人B7-1基因的cDNA克隆及其重组腺病毒载体制备

目的：构建并制备含人B7-1基因的重组腺病毒（Ad-B7-1)载体,为后续的肿瘤基因治疗研究提供实验基础。方法：应用逆转录-套式PCR方法从人骨髓细胞中克隆B7-1的cDNA后,将其克隆至小片段腺病毒载体pCI′中,后与pHBG10在293细胞内重组包装产生腺病毒,感染SGC7901细胞。结果：成功克隆了人B7-1的cDNA并构建Ad-B7-1载体,且经过酶切鉴定和测序验证,感染Ad-B7-1的细胞经PCR鉴定,表明B7-1基因已整合入细胞基因组。结论：本实验构建的腺病毒载体可有效地转B7-1基因进入肿瘤细胞,该结果为下一步应用于体内肿瘤基因治疗研究提供了实验基础。     

腺病毒CD-80基因转导B16-F10细胞的体外生物学特征

目的 探讨含hB7-1基因的重组腺病毒hCD80rAd对B16－F10肿瘤细胞体外生物学特性的影响。方法 以腺病毒为载体，将CD80基因导入B16－F10肿瘤细胞后，以PCR方法检测基因导入，以电镜、FACS等方法观察对其体外生物学特性的影响。结果 重组腺病毒的滴度可达10^10PFU/mL,200MOIs rAd可使95％以上的B16－F10细胞被感染。转染CD80基因后，B16－F10细胞的生长能力、克隆形成能力等均无变化，电镜下，细胞表面结构及胞内超微结构有轻微变化。结论 重组腺病毒hCD80rAd可以有效地将hCD80基因导入肿瘤细胞而不会引起明显的生物学特性改变，制备肿瘤苗是可行的。     

重组腺病毒介导的人野生型p53,GM-CSF和B7-1基因在胰腺癌细胞中的表达

目的: 以复制缺陷型重组腺病毒为载体,使用人野生型p53基因、人GM-CSF基因和B7-1基因为目的基因,探讨三基因在胰腺癌细胞BxPC-3中的表达.方法: 免疫组织化学方法检测外源性p53蛋白在BxPC-3细胞中表达.ELISA方法测定GM-CSF表达量;流式细胞术(flow cytometry,FCM)检测BxPC-3细胞转染B7-1的表达效果.结果: 重组腺病毒介导的p53基因、GM-CSF基因、B7-1基因在BxPC-3细胞中得到高效表达.结论: 重组腺病毒介导的外源基因在BxPC-3细胞中得到高效的表达,为进一步探讨其体内外治疗胰腺癌的实验研究提供了理论基础.     

人心肌营养素-1重组腺病毒载体的构建、纯化及表达

目的　构建人心肌营养素 1重组腺病毒载体 ,以期用于神经系统退行性疾病及损伤的在体研究。方法　构建穿梭质粒pDC3 16 huCT1和pDC3 16 eGFP ,CsCl梯度离心制备高纯度的病毒基因组质粒pBHloxdeltaE1,3Cre、pHG14 0。培养2 93细胞 ,CaCl2 法质粒共转染 2 93细胞构建并筛选腺病毒AdCMV huCT1和AdCMV eGFP。病毒原液转染 2 93细胞及NIH3T3细胞 ,PCR、RT PCR及免疫组化鉴定。CsCl梯度离心纯化病毒 ,空斑试验检测病毒滴度。纯化病毒注入大鼠颈脊髓 ,RT PCR及免疫组化检验AdCMA huCT的在体表达。结果　采用双质粒共转染 2 93细胞Cre loxP位点同源重组方法构建了E1和E3缺失的含MCMV启动子、外源基因和SV40PloyA的AdCMV huCT1和AdCMV eGFP载体。经过PCR、RT PCR和免疫组化证实腺病毒载体构建成功。病毒经过CsCl梯度离心纯化后 ,AdCMV huCT1滴度达到 3 .0× 10 1 0 pfu。RT PCR及免疫组化显示AdCMV huCT1在大鼠脊髓中特异性表达。结论　构建并纯化了体外及体内高效表达的AdCMV huCT1。     

人B7-1转基因肝癌瘤苗的制备

目的:制备人B7-1(hB7-1)转基因肝癌瘤苗.方法:用逆转录病毒转移系统将hB7-1基因导入人肝癌细胞株HepG2,并用RT-PCR、PCR-Southern杂交法检测转染空载体 pLXSN的HepG2/neo细胞和转染重组质粒pLXSN/hB7-1的HepG2/hB7-l细胞中hB7-1 mRNA表达;间接免疫荧光法检测HepG2细胞、HepG2/neo细胞、HepG2/hB7-1细胞形态,计算当日细胞绝对数,绘制生长曲线.结果:所建立的肝癌瘤苗(HepG2/hB7-1)细胞可高效表达hB7-1分子.基因转染对HepG2细胞的生长形态及生长曲线无明显影响.结论:逆转录病毒基因转移系统是使肝癌细胞高效表达hB7-1分子的有效途径.     

小鼠共刺激分子B7-1的分子克隆、测序与真核表达载体的构建

目的：克隆小鼠共刺激分子B7－1基因，测序并构建其真核表达载体。方法：从小鼠脾组织中提取总RNA，用RT－PCR方法将B7－1的DNA扩增出，克隆到真核表达载体pcDNA3中，测定其cDNA序列。结果：测序结果表明我们克隆的B7－1基因序列与GenBank中序列有1个碱基不同，所编码的氨基酸发生突变。结论：已成功构建小鼠B7－1的真核表达载体，为进一步应用B7－1进行肿瘤基因治疗打下基础。     

转B7—1基因的人多发性骨髓细胞XG—7在激发杀肿瘤细胞CTL？…

为调查Ｂ７－１分子在人多发性骨髓瘤细胞的表达是否可诱导出具有抗肿瘤作用的ＣＤ＾＋８的ＣＴＬ，我们用含Ｂ７－１基因逆转录病毒载体ＰＴＧ５１９２的包装细胞２９３Ｅ培养上清，感染人多发性骨髓瘤细胞系ＸＧ－７（不表达Ｂ７－１分子）用新霉素Ｇ４１８选择并经流式细胞仪筛选，获得了稳定高表达式Ｂ７－１分子的ＸＧ－７细胞（命名为ＸＧ－７－Ｂ７细胞）在体外增殖实验中，ＸＧ－７－Ｂ７细胞显示出比母系细胞ＸＧ－７对外周     

人TNF-α重组腺病毒转染人肺腺癌细胞的体外生物学特性研究

目的 在利用COS／TPC同源重组法高效制备hTNF-α重组腺病毒基础上，对感染人INF-α重组病毒的人肺腺癌细胞（Anip973）的体外生物学特性进行研究。方法 将携带有人TNF－α基因的重组腺病毒（rAd-hTNF-α）感染人肺腺癌细胞系,通过细胞生长实验、克隆形成实验、流式细胞分析、形态学检查等观察其对Anip973肿瘤细胞的作用；利用PCR和琼脂糖电泳对肺癌中人TNF－α基因进行了检测。结果 rAd-hTNF-α经扩增、纯化后，滴度可达10^10PFU／ml，当病毒为30MOI时，对Anip973细胞的转染率达90％以上。转染的Anip973肿瘤细胞除表面结构和超微结构有轻微变化外，其生长能力、克隆形成率及细胞周期等无明显变化。结论 腺病毒介导的细胞因子基因hTNF-α转染的ANIP973肿瘤细胞未见明显变化，为制备肿瘤疫苗打下基础。     

B7修饰的肿瘤细胞疫苗体内外抗肿瘤作用

目的：研究小鼠Ｂ７修饰的肿瘤细胞疫苗的体内外抗肿瘤作用。方法：应用逆转录病毒载体，将小鼠Ｂ７１和Ｂ７２导入小鼠肝癌细胞Ｈｅｐａｌ６细胞株中，Ｇ４１８筛选后获高表达Ｂ７分子的阳性细胞克隆，经丝裂霉素处理制备成肿瘤细胞疫苗（ＴＣＶ），观察ＴＣＶＢ７体外刺激的脾细胞对不同肿瘤细胞系的抗瘤活性及对不同动物模型的体内免疫保护作用和免疫治疗作用。结果：①ＴＣＶＢ７体外刺激的脾细胞对亲本肝癌细胞和小鼠ＮＫ敏感的Ｙａｃ１细胞的体外细胞毒作用明显增强；②在免疫模型中，经ＴＣＶＢ７免疫的小鼠，能对同系肝癌细胞产生完全的免疫保护作用，并能保持无瘤状态长期存活；③在早期模型中，经ＴＣＶＢ７治疗的小鼠，能部分产生对同系肝癌细胞的免疫治疗作用，肿瘤的生长速度减缓，荷瘤小鼠的生存期延长。肿瘤组织（尤其是肿块包膜下）中淋巴细胞浸润增加；④在晚期模型中，经ＴＣＶＢ７治疗的小鼠，未能产生对同系肝癌细胞的免疫治疗作用。结论：Ｂ７修饰的肿瘤细胞疫苗能明显刺激增强体内外抗肿瘤作用。     

人B7.1(CD80)的真核表达及抗白血病作用

目的:构建人B7.1(CD80)重组真核表达载体,并在HL60细胞上表达,探讨其在急性白血病免疫治疗及免疫保护中的重要作用。方法:①应用分子克隆方法,采用PCR法扩增人B7.1基因片段,ApaⅠ、SalⅠ分别双酶切PCR产物和表达载体pHook,纯化后的酶切产物由T4 DNA连接酶连接,转化大肠杆菌DH5α,应用ApaⅠ、SalⅠ双酶切和DNA序列分析技术进一步鉴定阳性克隆。②应用脂质体转化技术将B7.1转化HL60细胞,并以FACS检测其表达。③将B7.1~+细胞免疫小鼠,通过成瘤时间及存活时间等指标观察其免疫治疗和免疫保护作用。结果:①PCR法扩增出一大小约620 bp的基因片段;共筛选出6个阳性克隆,均可ApaⅠ、SalⅠ双酶切出大小约620 bp的基因片段,与人B7.1基因片段大小相符,提示重组载体构建成功。进一步DNA序列分析证明人B7.1基因序列和读码框架正确,与文献报道人B7.1cDNA序列一致,无基因突变。②应用FACS在转化HL60上检测到B7.1的高效表达。③B7.1~+ HL60细胞能明显抑制肿瘤生长,延长白血病鼠存活时间,且其免疫预防时成瘤时间较野生型HL60(B7.1-)显著延迟,小鼠存活时间明显延长。结论:应用分子克隆方法可成功构建人B7.1(CD80)重组真核表达载体,并稳定、高效表达于B7.1之急性髓性白血病(AML)细胞系HL60胞膜上,这种共刺激分子瘤苗具有显著     

人IL-2重组腺病毒转染人肺腺癌细胞的体外生物学特性的研究

目的 在利用COS／TPC同源重组法高效制备hIL-2重组腺病毒基础上，对感染人IL－2重组腺病毒的人肺腺癌细胞（Anip973）的体外生物学特性进行研究。方法 将携带有人IL－2基因的重组腺病毒（rAd-hIL-2）感染人肺腺癌细胞系，通过细胞生长实验、克隆形成实验、流式细胞分析、形态学检查等观察其对Anip973肿瘤细胞的作用；利用PCR和琼脂糖电泳对肺癌中人IL－2基因进行了检测。结果 rAd-hIL-2经扩增、纯化后，滴度可达10^10PFU/ml，当病毒为30MOI时，对Anip973细胞的转染率达90％以上。转染的Anip973肿瘤细胞除表面结构和超微结构有轻微变化外，其生长能力、克隆形成率及细胞周期等无明显变化。结论 腺病毒介导的细胞因子基因hIL-2转染的Anip973肿瘤细胞未见明显变化。     

Experimental study on the antitumor effect of mouse B7-1 gene

ＴｗｏｓｉｇｎａｌｔｈｅｏｒｙｆｏｒＴｃｅｌａｃｔｉｖａｔｉｏｎｐｒｏｖｉｄｅｄａｎｅｗａｐｐｒｏａｃｈｆｏｒｔｕｍｏｒｇｅｎｅｔｈｅｒａｐｙ［１－２］．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙｍｏｌｅｃｕｌｅｇｅｎｅｉｎｔｒａｎｓｆｅｃｔ...     

HEffects of adenoviral vector-mediated transduction of human p53, B7-1 and GM-CSF genes on liver cancer cells

Hepatocarcinomaisoneofthemostcommonmalignancieswithpoorprognosis.Itafflictsabout1.25milIionpeopleworldwide.ThereareatleastlOOOoomorbidityand1lOOOOmortalityeachyearinChinaLl].Althoughmultipletreatmentmodali-tieshavebeenappliedtolivercancer[2],thecancerremainsoneofthetumorsthataredifficulttobecured.Itbecomesevenmoredifficulttobecuredwhenmultiplefocioftumoranddistantmetastasisoccur[a]-Sincethemajorityofpatientswithlivercancerarenotcandidatesforcurativesurgery,chemotherapyandradiotherapy['J,t…     

Preliminary study on the cooperation of IL-6 and mB7-1 in the induction of effective antitumor immunityin vitro

Summary To find a new way for gene therapy against tumors with weak immunogenicity, the effect of mB7-1 costimulation alone, or combined with IL-6, in inducing antitumor immunityin vitro was investigated. It was found that mB7-1 cD-NA transfected B16 cells (B16-mB7-1) induced the expansion of effector lymphocytes and the generation of specific lytic activity more effectively than wild type B16 melanoma cells (B16-wt) or mock-transfected B16 cells (B16-neo) did. (P < 0. 01), IL-6 could effectively stimulate lymphocytes proliferation, but failed to enhance its cytotoxicity, while the combination of mB7-1 and IL-6 increased both lymphocyte proliferative response and T-cell-mediated cytotoxicity more significantly than B7-1 or IL-6 did alone (P<0. 01). It was inferred that the costimulatory molecule B7-1 is required for the activation and proliferation of T lymphocytes; the expression of mB7-1 in tumor cells could increase their immunogenicity and induce effective antitumor immune response, and the combination of B7-1 and IL-6 could induce more effective antitumor immunity, indicating that cooperation of IL-6 and mB7-1 plays a role in T lymphocyte activation. This project was supported by a grant from National Educational Committee Foundation of China (No. JW 9312).     

慢性乙型肝炎肝组织B7-1、Fas的表达

目的了解慢性乙型肝炎(chronichepatitisB,CHB)肝组织B7-1、Fas的表达特点及关系。方法采用免疫组织化学方法,对30例CHB患者肝活检组织B7-1、Fas的表达进行了对比观察。结果CHB肝组织B7-1、Fas的表达部位相似,Fas的表达强度与B7-1的表达强度呈显著正相关,其相关系数为:γ=0.79(P<0.01)。结论B7-1可能参与了CHB患者Fas/FasL介导的肝细胞凋亡过程。     

Induction of anti-hepatoma immunity by recombinant retrovirus expressing B7-1 /B7-2 costimulatory molecules

The effechve activation of ttllnor-specific T cellsPlays a pivotal mle in anti-tUInor inUnwhty. As we haVeknown, T cell elevation ~ires 2 distinct signalingevents. The fial signal is derived from the binding of Tcell receptor (TCR) tO itS antigen-MHC complex, whichspeCified foe inteedon between T cells and talget cells.The seCOnd signal is delivend by accessory or costilnulatory moleCules such as CD28, LFA-l, ICAM-l, and so.Llj. The moSt ~rtant among them is CD28, whichhas been d…