树突状细胞与尤文肉瘤细胞融合诱导抗肿瘤免疫应答的体外研究

目的检测尤文肉瘤细胞A673和树突细胞(DC)融合构建的肿瘤疫苗对尤文肉瘤细胞株A673的杀伤作用。方法应用促融合剂PEG对尤文肉瘤A673细胞和从外周血单个核细胞(PBMC)诱生的树突细胞进行融合。利用细胞因子hGMCSF和hIL4从PBMC诱生DC,并对其表型进行流式细胞仪(FCM)分析,红色荧光染料PKH26标记A673细胞,绿色荧光染料PKH67标记DC,应用促融合剂PEG融合后光镜及电镜观察DC细胞和融合细胞形态,FCM检测融合效率,通过同种混合淋巴细胞反应检测其免疫刺激活性。通过IFNγELISA法产生细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的量,通过51Cr细胞杀伤试验检测融合细胞对A673细胞的杀伤作用。结果FCM检测出从PBMC成功诱生出CD83、CD80、CD86及HLADR高表达的成熟DC。DCs/A673融合细胞的融合效率达到23%,同种混合淋巴细胞反应显示DCs/A673融合细胞有很强的免疫刺激活性。IFNγ分泌检测显示DCs/A673融合细胞组较对照组产生CTL水平显著增高。51Cr释放法检测融合细胞体外诱导抗原特异的CTL,融合细胞激活的CTL对肿瘤细胞系A673细胞的杀伤作用强于DCA673混合组、DC组、A673组的CTL(P<0.05),作用较对照各组显著增强。结论DC与A673细胞融合体外致敏自体T淋巴细胞能生成抗原特异CTL对尤文肉瘤细胞A673有一定的杀伤作用。     

尤文肉瘤基因免疫治疗的研究

目的检测尤文肉瘤融合基因EWSFLI1和人粒单核细胞集落刺激因子(hGMCSF)基因修饰的树突细胞(DC)疫苗对尤文肉瘤细胞株A673的杀伤作用。方法利用hGMCSF腺病毒(AdhGMCSF),在1000U/mlIL4作用下,从外周血单个核细胞(PBMC)诱生树突细胞(DC)并对其表型进行流氏细胞仪(FCM)分析,通过同种混合淋巴细胞反应以检测其免疫刺激活性。在lipofectamine的介导下,将含有尤文肉瘤融合基因EWSFLI1的真核表达质粒pCA13/EWSFLI1转染DC,通过RTPCR检测EWSFLI1的表达,并通过乳酸脱氢酶(LDH)释放试验检测其对A673细胞的杀伤作用。结果应用AdhGMCSF从PBMC成功诱生出CD83、CD80、CD86及HLADR高表达,CD14低表达的DC,其对同种淋巴细胞有很强的免疫刺激活性。pCA13/EWSFLI1转染DC后,RTPCR检测DC中有EWSFLI1mRNA的表达。杀伤试验结果表明,AdhGMCSF诱生、EWSFLI1修饰的DC,体外诱导抗原特异的CTL,效靶比为20∶1时对A673细胞杀伤率为(29.9500±0.0117)%,高于对照组(P<0.01)。结论AdhGMCSF能够成功地从PBMC中诱生出有功能的DC。真核表达质粒pCA13/EWSFLI1在lipofectamine的介导下转染AdhGMCSF诱生的DC,能在DC中有效地表达。此EWSFLI1基因修饰的、AdhGMCSF诱生的DC体外致敏自体T淋巴细胞,生成抗原特异CTL,对尤文肉瘤细胞A673有一定的杀伤作用     

树突状细胞融合瘤诱导抗结肠转移癌免疫应答

目的 检测结肠转移癌细胞SW620和树突状细胞（DC）融合构建的肿瘤疫苗对结肠转移癌细胞SW620及其同源结肠癌细胞SW480的杀伤作用。方法 应用促融合剂50％聚乙二醇（PEG）对SW620细胞和从外周血单个核细胞（PBMC）诱生的DC进行融合,用流式细胞仪（FCM）分析其表型并检测融合效率,电镜及免疫细胞化学观察DC、SW620和融合细胞（DC／SW620）形态;^51Cr释放法检测DC／SW620致敏CTL对SW620及SW480细胞的杀伤作用。结果 从PBMC成功诱生出高表达HLA-ABC、HLA-DR、CD80、CD86、CD83的成熟DC,DC／SW620的融合效率达到27．12％。融合细胞兼具DC与肿瘤细胞的结构特点及免疫表型。^51Cr释放法检测DC／SW620激活的CTL对SW620及SW480的杀伤作用强于各对照组（P〈0．01）。结论 DC与SW620细胞融合体外致敏自体T淋巴细胞能生成抗原特异CTL,对结肠转移癌细胞SW620及同源结肠癌细胞SW480有一定的杀伤作用。     

树突状细胞与胃癌细胞融合的肿瘤疫苗研究

目的以肿瘤细胞与树突状细胞(dendriticcells,DCs)相融合使融合细胞能将肿瘤抗原递呈给T细胞,并提供T细胞激活所必需的第二信号,借此激活机体的抗肿瘤免疫。方法通过PEG法将鼠源性胃癌细胞MFC与小鼠DC进行融合(T/DC),融合后经50Gy电子线照射,以1×106肿瘤疫苗于小鼠皮下注射免疫2次,间隔1周后接种,后一次免疫后1周于小鼠皮下接种5×105MFC胃癌细胞。肿瘤细胞接种3周后处死实验动物,测量肿瘤大小、外周血NK活性和脾细胞CTL活性。结果肿瘤接种后一周对照组小鼠皮下均有肿瘤生长,而T/DC免疫组均无皮下可触及的肿瘤(10/10),10天后T/DC免疫组才有4/10只鼠皮下出现可触及的肿瘤,3周后对照组肿瘤体积明显大于T/DC免疫组。经T/DC免疫后小鼠生存期明显较对照组延长,对照组于肿瘤接种后2周开始有小鼠衰竭死亡,至肿瘤接种后3周对照组仅有3只存活,T/DC免疫组有8只鼠存活,并仍有3只无肿瘤生长。经T/DC免疫后,小鼠NK活性和肿瘤特异性CTL活性均明显提高,T/DC免疫组和对照组MFC特异性CTL活性分别为30.09%和7.12%。结论肿瘤细胞鄄DC融合的肿瘤疫苗可通过加强抗原递呈激活肿瘤特异性CTL而具明显的抗肿瘤活性。     

胃癌细胞-树突状细胞融合疫苗对肿瘤细胞增殖周期影响的研究

目的为胃癌细胞-树突状细胞(DC)融合瘤苗免疫治疗胃癌患者提供实验依据及理论基础。方法采用细胞融合技术制备胃癌细胞-DC融合疫苗,对融合疫苗影响体外培养肿瘤细胞增殖周期及体内种植瘤组织细胞周期的特点进行研究。(1)胃癌患者外周血单个核细胞经粒细胞-巨噬细胞刺激因子(GM-CSF)、白介素(IL)-4、肿瘤坏死因子(TNF)-α诱导分化获取DC；(2)DC与SGC7901细胞经聚乙二醇诱导融合,HAT/HT选择培养获得纯净融合细胞；(3)流式细胞术检测融合疫苗对体外培养胃癌细胞周期及体内种植瘤组织细胞周期的影响。结果(1)外周血单个核细胞诱导分化可获得具备典型特征及细胞表型的DC；(2)DC与SGC7901细胞经PEG诱导融合,HAT/HT选择培养获得纯净融合细胞；(3)体内应用融合疫苗组癌细胞周期比例：G_0/G_1间期(76．77±4．38)%,S期(16．50±2．90)%,G_2/M期(6．73±1．59)%；与对照组比较,P＜0．01,差异有统计学意义。体内应用融合疫苗组种植瘤组织细胞增殖指数为23．34±3．51,与对照组(65．73±4．43)比较,P＜0．05,差异有统计学意义。结论融合细胞疫苗对肿瘤细胞增殖周期可产生显著影响,明显减慢肿瘤生长速度,抑制肿瘤细胞分裂增殖,是融合细胞疫苗发挥更强生物学效应的基础之一。     

gp96多肽复合物树突状细胞疫苗诱导的体外抗胃癌实验研究

目的研究gp96多肽复合物树突状细胞(DC)疫苗特异性抗胃癌的免疫反应。方法应用层析技术从胃癌组织中提取gp96多肽复合物,制备gp96多肽复合物DC疫苗;采用流式细胞仪检测gp96多肽复合物DC疫苗表面分子的表达;ELISA检测gp96多肽复合物DC疫苗致敏的效应 T淋巴细胞分泌IFN-γ和IL-10的水平;51Cr释放实验检测gp96多肽复合物DC疫苗诱导的特异性对胃癌细胞的杀伤效应。结果gp96多肽复合物DC疫苗表面分子CD1α(79．3±4．1)％、CD80 (84．3±2．4)％、CD83(85．7±3．2)％和HLA-DR(83．4±2．9)％的表达显著增高;对原代培养胃癌细胞的杀伤率(58．5±10．7)％显著高于对SGC 7901细胞的杀伤率(24．0±4．2)％,两者相比差异有统计学意义,P<0．01;对HepG2细胞(13．8±2．8)％则无明显杀伤作用。DC疫苗诱导的效应T淋巴细胞分泌IFN-γ(2875±178)pg／ml的量明显增加,分泌IL-10(36±7)pg／ml的量显著降低。结论 gp96多肽复合物DC疫苗能诱导出较强的对自体胃癌细胞的杀伤作用,且具有高度特异性。     

树突状细胞疫苗诱导免疫效应细胞对PC3生长的抑制作用

耳的体内外观察多种细胞因子及肿瘤相关抗原（TAA）体外培养的树突状细胞（DC）诱导免疫效应细胞对PC3的抑制。方法用淋巴细胞分离液分离抗凝新鲜全血以获得单核细胞（PBMC），用贴壁法获取DC和去DC的单核细胞（免疫效应细胞），并分别用粒／巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、人白细胞介素（IL）-4、肿瘤坏死因子（TNF）-α、PC3肿瘤相关抗原（PC3TAA）和人白介素2（IL-2）培养正常人DC和免疫效应细胞，5．6d后将DC和免疫效应细胞混合培养1-2d。观察DC，免疫效应细胞生长状况。酶法检测DC诱导免疫效应细胞对PC3的毒性作用。体内观察DC诱导免疫效应细胞和DC培养上清液对裸鼠PC3移植瘤的生长抑制作用。结果体外多种细胞因子和肿瘤相关抗原能有效引起DC增殖。DC疫苗诱导免疫效应细胞对PC3的最大杀伤效率为62．4％。体内实验见：阴性对照组Ⅰ，单纯细胞治疗组Ⅲ及其联合培养上清液治疗组Ⅳ裸鼠均于第12天发生移植瘤；预防治疗组Ⅱ，观察30d时，6例只有2例发生移植瘤；于移植瘤产生后的第45天处死所有裸鼠并称瘤体的重量，各组比较差异有统计学意义（P〈0．05），两两比较。组Ⅰ分别与组Ⅱ、Ⅲ比较差异有统计学意义（P〈0．001），组Ⅰ与组Ⅳ、组Ⅱ与组Ⅲ比较差异有统计学意义（P〈0．05）。结论DC疫苗在抗恶性肿瘤中有重要作用。     

阑尾滤泡树突状细胞肉瘤的临床与病理

目的 探讨阑尾滤泡树突状细胞肉瘤（follicular dendritic cell sarcoma,FDCS）的生物学行为特征,诊断要点和临床治疗.方法 对1例阑尾FDCS术后8个月腹腔内复发患者的手术标本进行病理形态学观察、免疫组化检测.结果 两次手术切除的肿瘤的组织病理学形态一致.免疫组化：CD21、CD35、S-100、Vimentin、CD68和FN呈阳性反应;CD117、CD34、SMA、Actin、NSE和CK呈阴性反应.病理学诊断：阑尾FDCS,腹腔内复发.结论 FDCS是一种非常罕见的肿瘤,大多发生于淋巴结,少数可见于淋巴结外.手术切除是治疗FDCS的主要方法.     

肾癌树突状细胞疫苗的体外活性研究

目的 探讨负载人肾癌细胞抗原肽制备树突状细胞(DC)疫苗体外杀伤肾癌细胞的作用.方法 利用细胞膜酸洗脱法获得人肾透明细胞癌细胞株786-0细胞表面抗原肽.外周血单个核细胞在体外经人粒细胞一巨噬细胞集落刺激因子,白细胞介素4和脂多糖诱导获得成熟的DC,并负载分离到的抗原肽制备DC疫苗.利用疫苗体外诱导出特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)作为实验组.同时设置4个对照组,对照组1用未负载抗原肽的DC和单个核细胞混合培养,对照组2用单个核细胞进行培养,对照组3用抗原肽与单个核细胞混合培养,对照组4用未负载抗原肽的DC单独培养.4个对照组也加入同实验组相同的各种因子进行培养.51Cr释放法检测特异性CTL的杀伤活性.结果 疫苗诱导的特异性CTL对肾癌细胞的杀伤活性为(31.93±5.05)%,与对照组(5.88±2.26)%、(8.03±6.70)%、(9.70±2.09)%、(9.35±3.58)%相比差异有统计学意义(P<0.05).结论 负载抗原肽的DC疫苗体外试验有高效的抗肾癌细胞活性.     

IL-23修饰的树突状细胞疫苗抗胰腺癌免疫应答的实验研究

树突状细胞（dendritic cells）是目前发现的功能最强大的肿瘤抗原专职递呈细胞。近年来负载肿瘤抗原的DC疫苗是抗肿瘤治疗的热点。白介素23（IL-23）是一种最新型的细胞因子，由P19及P40两条多肽链组成的异二聚体。IL-23可强化DC抗原递呈能力，使宿主针对肿瘤的免疫反应显著增强。     

腺病毒载体介导的胞嘧啶脱氨酶和胸苷激酶融合基因体外抑瘤效果的观察

目的：构建重组腺病毒载体，观察自杀基因对不同大肠癌细胞系的细胞毒作用。方法：利用重组腺病毒载体介导的胞嘧啶脱氨酶（CD）、单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV-tk)融合基因感染人结肠腺癌细胞系LoVo、HCT－8和直肠腺癌细胞系HR－8348，通过细胞集落形成实验、细胞存活率测定（MTT法），检测和分析HSV－tk／丙氧鸟苷（GCV）、CD／5－氟胞嘧啶（5－FC）双自杀基因系统对肿瘤细胞的杀伤作用和旁观者效应的大小。结果：Western Blot检测分析融合基因的表达，显示重组腺病毒介导的双自然基因可以在3种肿瘤细胞中表达。不加5－FC和GCV时，各转染组和对照组肿瘤细胞集落形成分别为：94、93、95；96、94，比较差异无显著性（P＞0．05）。在5－FC（80．0mg/L）和GCV（0．8mg/L)浓度下3种肿瘤细胞存活率降至2．1％、4．3％和3．2％，与不同前药相比差异有显著性（P＜0．01）。感染细胞在混合细胞中比例仅仅占5％时，就能获得明显的旁观者效应，细胞杀伤率分别升至22．2％、34．8％和40．4％。结论：CD、TK融合基因联合联合双前药治疗能取得显著的抗肿瘤作用。     

胎儿来源的树突状细胞体外诱导抗前列腺癌效应的实验研究

目的研究胎儿来源树突状细胞(DC)体外诱导抗前列腺癌的特异性细胞免疫效果。方法从胎儿骨髓、肝脏获得单个核细胞,经重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)、重组人白细胞介素-4(rhIL-4)和重组人肿瘤坏死因子-α(rhTNF-α)诱导产生DC。50%~70%硫酸铵饱和沉淀法获取前列腺癌细胞DU145含热休克蛋白(HSP)成分的细胞溶解物,以该抗原负载DC,激活胎脾细胞产生肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。MTT法检测CTL对DU145、PC3和EJ细胞的杀伤效应。结果胎儿骨髓、肝脏可诱导出功能成熟的DC,高表达CD1 a、CD86、HLA-DR和CD83。负载DU145抗原的DC可诱导产生CD8+CTL。CD8+T细胞表型由转化前的(14.09±2.46)%变为转化后的(62.76±2.64)%。对DU145细胞有明显细胞毒作用,显著高于对EJ细胞杀伤效应(P<0.01)。结论含HSP成分的肿瘤细胞溶解物负载胎儿来源DC,体外可诱导出特异性抗肿瘤免疫应答。     

Enhancement of antitumor immune response in glioma models in mice by genetically modified dendritic cells pulsed with Semliki forest virus-mediated complementary DNA

OBJECT: The aim of this study was to further investigate dendritic cell (DC)-based immunotherapy for malignant glioma to improve its therapeutic efficacy. METHODS: Dendritic cells were isolated from the bone marrow and pulsed with phosphate-buffered saline, tumor RNA, tumor lysate, Semliki Forest virus (SFV)-LacZ, SFV-mediated B16 complementary (c)DNA, or SFV-mediated 203 glioma cDNA, respectively, to treat mice bearing tumors of the 203 glioma cell line. The results indicated that pre-immunization with DCs pulsed with the same type of cDNA as in the tumor by a self-replicating RNA vector (that is, SFV) protected mice from tumor challenge, and that therapeutic immunization prolonged the survival of mice with established tumors. The SFV induced apoptosis in DCs and their death facilitated the uptake of apoptotic cells by other DCs, thus providing a potential mechanism for enhanced immunogenicity. CONCLUSIONS: Therapy with DCs that have been pulsed with SFV-mediated tumor cDNA may be an excellent procedure for the development of new cancer vaccines.     

突变k- ras基因修饰的树突状细胞疫苗的抗肿瘤作用

目的探讨腺病毒介导的突变k-ras基因修饰的树突状细胞疫苗在体内的抗肿瘤作用.方法将突变k-ras基因修饰的DC经腹腔注射免疫小鼠(5×105/只),1次/周,共2次,随后将肿瘤细胞接种于皮下,观察DC能否诱发机体的免疫保护.结果突变k-ras基因修饰的DC疫苗组Lewis肺癌(3LL)移植瘤生长明显延缓,肿瘤体积显著低于空载体组、DC组和对照组(P＜0.05),而抑瘤率显著高于空载体组、DC组和对照组(P＜0.05).突变k-ras基因修饰的DC疫苗组Lewis肺癌(3LL)移植瘤肺转移率(2/10,20%)显著低于空载体组(6/10,60%)、DC组(6/10,60%)和对照组(8/10,80%,P＜0.05);肺部转移灶数目亦显著少于空载体组、DC组和对照组(P＜0.05).结论突变k-ras基因修饰的DC疫苗能有效诱导机体产生特异的抗肿瘤免疫反应,抑制Lewis肺癌生长和远处转移.     

Antitumor immune response following injection of neuraminidase-treated sarcoma cells.

Mice inoculated with MCA-10 sarcoma cells which had previously been incubated with Vibrio cholerae neuraminidase (VCN) demonstrated a significantly lower tumor incidence (9/26) than mice injected with untreated sarcoma cells (10/10) or sarcoma cells incubated with heat-inactivated neuraminidase (28/29) p less than .05. Rechallenge of nontumor-bearing mice from the VCN group with untreated sarcoma cells resulted in a low tumor incidence (4/11), indicating that these mice had developed systemic immunity following the initial injection of VCN-treated tumor cells. These mice also demonstrated significant lymphocytotoxicity against MCA-10 target cells compared with normal control mice (p less than .05). Subsequent cytotoxicity experiments, utilizing groin lymph node and splenic lymphocytes from mice five days following leg injection of VCN-treated, heat-inactivated VCN-treated or untreated MCA-10 cells, demonstrated that the mice injected with VCN-treated tumor cells demonstrated greater antitumor immunity both locally and systemically. This magnification of tumor immunity is postulated as the mechanism by which neuraminidase treated MCA-10 sarcoma cells grew less well in C57 mice than cells incubated with heat-inactivated VCN or cells left untreated.     

Role of dendritic cells in the immune response against allografts

Graft-derived 'passenger' dendritic cells have been classically considered as the instigators of acute organ rejection. However, recent advances have revealed that dendritic cells are also involved in the induction/maintenance of peripheral tolerance. This paper briefly reviews the most recent knowledge of the role of donor and recipient dendritic cells during the immune response against allografts, and of the clinical potential of 'tolerogenic' dendritic cells.     

未成熟树突状细胞诱导肝移植免疫耐受作用机制的研究进展

作为肝脏终末期疾病和急性肝衰竭的有效治疗手段,肝脏移植已愈发体现出其不可替代的临床价值.但由于同种异体肝移植术后的排斥反应,使其成为左右移植器官功能的关键.因此, 针对排斥反应机制及相关治疗的探讨一直是各国移植工作者研究的重点之一.作为目前已知最为强大的抗原提呈细胞(APCs)-树突状细胞(DCs)在肝移植术后对维系免疫耐受状态所起的重要作用,已经成为科研人员研究的焦点问题.本文就树突状细胞在肝移植术后诱导免疫耐受的机制,以及近年来相关的研究进展概述如下.