间接抗原递呈途径在同种异体表皮细胞移植排斥反应中的作用研究

目的　探讨间接同种异型识别在体外培养的同种异体表皮细胞移植排斥反应中的作用。方法　体外分离培养人表皮细胞 (Epidermalcells ,EC)、异体人外周血淋巴细胞 (Peripheralbloolymphocytes ,PBL)和单个核细胞 (Peripheralbloodmononuclearcells ,PBM ,含单核细胞 )。将毒性T淋巴细胞相关抗原 4(CTLA4Ig)腺病毒载体转染EC。转染与未转染的EC中均加入异体PBL或PBM共同培养 ,应用氚标记胸腺嘧啶脱氧核苷 ( 3H TdR)掺入法 ,测定各培养系中PBL、PBM增殖情况。结果　CTLA4Ig腺病毒载体能成功转染EC并表达相应蛋白。未转染的EC刺激异体PBL轻度增殖 (P <0 .0 5 ) ,以及刺激含单核细胞的PBM明显增殖 (P <0 .0 1) ;经CTLA4Ig腺病毒载体转染的EC刺激PBL、PBM增殖则明显减弱 (P <0 0 5 )。结论　间接同种异型识别在EC排斥中发挥了重要作用 ,CTLA4Ig能明显减轻该作用。     

~(60)Co照射后小鼠表皮Langerhans细胞的变化及对异体植皮的影响

本实验用~(60)Co照射Blab/c小鼠,照射后1天与3天取背部皮肤。(1)经ATP酶染色方法,显示表皮Langerhans细胞(LC),观察其ATP酶含量的变化、形态变化及其在表皮的密度改变;(2)免疫组分染色方法,观察Ia阳性LC的密度改变及形态变化;(3)电镜观察其超微结构的变化;(4)同时进行异体皮肤移植,观察皮片存活期的变化。结果:经~(60)Co照射后,小鼠表皮LC形态功能受到不同程度的损害,其密度减少,表达Ia抗原功能下降。认为这是异体植皮后移植物存活期延长的主要原因。     

含转表皮细胞生长因子基因人表皮细胞复合皮的构建与移植

目的探讨转染表皮细胞生长因子(EGF)基因的人表皮细胞移植后EGF的表达及对细胞增殖的影响。方法将Balb/c小鼠的表皮细胞和转染EGF基因的人表皮细胞按1∶1、1∶3、1∶5的比例混合,种植于脱细胞真皮替代物表面,于体外培养后形成复合皮,将复合皮移植于Balb/c小鼠全层皮肤缺损创面,抗EGF抗体免疫组织化学染色观察移植后EGF的表达,抗增殖性细胞核抗原(PCNA)免疫组织化学染色观察表皮细胞的增殖情况。结果小鼠表皮细胞与转EGF基因的人表皮细胞按1∶5混合构建的复合皮移植后1～2周,抗EGF染色阳性,1周时,新生表皮基底层中PCNA阳性细胞比含单纯小鼠表皮细胞的复合皮移植后显著增多(P<0.01)。结论转染EGF基因的人表皮细胞在移植后早期可表达外源基因产物,并促进表皮细胞增殖。     

外用环孢素A对异体移植鼠耳郎格罕细胞的影响及延长存活的实验研究

目的　研究外用CsA抑制表皮郎格罕细胞抗原递呈功能而延长异体复合组织移植存活的机制。方法　以BN鼠为供体、Lewis鼠为受体进行吻合血管的异体耳廓移植 ,术后于移植耳皮肤表面连续外涂CsA1周 ,观察移植物的排斥反应及存活时间 ,ATPase染色检测表皮LC形态及数量变化。结果　CsA治疗组移植耳廓表皮LC数量较对照组明显减少 ,胞体缩小变形 ,边界不清 ,树突变短消失 ;移植物排斥反应减轻 ,平均存活时间为 18 2± 2 1d ,对照组平均存活 7 8± 1 7d。结论　外用CsA影响表皮LC抗原递呈功能 ,有效抑制异体复合组织移植排斥反应并在诱导耐受中发挥作用     

异体表皮与异体复合皮移植的初步观察

目的：对比研究非培养的异体表皮与培养的异体表皮细胞膜片，以及异体真皮交叉移植于ＳＤ大鼠与Ｗｉｓｔａｒ大鼠后是否产生免疫排斥反应。方法：采用大体观察、组织学检查，和混合淋巴细胞反应。结果：非培养的异体表皮移植，培养的异体表皮细胞膜片单独移植，以及与异体真皮重组移植后均产生免疫排斥反应，三者出现排斥坏死的平均时间分别为１０．５ｄ，１２．０ｄ，１５．８ｄ，异体真皮能存活３０ｄ以上。结论：异体表皮抗原性强     

异体皮肤移植后MIP-3α的表达及其抗体延长存活的研究

目的　研究异体皮肤移植后表皮MIP 3α的表达及其抗体延长移植皮肤存活的作用。方法　进行同种异体小鼠皮肤移植 ,免疫组化测定移植皮肤组织内MIP 3α的表达 ;局部应用MIP 3α抗体 ,观察其对移植皮肤存活的影响。结果　移植术后表皮MIP 3α表达增加 ,分别于术后 2 4h及第五天出现两个高峰 ,真皮及其皮下组织未见MIP 3α的表达 ;异体皮肤平均存活时间为 (7 5± 0 9)d ,MIP 3α单抗局部注射 1μg/ml治疗组存活 (8 3± 1 2 )d ,与对照组相比无明显差异 (P >0 0 5 ) ;10 μg/ml组与 5 0 μg/ml组分别为 (15 3± 2 3 )d与 (2 1 8± 1 6)d ,二者均显著延长移植皮肤的存活时间 (P <0 0 1)。结论　异体皮肤移植后表皮MIP 3α分泌增加 ,促进郎格罕细胞的迁移以进行抗原递呈 ,是移植排斥反应启动与进展的重要因素 ;应用MIP 3α抗体可有效延长异体移植皮肤的存活     

体外培养人表皮细胞的实验研究

太面积Ⅲ度烧伤病人必须经植皮封闭倒面方可治愈。植同种或异种皮肤虽可暂时覆盖创面，但存在免疫排异反应。大张异体皮打洞嵌入自体皮和微粒植皮法的出现，大大的提高了大面积Ⅲ度饶伤病人的成活率，但在自体皮源不足的情况下，短期内迅速封闭创而仍是一个棘手的问题，J.G．Rheirrwala出和H．Green成功地培养出人表皮细胞与O’Corner体外培养人皮肤移植成功，为治疗大面积重度烧伤病人提供了一个新选径。近期我室培养出第一代人表皮细胞，并利用培养的表皮细胞初步进行了基础和临床实验研究。现将培养方法与结果报告如下。     

TGF-β1、IL-10在门静脉预输注供者凋亡脾脏细胞大鼠移植心脏模型中的表达

目的 输注供者凋亡细胞建立大鼠同种异体心脏移植模型,探讨凋亡细胞诱导免疫耐受的作用机制.方法 实验动物分为3组:A组为对照组;B组为实验组,心脏移植前经门静脉输注供者来源的凋亡脾脏细胞;C组为免疫抑制剂组,移植前后给予CsA.观察各组移植心脏存活时间,组织病理学改变,血清IL-2、IL-10及TGF-β1含量,并通过单向混合淋巴细胞培养判定耐受是否具有抗原特异性.结果 B组移植心脏存活时间较A组显著延长,排斥反应程度减轻,受者对供者产生抗原特异性耐受;C组移植心脏存活时间最长,但其免疫抑制作用缺乏抗原特异性.在心脏移植术后B组血清中IL-2水平较对照组显著降低,而IL-10及TGF-β1显著升高.结论 通过预输注供者凋亡细胞的方法可以诱导大鼠同种异体心脏移植的免疫耐受,并且此种耐受具有抗原特异性.IL-10及TGF-β1在此过程中可能起着重要作用.     

人-鼠间同种和异种混合淋巴细胞反应的对比

目的:对比体外人外周血淋巴细胞对于小鼠细胞和同种异体细胞混合淋巴细胞反应. 方法:建立异种-同种混合淋巴细胞反应模型,进行分类细胞反应试验. 结果:人T淋巴细胞对于小鼠细胞的反应明显低于对于同种异体细胞的反应. 细胞分类研究显示:在异种混合淋巴细胞反应中,主要是CD4 T细胞通过间接途径受小鼠抗原刺激而增殖;在同种异体细胞混合淋巴细胞反应中,主要是CD4 细胞通过直接途径受同种异体细胞抗原刺激而增殖. 在两种混合淋巴细胞反应中,CD8 T细胞也增殖. 结论:异种混合淋巴细胞反应弱于同种混合淋巴细胞反应. 同种和异种混合淋巴细胞反应均需要抗原提呈细胞参与. 同种混合淋巴细胞反应中存在直接和间接两种途径;异种混合淋巴细胞反应中只存在间接途径.     

FasL基因修饰骨髓树突状细胞诱导小鼠心脏移植免疫耐受的实验研究

目的:探讨FasL基因转染骨髓来源树突状细胞术前免疫受者在诱导同种小鼠心脏移植耐受中的作用.方法:采用腺病毒载体将FasL基因转染骨髓来源树突状细胞,将基因修饰的DC经尾静脉输入预处理BALB/c受者小鼠,观察移植心脏的存活时间,通过混合淋巴细胞反应(MLR)检测抗原特异性T淋巴细胞的低反应性.结果:AdFasL-DC组移植心脏存活期为21.5±2.5天,Day-7-DC和LacZ-DC处理组移植心脏存活时间为9.5±1.5天和10.0±2.0天,FasL-DC术前免疫受者可使同种移植物存活时间明显延长(P＜0.05);MLR结果显示FasL-DC处理组与对照组相比显著地抑制了T淋巴细胞的增埴(P＜0.05).结论:FasL基因转染DC能够诱导同种反应性T淋巴细胞凋亡,术前免疫受者能使同种移植物存活时间得到延长.     

A Study on Changes of Langerhans Cells in Human Epidermal Cell Culture

Human epidermal cells (ECs) were grown in vitro from normalhuman foreskin and the changes of Langerhans cells (LCs) within theoriginal explants and the epidermal outgrowth were observed in culturewith ATPase staining, HLA - Dr monoclonal antibody indirectimmuno-fluorescence and enzyme labelling avidin-biotin complex (ABC)staining. The capacity of ECs to stimulate the proliferation of allogeniclymhocytes was tested in the mixed skin-lymphocyte culture response(MSLR). The ATPase HLA-Dr positive LCs were gradually decreasedand significantly deformed within the original explants in culture. 70% ofLCs was decreased 3 days after culture. 90% of LCs was lost and the LCsremained in the original explants were only seen their outline 7 days afterculture. LCs approximatively disappeared within the original explants 14to 21 days after culture. The ATPase, HLA - Dr positive LCs have neverbeen found within the epidermal outgrowth. The ECs which were freshlyisolated from skin explants potently stimulated the proliferation ofallogenic lymphocytes in the MSLR. The ECs which were separated fromthe original explants after 3 days of culture were significantly declinedtheir ability to stimulate the proliferation of allogenic lymphocytes in theMSLR. The ECs separated from the original explants after 7 days ofculture were lost their ability to stimulate the proliferation of allogeniclymphocytes in the MSLR. The ECs separated from the epidermaloutgrowth failed to stimulate the proliferation of allogenic lymphocytes inthe MSLR. These results suggested that the ECs grown in our culturesystem were declined their immunogenety of skin allografts.     

异体皮覆盖自体微粒皮治疗Ⅲ度烧伤的病理学研究

目的了解断层的异体皮作为生物敷料与自体微粒皮移植治疗大面积深度烧伤中异体皮的表皮层与真皮层的作用,以期为合理利用和加工异体皮提供参考。方法取复温后及移植后５～３０ｄ的异体皮标本,少数病例同时获取异体皮下面的组织,石蜡切片、ＨＥ、Ｍａｓｏｎ、ＰＡＳ染色,光镜观察。结果异体皮移植后５ｄ其表皮层细胞出现泡状变性,逐渐与真皮层分离,形成水泡,然后剥脱。来源于创面的毛细血管长入异体真皮,并有炎症反应。手术后１～２ｗ,存活的自体微粒皮的表皮细胞在异体皮下方开始扩展,伴有新生的小血管。最后,异体真皮形成痂皮脱落,其下面新生的表皮覆盖创面。结论异体皮覆盖烧伤创面后其表皮层很快出现泡状变性,形成水泡,溶解剥脱,因此在烧伤创面覆盖中不会起主要作用。起更大作用的是异体真皮,它不仅覆盖创面,而且当毛细血管长入异体真皮时可以为其下方的自体微粒皮的增殖和扩展提供营养环境。所以,在异体皮的制备过程中,不应该把断层后的真皮深层丢掉,而应该将其收集保存予以利用。     

体外诱导骨髓基质干细胞向内皮细胞分化的实验研究

目的：探讨成体骨髓基质干细胞体外定向诱导分化为内皮细胞的可行性，为心血管组织工程提供新的种子细胞来源。方法：骨髓穿刺抽取绵羊骨髓液，密度梯度离心法获取骨髓单个核细胞，通过贴壁培养纯化骨髓基质干细胞。以含EGF、bFGF、IGF和肝素的M199培养液培养原代细胞，并以VEGF诱导骨髓基质干细胞向内皮细胞分化。通过CD34、CD31流式细胞仪分析，免疫组化CD34、CD31、Ⅷ因子相关抗原染色鉴定内皮细胞，UEA结合实验及NO含量测定评价内皮细胞功能。结果：骨髓基质干细胞表达α-SMA，不表达CD34和CD31。体外定向诱导2周后分化为内皮细胞。呈梭形，表达CD34和CD31及Ⅷ因子相关抗原，UEA结合试验阳性，并具有分泌NO的功能。结论：体外培养条件下骨髓基质干细胞能够分化为内皮细胞，并具有成熟内皮细胞的生物学特性和功能。     

N-乙酰半胱氨酸对负载主要组织相容性抗原的树突状细胞生物学特性的影响

目的研究N-乙酰半胱氨酸(NAC)对负载同种异基因MHC抗原的树突状细胞(DC)生物学特性的影响。方法用GM-CSF IL-4定向诱导BALB/c小鼠骨髓细胞分化为DC,观察在负载MHC抗原时加入NAC对DCI-Ad和CD86mRNA的表达和刺激T细胞增殖能力的影响,及其延长同种异基因小鼠皮肤移植物存活时间的效果。结果在NAC作用下,负载MHC抗原的DCI-Ad和CD86mRNA表达水平降低;经NAC处理后,负载MHC抗原的DC刺激T细胞增殖的能力降低;小鼠皮肤移植术前用经NAC处理的负载供者MHC抗原的DC注射到受者体内,可延长移植皮片存活时间。结论NAC可抑制同种异基因MHC抗原对DC的促成熟作用,有利于诱导小鼠皮肤移植免疫耐受。     

人表皮细胞培养及同种移植方法的研究

目的：为解决大面积烧伤及其它创伤性皮肤缺损创面覆盖问题，我们对人表皮细胞培养法及同种移植进行了研究。方法：采用细胞悬液培养及组织块培养方法对人表皮细胞进行了培养并对其临床同种移植进行了探讨。结果：组织块培养法皮片形成率为５４．１７％，细胞悬液培养法皮片成活率为４９．０５％，皮片形成率虽然不够理想，但我们的细胞悬液培养法皮片成活率比以前的方法大大提高。临床同种移植皮片共５２片，成活２３片。随访最长者达１５个月，皮片仍存活且无排异现象。结论：两种表皮细胞培养法简便、可行，提高了皮片形成率。表皮细胞皮片同种移植组织能在体内继续生存     

大鼠树突状细胞的体外扩增与初步鉴定

目的建立体外诱导和扩增大鼠骨髓树突状细胞(DCs)的方法，并进行生物学鉴定。方法大鼠骨髓细胞经贴壁去除悬浮细胞，加入细胞因子(IL-4和GM—CSF)培养2周。经过先镜，透射电镜观察培养DCs的形态学特征；通过同种T细胞混合培养，采用MTT比色分析法测定不同浓度的DCs发同种T细胞增殖的能力。结果培养的DC胞浆突起大而长，呈树突状，具有DCs的典型形态，并且具有强烈的激发同种异体T细胞增殖的能力。结论采用大鼠骨髓细胞经贴壁去除悬浮细胞，加入细胞因子(IL-4和GM—CSF)序贯培养，能获得大量、较高纯度的DCs。     

鲍温样丘疹病皮损中朗格汉斯细胞与MCP-1的表达及意义研究

目的检测鲍温样丘疹病（BP）皮损中朗格汉斯细胞（LC）的分布与数量变化及单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）的表达,探讨它们在BP发病机制中的作用。方法采用免疫组化SP法检测36例BP患者皮损组织中CD1a+LC及MCP-1的表达情况,以皮损旁正常皮肤组织作为对照;并对CD1a+LC密度与MCP-1表达强度进行相关性分析。结果CD1a+LC主要见于表皮棘层的树突状细胞,MCP-1蛋白主要表达于表皮角质形成细胞。与皮损旁正常皮肤组织相比,BP皮损组织中CD1a+LC密度降低,分布不规则,胞体树突减少;MCP-1染色变弱,表达强度降低。BP皮损组织及皮损旁正常皮肤组织中CD1a+LC密度与MCP-1表达强度均呈正相关（r=0.372、0.384,均P＜0.05）。结论BP皮损表皮组织中LC密度下降,形态呈现变性改变,推测可能与皮损局部趋化LC并促进其分化成熟的趋化因子MCP-1表达降低有关,进而影响皮损局部LC的抗原递呈功能。     

兔正常膀胱移行上皮细胞的体外培养和鉴定

目的：摸索膀胱移行上皮细胞的合适培养条件，为建立满足组织工程需要的尿路上皮细胞体培养体系提供实验基础。方法：采用无血清培养系统，以组织块法原代培养兔正常膀胱移行上皮细胞并传代。动态观察细胞形态变化和生长增殖状况，进行免疫细胞化学染色鉴定细胞来源。结果：原代第4开始有上皮样细胞自组织块边缘长出，第10-14天汇合，呈典型铺路石样外观。2代超细胞生长4-7d后汇合，未发现成纤维样细胞混杂生长。细胞可传至6代以上。细胞角蛋白AE1/AE3单抗染色各代细胞均呈阳性反应。结论：分离培养的是单一的膀胱移行上皮细胞，细胞具有一定的增殖传代能力。     

以脱细胞角膜基质为载体的组织工程化兔角膜的构建及移植

目的进行体外分离和培养兔角膜缘干细胞,使之成为一种上皮组织,以便进行角膜移植。方法组织块法体外培养兔角膜缘干细胞：角膜缘组织块作为外植体,在脱细胞猪角膜基质上培养;获得的复合角膜上皮组织移植于兔眼,观察并记录兔角膜组织生长情况,待角膜组织生长良好后做免疫组织化学鉴定。结果兔角膜缘组织应用组织块法在脱细胞角膜基质上生长9~10 d后达到80%汇合状态,显微镜下动态观察细胞生长良好,增殖能力较高,将组织工程化角膜上皮作异体板层角膜移植于兔眼后,4~5 d角膜上皮光滑,20~21 d角膜变为透明,荧光素染色只见缝线处少许着色,期间未见角膜移植排斥反应。术后30 d HE染色显示角膜组织与宿主角膜组织结合良好,上皮细胞可见4~5层结构,可见角膜缘干细胞多呈卵圆形;免疫荧光染色可见培养的细胞P63、CK3单克隆抗体呈阳性表达。结论以组织块法生长的以脱细胞角膜基质为载体的组织工程化兔角膜可在角膜缘干细胞缺乏的兔眼上生长良好。