双黄连片对小鼠流感病毒和腺病毒感染的保护作用

目的观察双黄连片在实验动物体内抗流感病毒和腺病毒的作用,为临床用药提供试验依据。方法建立流感病毒鼠肺适应株FM1感染小鼠模型和腺病毒ADV3株感染小鼠模型,分别灌胃给予高、中、低剂量双黄连片,设立病毒唑对照和正常对照组,观察各组小鼠的死亡数、测定小鼠存活时间、肺指数和肺组织流感病毒滴度。结果双黄连片可明显降低流感病毒和腺病毒感染小鼠的死亡率,延长肺炎小鼠的存活时间,降低肺炎小鼠的肺指数;同时,双黄连片还能降低肺组织中流感病毒的滴度。结论双黄连片在小鼠体内有明显抑制流感病毒和腺病毒的作用。     

美国rDNA疫苗能有效对抗H5N1流感病毒

美国匹兹堡大学的研究者公布：早期试验数据肯定地显示，重组流感疫苗比标准疫苗起效更快，并能在流感大流行时使用。研究者称，此疫苗的生产是通过使用一种腺病毒对2003～2005年间越南爆发的致死性人H5N1禽流感株的全部或部分血凝素蛋白进行表达来完成的。动物试验显示，小鼠和鸡皮下注射此疫苗能完全对抗致死性剂量的H5N1病毒，通常鸡暴露于H5N1病毒的致死率几乎为100％。而接种不含H5N1基因的腺病毒疫苗的动物则全部死亡。     

携带hIGF-Ⅰ基因的腺病毒载体构建

目的 探讨构建携带hIG-Ⅰ基因腺病毒载体的可行性.方法 从pcDNA 3.1-hIGF-Ⅰ质粒中克隆出hIGF-Ⅰ基因的编码序列,酶切、连接后,插入腺病毒系统中的穿梭载体pAdshuttle-CMV,获得重组质粒pAdshuttle-CMV-hIGF-Ⅰ,将其转化含有腺病毒骨架载体pAdeasy-1的大肠杆菌BJ5183,进行同源重组,获得重组子pAdeasy-1-IGF-Ⅰ.鉴定后,将pAdeasy-1-IGF-Ⅰ转染人胚肾细胞(Ad293细胞),获得含hIGF-Ⅰ基因的重组腺病毒(rAd-hIGF-Ⅰ).再鉴定后,Ad293细胞反复感染冻融扩增腺病毒,50%组织培养感染量法(TCID50)检测病毒滴度.将病毒颗粒感染绿猴肾成纤维细胞(COS-7细胞),荧光显微镜观测绿色荧光蛋白(GFP)的表达,RT-PCR分析hIGF-Ⅰ基因在mRNA水平的表达,Western blot分析hIGF-Ⅰ在蛋白水平的表达.结果 成功构建出含有hIGF-Ⅰ基因的腺病毒载体rAd-hIGF-Ⅰ,转染COS-7细胞后发现绿色荧光蛋白表达,同时RT-PCR扩增出318 bp的目的 条带,Western blot得到7.6kDa大小的同的蛋白,证明了腺病毒载体rAd-hIGF-Ⅰ能成功转染COS-7细胞,hIGF-Ⅰ基因能在其中成功表达.结论 成功构建出含有hIGF-Ⅰ基因的腺病毒载体rAd-hIGF-Ⅰ,并且证实其能对COS-7细胞进行有效转染,为组织工程软骨的进一步改良提供了高效的基因载体.     

血管抑素k1-5转基因治疗Ⅱ型胶原蛋白诱导的鼠关节炎

目的：探讨腺病毒介导的血管抑素k1-5对Ⅱ型胶原蛋白诱导的鼠关节炎的治疗作用.方法：在体外验证表达血管抑素k1-5的腺病毒载体对血管内皮细胞的抑制作用的基础上,将其应用于胶原蛋白诱导的关节炎鼠模型,以探讨其对关节炎的治疗作用,以临床评分和爪厚度来评价治疗效果.结果：鼠腹腔内注射表达血管抑素k1-5的腺病毒载体能显著降低关节炎鼠模型临床评分及爪厚度（P＜0.05）.结论：本试验初步证实表达血管抑素k1-5的腺病毒载体能明显改善Ⅱ型胶原蛋白诱导的鼠关节炎,可作为关节炎治疗的有效途径.     

腺病毒载体用于基因治疗的研究进展

基因治疗作为一种新兴的医疗手段,为人类疾病治疗开辟了一条新的途径.基因治疗最关键的问题之一是要选择合适的载体以使治疗基因安全、高效地导入靶细胞.腺病毒(adenovirus, Ad)因具有诸多优点而作为基因治疗中应用最广泛的运载工具,特别是用于肿瘤基因治疗,然而其缺点在一定程度上限制了作为载体的应用.近几年来,随着对腺病毒分子结构与感染机制的进一步深入研究,人们对原有的腺病毒载体进行了一些改进,取得了很好的效果.因此,如何能有机地结合多项改进策略,最大限度地提高腺病毒载体在今后临床应用中的高效性、安全性将是未来研究的重点.本文就基因治疗中腺病毒载体的特点以及改造取得的一些进展做一综述.     

N-乙酰转移酶影响食管癌细胞生物学功能的研究

目的 通过构建N-乙酰转移酶基因(NAA10)腺病毒表达载体,探讨其对食管癌细胞TE-1增殖、细胞周期和凋亡的影响.方法 PCR技术扩增NAA10全长编码基因,通过重组腺病毒表达系统将其克隆入pShuttle-IRES-hrGFP-1穿梭载体,重组腺病毒表达载体并包装腺病毒颗粒Ad-NAA10.将携带人NAA10基因的腺病毒感染食管癌细胞TE-1,Western blot检测NAA10蛋白的表达,CCK-8检测其对TE-1细胞增殖的影响,碘化丙啶(PI)染色检测其对TE-1细胞周期的影响,Hoechst/PI双染检测其对TE-1细胞凋亡的影响.结果 酶切鉴定和测序证实NAA10腺病毒表达载体构建成功,腺病毒颗粒Ad-NAA10能在TE-1细胞中正常表达;NAA10可以抑制TE-1细胞的增值,影响细胞周期分布,促进细胞凋亡.结论 NAA10通过G1期阻滞和诱导凋亡从而抑制食管癌细胞的增殖,为进一步确定食管癌特异性生物标志物及探讨食管癌发病机制奠定基础.     

腺病毒载体研究新进展

与其他真核基因表达载体相比,腺病毒载体在基因治疗方面已显示出独特优越性,并被广泛研究和应用.但由于未经改进的腺病毒载体往往诱导机体产生破坏性细胞免疫应答,从而导致重组腺病毒在体内表达短暂.近年来,一些新型腺病毒载体和宿主细胞系相继问世,腺病毒载体在基因治疗方面的应用也日益广泛,并成为基因治疗研究的焦点之一.一些进展主要表现在尽可能缺失更多的腺病毒基因并建立相应的互补细胞系.本文就近年来腺病毒载体的最新研究进展作一介绍.     

人SET基因重组腺病毒载体在小鼠颗粒细胞的表达

目的 以原代培养的小鼠卵巢颗粒细胞为模型,观察人SET基因重组腺病毒载体在卵巢颗粒细胞的感染效率和基因表达效果.方法 分离并培养小鼠颗粒细胞.扩增人SET基因重组腺病毒载体AdCMV-SET和对照重组腺病毒载体AdCMV,感染原代培养的小鼠颗粒细胞,通过观察绿色荧光蛋白(GFP)检测感染效率;qRT-PCR方法检测SET mRNA表达;Western blot方法检测SET蛋白的表达水平.结果 获得的重组腺病毒载体体外感染小鼠颗粒细胞,24 h观察到GFP表达.与AdCMV感染组相比,AdCMV-SET感染组SET mRNA表达水平显著增高(P＜0.05).与空白对照组(Mock)及感染AdCMV组相比,AdCMV-SET感染组SET蛋白水平显著增高(P＜0.05).结论 构建的人SET基因重组腺病毒载体能高效感染小鼠颗粒细胞、并有效表达,对细胞活率无影响.     

SARS疫苗动物试验

美国匹兹堡大学医学中心的研究人员研制出重组的严重急性呼吸道综合征( SARS)冠状病毒疫苗 ,并在动物模型中进行了试验。这一结果可能很快促成 SARS疫苗的人体试验。　　匹兹堡大学医学院和公共卫生研究院的科研人员与美国疾病控制和预防中心的合作研究表明 ,腺病毒载体疫苗能诱导 SARS-冠状病毒 ( SARS- Co V)特异性 T细胞和病毒中和抗体应答。本研究是首次公开报道的 SARS疫苗研制工作。　　研究人员将三种 SARS- Co V载体联合肌肉注射 6只恒河猴。另 2只恒河猴免疫相同剂量的空腺病毒载体 ,作为对照。 2 8天后 ,动物接受第 2…     

《解放军医药杂志》投稿须知

1 溶瘤腺病毒载体平台 近年来,溶瘤腺病毒因其创新性和疗效成为肿瘤治疗领域的热点.通常溶瘤腺病毒以人5型腺病毒(AdHu5)为载体,但人群中普遍存在AdHu5的中和抗体,影响其疗效,且AdHu5的Hexon蛋白与血液中的凝血因子X结合,导致该腺病毒在肝脏累积,影响AdHu5的肿瘤靶向性.因此,溶瘤腺病毒的效能和靶向性有待进一步提高和完善.由于黑猩猩型腺病毒如AdC7在人群中很少流行,人群中一般不存在相应的中和抗体,不会被针对AdHu5的抗体所中和,AdC7的Hexon蛋白也不与凝血因子X结合.因此,AdC7可发展为一种理想的溶瘤腺病毒载体平台.     

应用噬菌体随机肽库筛选腺病毒模拟肽的研究

目的探讨模拟腺病毒表位肽的噬菌体对该病毒感染Hela细胞的保护作用,以便为研制防治腺病毒感染的新型疫苗奠定基础.方法用3型腺病毒中和抗体筛选噬菌体随机六肽库,经3轮筛选后,随机挑取了21个噬菌体克隆,扩增后分别加入3型腺病毒感染的Hela细胞.用结晶紫染色法观察Hela细胞的病变程度. 结果10/21个克隆噬菌体短肽对3型腺病毒感染Hela细胞具有保护作用.结论噬菌体表面的短肽可以模拟中和抗体相关的腺病毒表位,对3型腺病毒感染Hela细胞有一定的保护作用.     

同时给予包有肠溶衣的4,7和21型腺病毒活疫苗的安全性和免疫原性

在军事训练中心发现多数发热性急性呼吸道疾患(ARD)是由腺病毒引起的,4型腺病毒(ADV-4)和7型腺病毒(ADV-7)是引起ARD的主要血清型,常规应用包有肠溶衣的ADV-4和ADV-7活疫苗能显著降低ARD的发病率。21型腺病毒(ADV-21)也与     

利用Gateway技术构建重组腺病毒pAd-NK4

目的利用Gateway技术构建含人肝细胞生长因子(HGF)NK4基因的重组腺病毒载体。方法以含有HGF/NK4基因的质粒为模板PCR扩增NK4基因,将回收的NK4PCR产物片段克隆至腺病毒穿梭载体pYr-adshuttle-6获得重组质粒pYr-adshuttle-6-NK4。从该重组质粒上,利用LR同源重组将NK4-IRES-EGPF表达框转移至腺病毒骨架质粒pAD/BL-DEST,获得重组腺病毒质粒pAd-NK4-IRES-EGFP。该质粒经pacI线性化后转染293包装细胞,获得重组腺病毒rAd-NK4-IRES-EGFP。采用TCID 50(tissue cell infectiousdosage 50,TCID 50)法测定重组腺病毒滴度。重组腺病毒分别经酶切和PCR等方法进行鉴定。荧光显微镜观察转染效果。结果证实腺病毒载体中含有NK4基因的目的片段;病毒滴度为6.3×1011 PFU.L-1;荧光显微镜发现该重组腺病毒能在HEK293细胞中高效的表达。结论利用Gateway技术可以快速地构建同时表达NK4蛋白和绿色荧光的重组腺病毒,为下一步开展关于NK4基因的肿瘤治疗提供了基础。     

质粒DNA同源重组法构建腺病毒载体hosm

目的 构建含hosm基因的重组腺病毒载体,观察其对肿瘤细胞生长的影响。方法 用脂质体介导的粒DNA同源重组方法构建含人osm基因的重组缺陷型腺病毒载体,用PCR法鉴定所构建的ad—hosm载体。结果 成功构建了含hosm基因的重组腺病毒载体。结论 脂质体介导的质粒DNA同源重组法能有效构建重组腺病毒栽体;PCR法简化了阳性重组腺病毒的鉴定程序,为进一步研究重组腺病毒介导人osm基因对肿瘤细胞的生物学活性的影响提供了条件。     

在小鼠中比较复制缺陷型腺病毒与Nyvac痘病毒疫苗载体的效力

近年来,在重组活疫苗的研究中越来越多地将腺病毒和痘病毒用作重组疫苗载体.作者对以两者为载体构建的重组活疫苗免疫小鼠后的效力进行了比较.实验选用能引起小鼠致死性感染的伪狂犬病病毒(PRV)为攻击病毒,将能诱生中和抗体的PRV糖蛋白gD基因分别与复制缺陷型腺病毒和Nyvac痘病毒组建成重组疫苗Ad-gD和vP900.两种重组疫苗分别以不同剂量[10~(2.9)～10~(8.9)半数组织培养感染量     

5-LO表达对铝盐致海马神经元损伤的影响

目的观察5-LO表达对铝盐致原代培养海马神经元损伤的影响。方法将5-LO过表达重组体腺病毒(Ad5-LO)和5-LO RNAi重组体腺病毒(Ad5-LO-RNAi)转染原代培养7 d的海马神经元,实验随机分为7组:空白对照组(NaCl 200μmol.L-1)、空载腺病毒组(MOI=100)、5-LO过表达腺病毒组(MOI=100)、5-LO RNAi腺病毒组(MOI=100)、空载腺病毒(MOI=100)+铝盐负荷组(AlCl3200μmol.L-1)、5-LO过表达腺病毒(MOI=100)+铝盐负荷组(AlCl3200μmol.L-1)、5-LO RNAi腺病毒(MOI=100)+铝盐负荷组(AlCl3200μmol.L-1)。采用荧光显微镜观察海马神经元形态变化,以RT-PCR和Western blot方法分别检测神经元5-LO mRNA和蛋白表达,以MTT测定和LDH漏出率检测神经元存活情况,以生化方法测定海马神经元SOD活性和MDA含量变化。结果空载腺病毒+铝盐负荷组神经元数目明显减少,胞体萎缩,突起减少变短,5-LO mRNA和蛋白表达增多,MTT值降低,LDH漏出率增多,SOD活性降低,MDA含量增加。与空载腺病毒+铝盐负荷组比较,5-LO过表达腺病毒处理使铝盐负荷神经元上述指标的变化更加明显;5-LO RNAi腺病毒处理能明显阻遏铝盐负荷组海马神经元上述指标的变化。结论 5-LO过表达可增加大鼠海马神经元对铝盐损伤的易感性,而抑制5-LO表达能够减轻铝盐对大鼠海马神经元的损伤。     

LR重组法构建重组腺病毒rAd5-Vpr

目的:构建携带HIV-1Vpr基因的重组腺病毒。方法:采用限制性内切酶消化和T4DNA连接酶连接的方法,将Vpr基因克隆至腺病毒穿梭质粒pTrack-C上,然后通过重组穿梭质粒pTrack-C-Vpr和腺病毒骨架质粒pAdeno体外LR位点特异性重组的方法,将Vpr基因转移至腺病毒骨架质粒pAdeno上,最后重组骨架质粒pAdeno-Vpr鉴定正确后经PacI酶切,转染HEK293细胞,包装成重组腺病毒rAd5-Vpr。同时在HEK293细胞中进行病毒扩增,利用PCR方法对重组腺病毒进行鉴定,用微量全细胞病变法检测病毒滴度。结果:PCR鉴定重组腺病毒rAd5-Vpr构建成功;扩增后检测病毒滴度约为5×108PFU/mL。结论:应用LR重组法能成功构建携带HIV-1 Vpr基因的重组腺病毒,扩增后滴度能满足实验需要,为进一步相关研究的开展奠定了基础。     

重组腺病毒介导的前列腺癌基因治疗研究进展

前列腺癌的基因治疗已逐渐成为研究热点。载体系统是基因治疗的基础。目前,腺病毒载体在前列腺癌基因治疗中应用最为广泛。溶瘤腺病毒的研究进展为前列腺癌基因治疗开辟了新的途径。近年研究表明,溶瘤腺病毒单独使用或与治疗基因联合应用,能够有效发挥抗肿瘤效应。治疗基因是发挥功能的关键因素。自杀基因能将药物转化为毒性代谢产物,细胞因子能增强抗肿瘤免疫效应,血管生成抑制因子能抑制血管生成,凋亡相关分子能诱导细胞凋亡,这些基因在前列腺癌的基础和临床研究中均表现出一定的肿瘤生长抑制作用。本文对重组腺病毒介导的前列腺癌基因治疗基础及临床研究进展进行综述。     

The construction of recombinat adenovirus vector expressing survivin-related microRNA-494 gene

目的 构建表达生存索(survivin)相关rnicroRNA-494基因的重组腺病毒载体.方法 应用生物学软件Targetscan 5.2对microRNA-494基因与survivin mRNA作相关性分析.RT-PCR调取目的基因,将其连接线性化后的穿梭质粒载体,联合骨架质粒转染入293细胞后同源重组产生重组腺病毒载体.PCR及测序验证重组质粒,荧光显微镜下观察腺病毒荧光蛋白表达.结果 重组腺病毒载体构建成功.结论 成功构建了重组腺病毒载体,可用于研究其在前列腺癌PC-3细胞中对survivin基因表达的影响.     

腺病毒载体在病毒性疫苗中的研究进展

基于腺病毒载体安全性好、诱导体液和细胞免疫效率高、容纳外源基因片段大、易于大规模培养等优点,其为构建新型疫苗提供了新的思路与手段.此文简要综述了腺病毒的生物学特性、腺病毒载体的构建策略、以腺病毒为载体构建病毒性疫苗的研究现状和目前存在的问题等,重点介绍了已经进入临床试验的腺病毒载体病毒性疫苗的研究进展.