR的过程中发挥举足轻重的作用。本文对近年来有关SK及其催化产物S1P在运动改善机体IR过程中的作用研究加以综述,为揭示运动防治IR机制提供新的研究靶点。     

MicroRNA-124对人脐静脉内皮细胞增殖和凋亡的影响

目的 观察miR-124对内皮细胞增殖和凋亡的影响,探讨miR-124在动脉粥样硬化中的作用.方法 采用荧光定量PCR检测miR-124在40例冠心病患者及40例正常对照血浆中的表达水平,CCK-8和BrdU法检测miR-124对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)增殖的影响,TUNNEL染色检测miR-124对HUVECs凋亡的影响,Western blotting检测miR-124对HUVECs促凋亡蛋白cleaved caspase 3及抗凋亡蛋白Bcl-2表达的影响.结果 与对照组比较,miR-124在冠心病患者血浆中的表达明显降低.CCK-8和BrdU检测结果提示miR-124可明显促进HUVECs增殖;TUNNEL染色及Western blotting检测结果提示,miR-124可明显降低HUVECs凋亡细胞的比例及cleaved caspase 3表达,同时增加Bcl-2的表达.结论 MiR-124可促进HUVECs的增殖并抑制其凋亡,为深入认识动脉粥样硬化的发病机制提供了理论依据.     

VEGF-C在替代性活化的巨噬细胞转分化为淋巴管内皮细胞中的作用

目的 观察替代性活化的巨噬细胞(aaMphi)在血管内皮生长因子-C(VEGF-C)的诱导下能否转分化为淋巴管内皮细胞(LEC),初步探讨aaMphi促进淋巴管生成的可能机制.方法 以重组小鼠白细胞介素-4(IL-4)处理小鼠巨噬细胞(RAW264.7)24h,建立aaMphi模型.分别以不同浓度的小鼠重组VEGF-C处理aaMphi,通过测定后者在基质胶中形成簇样物和管样结构的情况,最终确定以浓度为100ng/ml的VEGF-C建立aaMphi转分化系统.在此系统中,分别于第0、7、14和28天以实时定量RT-PCR法检测aaMphi LEC特异性标志物[血管内皮生长因子受体-3(VEGFR-3)、Prox1]和aaMphi特异性标志物(Fizz1)的情况.连续28天在倒置相差显微镜下观察aaMphi在基质胶中形成管样结构的情况.结果 成功地建立了以VEGF-C为诱导剂,以EBM-2为培养基,以基质胶作为支持物的aaMphi转分化系统,其VEGFR-3和Prox1 mRNA的表达逐渐增加,而Fizz1 mRNA的表达逐渐下降,至第14天分别达到最高值和最低值;第28天和第14天的情况无明显差别.从第7天到第28天,可见aaMphi在基质胶中逐渐形成明显的管样结构,且随着时间延长数量逐渐增加.结论 VEGF-C通过诱导aaMphi中VEGFR-3和Prox1的表达上调,促使aaMphi转分化为LEC:这是aaMphi促进淋巴管生成的可能机制之一.     

抑制NRP2表达对淋巴管内皮细胞小管成型的影响

目的 探讨抑制神经纤毛蛋白质2(NRP2)基因表达对人淋巴管内皮细胞(LECs)体外形成小管能力的影响.方法从人新鲜包皮中分离纯化LECs,并进行鉴定.实验设NRP2-RNAi/LECs组、mock/LECs组和hECs组,三组分别转染pGensil-NRP2(携带NRP2 siRNA的真核表达载体)、pGensil-1(空载体)及正常LECs细胞.采用RT-PCR和Western blotting检测NRP2 mRNA和蛋白的表达;绘制细胞生长曲线以观察各组细胞生长的差异.对细胞进行三维胶培养,计数小管样结构的数量,并测量小管外径、内径和管壁厚度.结果 与hECs组和mock/LECs组比较,NRP2-RNAi/LECs组NRP2表达水平明显下调(P<0.05),而前两组间无显著差异(P>0.05).生长曲线显示三组细胞的增殖能力无显著差异,均于接种后3～5d进入对数生长期,6～7d进入停滞期.三维胶培养形成的管样结构在NRP2-RNAi/LECs组很少见,其管样结构的数量及小管外径、内径、管壁厚度都明显低于mock/LECs组和hECs组(P<0.05),而后两组间无显著差异(P>0.05).结论 抑制NRP2的表达可抑制LEGs在体外形成小管的能力,并可能抑制肿瘤淋巴管的生成.     

p54nrb基因沉默对人脐静脉内皮细胞迁移及体外血管生成的影响

目的 观察p54nrb基因沉默对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖、迁移及体外血管生成的影响,探讨p54nrb基因在血管新生中作用.方法 用含有靶向人p54nrb基因shRNA的慢病毒感染HUVEC 24h后,用嘌呤霉素进行筛选,Western blotting检测HUVEC中p54nrb蛋白的表达,确定p54nrb基因沉默效率,建立稳定的p54nrb基因沉默的HUVEC细胞系.CCK-8法检测p54nrb基因沉默对HUVEC细胞增殖的影响;划痕实验和Transwell迁移实验检测p54nrb基因沉默对HUVEC细胞迁移的影响;体外血管生成实验检测p54nrb基因沉默对HUVEC体外血管生成能力的影响.结果 Western blotting结果显示,p54nrb基因沉默的HUVEC细胞中p54nrb蛋白表达显著减少,表明建立了稳定的p54nrb基因沉默的HUVEC细胞系.CCK-8实验结果显示,p54nrb基因沉默轻度地促进了HUVEC细胞增殖;划痕实验和Transwell迁移实验结果显示,p54nrb基因沉默后HUVEC细胞迁移能力明显下降;体外血管生成实验结果显示,p54nrb基因沉默明显抑制了HUVEC的体外血管生成能力.结论 p54nrb具有促进HUVEC细胞迁移及体外血管生成的作用,可能是一个新的参与血管生成的调控蛋白.     

Investigation of cell death mechanisms in human lymphatic endothelial cells undergoing photodynamic therapy

BackgroundPhotodynamic therapy (PDT) has been shown to induce ablation and functional occlusion of tumor-associated lymphatic vessels. However, direct effects of PDT on lymphatic endothelial cells (LECs) have not been studied so far. The aim of this study was to elucidate molecular mechanisms of cell death induced by PDT in human LECs.MethodsVerteporfin was used as a photosensitizer to investigate PDT-mediated damage of lymphatic vessels in mice using immunofluorescent staining and stereomicroscopy. In vitro dose-response studies were carried-out with crystal violet staining. Immunofluorescence, flow cytometry, immunoblotting and DNA electrophoresis were used to investigate the mechanisms of cell death in human LECs undergoing PDT.ResultsPDT induced an increase in the number of propidium iodide positive lymphatic endothelial cells in the mouse dermis. In in vitro studies dose-dependent cytotoxic effects of PDT towards LECs were observed. Typical hallmarks of apoptotic cell death, including Annexin V binding, loss of mitochondrial membrane potential, caspase activation, cleavage of PARP as well as DNA fragmentation were observed in LECs when PDT was used at high irradiation conditions, causing >80% cell death. At lower light fluencies causing <50% cell death PDT induced autophagy rather than apoptosis, as revealed by conversion of LC3-I to the autophagosomal LC3-II and formation of LC3 puncta. Z-VAD-FMK, a caspase inhibitor, prevented cell death induced by high-dose PDT only, while 3-methyladenine, an autophagy suppressor, inhibited cell death induced by low-dose PDT.ConclusionsBoth apoptosis and autophagy are involved in cell death induced by verteporfin-PDT in LECs.     

雷帕霉素对内皮祖细胞数量与功能的影响

目的观察雷帕霉素对外周血内皮祖细胞（EPCs）数量与功能的影响。方法采用密度梯度离心法从外周血获得单个核细胞,将其接种在人纤维连接蛋白包被的培养板上,培养7天后收集贴壁细胞,加入不同浓度（1.0、2．0、5．0ug／m^3）雷帕霉素分别培养6、12、24、48h。激光共聚焦显微镜鉴定,FITC-UEA-I和Dil-acLDL双染色阳性细胞为正在分化的EPCs,流式细胞仪检测其表面标志以进一步鉴定EPCs,并在倒置荧光显微镜下计数。然后分别采用MTT比色法、改良的Boyden小室、黏附能力测定实验和体外血管生成试剂盒来观察EPCs的增殖能力、迁移能力、黏附能力和体外血管形成能力。结果EPCs数量随雷帕霉素浓度与作用时问增加而减少,其增殖能力、迁移能力、黏附能力和体外血管形成能力亦随雷帕霉素浓度与作用时间增加而降低。结论雷帕霉素降低EPCs的数量、增殖能力、迁移能力、黏附能力和体外血管形成能力,并呈浓度和时间依赖性。     

Fructose 3-phosphate and 5-phosphoribosyl-1-pyrophosphate formation in perhsed human erythrocytes: 31P NMR studies

³¹P NMR was used to study the formation of fructose 3-phos-phate (F3P) and 5-phosphoribosyl-1-pyrophosphate (PRPP) in perfused human erythrocytes, in the presence of 10 different combinations and concentrations of glucose, inosine, pyru-vate, fructose, and inorganic phosphate (P_i). (1) The cells were immobilized in alginate-coated agarose threads and perfused with a medium containing fructose, and the level of F3P increased continuously over more than 10 h. The net rate of F3P formation was independent of the concentration of 2,3-bis-phosphoglycerate (2,3-DPG) present in the cells. (2) PRPP was formed in high concentrations, relative to normal, in immobilized cells when they were perfused with a medium containing P_i at a low pH (6.6). (3) The 2,3-DPG level decreased simultaneously when the sample was perfused with a medium containing fructose, but without inosine or pyruvate. The measured intracellular pH and free Mg²⁺ concentration were constant in these experiments. (4) The experiments confirmed the presence of fructose-3-phosphokinase (E.C. 2.7.1.-) and ribose-phosphate pyrophosphokinase (E.C. 2.7.6.1) activity in the human erythrocytes and that the biosynthetic pathways are active in immobilized cells at 37°C. (5) The rates of accumulation of 2,3-DPG and phosphomonoesters (PME) appeared to be strongly correlated.     

舒洛地特对氧化型低密度脂蛋白诱导人脐静脉内皮细胞损伤的保护作用及其机制研究

目的 研究舒洛地特(SDX)对氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导人脐静脉内皮细胞(HUVEC)损伤的保护作用及其机制.方法 CCK-8法确定ox-LDL干预HUVEC剂量及SDX药物浓度,活性氧(ROS)检测试剂盒验证SDX对HUVEC的保护作用.实时荧光定量-聚合酶链反应(RT-PCR)检测内皮型一氧化氮合酶(eNOS)、小凹蛋白(caveolin)-1 mRNA表达,免疫印迹试验检测eNOS、caveolin-1蛋白表达.Transwell试验检测HUVEC迁移能力,免疫印迹试验检测抗磷酸化eNOS(p-eNOS)蛋白表达.结果 100 μg/ml ox-LDL刺激下,HUVEC细胞活力显著下降(P＜0.01),加入0.125 LRU/ml SDX后细胞活力明显改善(P＜0.01),ROS产生降低(P＜0.01).SDX可下调ox-LDL损伤HUVEC后caveolin-1 mRNA和蛋白表达(P＜0.05),上调eNOS mRNA和蛋白、p-eNOS蛋白表达(P＜0.05),明显改善受损HUVEC迁移能力(P＜0.01).结论 SDX通过调控caveolin-1/eNOS信号通路改善受损HUVEC细胞迁移能力,从而保护内皮细胞.     

三氧化二砷对内皮细胞增殖和一氧化氮分泌的影响

 目的 通过观察不同浓度三氧化二砷(As₂O₃)对内皮细胞增殖及分泌一氧化氮(NO)的影响, 初步从内皮细胞角度评价As₂O₃防治PTCA术后再狭窄的作用。方法 以不同浓度As₂O₃溶液(0.01、0.1、0.5、1、5、10 μmol/L)作用于传代培养的EVC-304细胞, 分别培养24、48、72 h测定内皮细胞对 3H-TdR摄取量, 以硝酸还原酶法测定内皮细胞培养液NO含量。结果 As₂O₃浓度低于1 μmol/L时对内皮细胞摄取3H-TdR无抑制作用。As₂O₃浓度低于0.1 μmol/L时对内皮细胞分泌NO无明显抑制作用;As₂O₃浓度0.5~10 μmol/L时抑制内皮细胞分泌NO。结论 As₂O₃ 浓度低于0.1 μmol/L对内皮细胞增殖及分泌NO均无明显抑制作用;0.1~1 μmol/L范围内只对内皮细胞分泌NO的功能有轻度影响, 但不抑制内皮细胞的增殖;而较高浓度的As₂O₃对内皮细胞增殖及分泌NO均有明显抑制, 而且抑制作用随浓度增高而增强。As₂O₃ 用于防治PTCA术后再狭窄应采取低较浓度。     

生长分化因子11对高糖环境中人甲状腺乳头状癌K1细胞凋亡的影响

 目的 探讨生长分化因子11(growth differentiation factor 11,GDF1)对高糖环境中人甲状腺乳头状癌K1细胞凋亡的影响。方法 将人甲状腺乳头状癌K1细胞分为3组:对照组(Vehicle)、高糖组(HG)和GDF11组(HG+GDF11;GDF11)。各组细胞培养3 d后,流式细胞术检测细胞凋亡率,western blot检测凋亡相关蛋白Bax与Bcl-2的蛋白水平,实时荧光定量逆转录PCR检测核转录因子E2相关因子(nuclear factor erythroid2-related factor 2,Nrf2)的转录表达,活性氧(ROS)试剂盒检测细胞内的ROS水平。结果 与对照组相比,高糖环境中K1细胞的凋亡率降低,Bcl-2/Bax蛋白表达比升高,Nrf2基因表达上调,细胞内ROS水平下降;而GDF11干预显著提高高糖环境中K1细胞的凋亡率,降低Bcl-2/Bax蛋白表达比,下调Nrf2基因转录表达,并提高细胞内的ROS水平。结论 GDF11可能通过提高高糖环境中K1细胞内的氧化应激反应促进细胞凋亡。