BPI23-haFGF融合蛋白的鉴定及其生物活性研究

目的：研究BPI23-haFGF融合蛋白的生物学活性。方法：将已构建的酵母重组表达菌株pPICZαA-BPI23-haFGF/X-33进行甲醇诱导表达，通过亲和层析纯化和冻干浓缩后，观察融合蛋白BPI23-haFGF对细菌、NIH3T3细胞以及小鼠烫伤模型的作用。结果：获得纯度约90%的融合蛋白BPI23-haFGF，BPI23-haFGF具有杀菌及促增殖的双重功能，BPI23-haFGF促增殖率与HaFGF标准品相当，当其浓度为0.40 g/L时，促NIH3T3细胞增殖率最高（88.7 %）；在小鼠烫伤模型中，用药组比阴性对照组提前2～3d 愈合。结论：融合蛋白BPI23-haFGF能够改善小鼠烫伤创面的愈合，为其在临床上的应用奠定了基础。     

BPIm23重组抗菌蛋白在巴斯德毕赤酵母中的分泌表达

目的：采用巴斯德毕赤酵母表达系统表达分泌型功能性rBPIm23抗菌蛋白。方法：利用构建的pUC18-synBPI414质粒和PBV220-BPIm120质粒，按分子克隆方法构建pPICZa-synBPIm600重组表达载体；用线性化pVICZa-synBPIm600质粒电转化Pichia pastoris GS115，筛选抗性转化子，进行PCR和Mut表型鉴定；用甲醇诱导目的蛋白rBPIm23的表达；用离子交换层析纯化rBPIm23，并进行SDS-PAGE分析、Western blot鉴定和用BCA法定量。结果：①成功构建了pPICZa-synBPIm600重组表达载体；②获得稳定整合目的基因的GS115菌株；③表达产物相对分子量约为23kD，可与抗BPI抗体特异性结合；④培养上清液中目的蛋白表达量约为2.9mg／L。结论：BPIm23重组抗菌蛋白在毕赤酵母GS115中得到分泌表达。     

人La多肽融合蛋白在E.coli中的表达

目的　构建在E .coli中表达人La多肽的质粒。方法以人脾cDNA为模板 ,通过PCR获得La多肽 (全长 )的DNA片段。将此片段利用双酶切定向克隆到MBP(麦芽糖结合蛋白 )融合系统的载体pMALTM c中 ,表达可溶性融合蛋白 ,并通过亲和层析予以纯化。结果免疫印迹实验 (IBT)证明 ,表达的融合蛋白具有La抗原多肽的特异性 ,而敏感性超过生化制备的ENA制品。结论重组融合蛋白与天然ENA制品存在免疫学同一性     

人MAdCAM-1胞外区基因在原核系统的表达及重组蛋白纯化

目的：制备高纯度的重组人MAdCAM-1蛋白。方法 采用PCR技术从pUC21/hMadCAM-1质粒上,选择性扩增编码成熟MAdCAM-1胞外区两个Ig域的基因片段。将其克隆至pQE30载中,转化大肠杆菌后,以IPTG诱导表达,产物经Ni-NTA亲和层析纯化。结果：诱导表达出相对分子质量（Mt)约29000的融合蛋白。薄层凝胶扫描显示,其表达量占菌体总蛋白质的50％左右。经亲和层析纯化得到高纯度的蛋白产品。结论 获得了重组人MAdCAM-1胞外区蛋白,为后续功能研究及其单抗研制奠定了基础。     

hIL－16cDNA的克隆、测序及在E.coli中的表达与纯化研究

在国内首次从人的外周血单个核细胞（PBMC）中克隆了人白细胞介素－16(hIL－16)cDNA,并应用一种新型的大肠杆菌表达系统─硫氧还蛋白表达系统,成功地表达了重组hIL－16。hIL－16cDNA的扩增从人PBMC中提取总RNA,poly(T)8－12反转录cDNA,以半巢式PCR扩增出特异的DNA片段。hIL－16cDNA的克隆、测序与表达利用     

nm23蛋白在人鼻咽癌中的表达

ｎｍ２３蛋白在人鼻咽癌中的表达郑天荣谢佐福林贤东张竟时陆莉莉最新研究资料表明，ｎｍ２３基因的高表达仅与部分肿瘤如肺癌、乳腺癌、肝癌等癌症的转移能力下降有关［１］，而与另一些肿瘤如结肠癌、甲状腺癌的转移无关［２］。鼻咽癌在我国南方发病率高，其淋巴结转移...     

重组人IL—6在E.coli中的高效表达

通过计算机分析设计,人工合成了寡核苷酸引物,并优化了翻译起始区,应用PCR及重组DNA技术,获得了重组人白细胞介素6(IL—6)高效表达工程菌。从全菌SDS—PAGE考马斯亮蓝染色后薄层密度扫描分析表达产率为38.6％,分子量为2.1×10~4。以IL—6依赖性的小鼠杂交瘤细胞株B9用MTT法测定表达重组人IL—6的HGF活性为2×10~7U/L菌液。不同菌株表达重组人IL—6研究表明,以E.coli DH5α/pBV IL—6表达产率最高。     

nm23蛋白在转移性胃癌中的表达

ｎｍ２３蛋白在转移性胃癌中的表达刘宝瑞张学庸丁杰ｎｍ２３蛋白在转移性胃癌中的表达@刘宝瑞@张学庸@丁杰...     

人脂皮素-1重组蛋白的表达与鉴定

为了获得有免疫原性的人脂皮素－1（lipocortin-1,LC-1)蛋白,以便疫动物获得抗体,建立了免疫分析方法,而且更深入地探讨LC－1抗炎机制及其在临床上的应用。采用基因工程的方法进行重组人LC－1的原核表达并鉴定,主要结果如下：（1）从U937细胞中提取总RNA,以此为模板行反转录PCR,成功地扩增了1038bp的人LC－1cNDA基因,并将此基因全长克隆入pUC18载体,经测序分析证实克隆序列与文献报道的序列基本一致。（2）成功地构建了原核表达质粒pBV220/LC-1并在大肠杆菌中实现表达,经SDS－PAGE电泳和Western免疫印迹分析,证实重组菌产生37kD的表达产物,且此蛋白可与LC－1抗体特异结合,实现了人LC－1基因的克隆及原抗表达,获得了有免疫学活性的LC－1,为LC－1的基础研究和临床应用奠定了基础。     

肝细胞癌nm23－H1蛋白表达的研究

应用免疫组化检测８８例肝细胞癌（ＨＣＣ）中ｎｍ２３－Ｈ１蛋白的表达。癌旁肝组织强阳性表达，５１例肝癌组织阳性表达（５８％）。阳性产物主要定位于肿瘤细胞胞浆。ｎｍ２３－Ｈ１蛋白表达与ＨＣＣ肿瘤体积，组织分型及Ｅｄｍｏｎｄｓｏｎ分级无关，而与肝内或肝外转移显著负相关。结果表明ｎｍ２３－Ｈ１在抑制ＨＣＣ肝内或肝外转移中起着重要作用，有可能成为评价ＨＣＣ病人预后的一项新指标。     

hIL—16cDNA的克隆,测序及在E.coli中的表达与纯化研究

在国内首次从人的外周血单个核细胞（PBMC）中克隆了人白细胞介素—16（hIL－16）cDNA,并应用一种新型的大肠杆菌表达系统一硫氧还蛋白表达系统,成功地表达了重组hIL-16。hIL-16cDNA的扩增：从人PBMC中提取总RNA,poly（T）8-12反转录cDNA,以半巢式PCR扩增出特异的DNA片段。hIL-16cDNA的克隆、测序与表达：利用E．coli表达载体pTrxFus,构建hIL－16。DNA的重组质粒,转化E．coli后,经色氨酸诱导,表达出相对分子质量（Mr）为30000的可溶性融合蛋白,表达量占菌体蛋白的30％。序列测定证实,此片段长393bp,确为hIL-16cDNA。经一步渗透压休克,即获得了高纯度的表达蛋白。     

肝细胞癌nm23—H1蛋白表达的研究

应用免疫组化检测８８例肝细胞癌中ｎｍ２３－Ｈ１蛋白的表达，癌旁肝组织强阳性表达，５１例肝癌组织阳性表达（５８％），阳性产物主要定位于肿瘤细胞胞浆。ｎｍ２３－Ｈ１蛋白表达与ＨＣＣ肿瘤体积，组织分型及Ｅ ｄｍｏｎｄｓｏｎ分级无关，而与肝内或肝外转移显著负相关，结果表明ｎｍ２３－Ｈ１在抑制ＨＣＣ肝内或肝外转移起着重要作用，有可能成为评价ＨＣＣ病人预凰的一项新指标。     

SARS-CoV S1蛋白基因克隆及其在Vero E6细胞中的表达

目的：克隆表达SARS-CoV S1蛋白，构建SARS基因疫苗。方法：从SARS病毒的cDNA中以PCR方法扩增编码人SARS-CoV S1蛋白的编码序列，将该序列克隆入真核表达载体pVAX1，构建重组表达载体。采用脂质体法转染Vero E6细胞，用Western blot检测S1蛋白的表达。结果:PCR方法扩增出2000bp左右的基因片段，插入pVAXl构建重组表达载体后，经序列测定证实扩增的片段为SARS-CoV Tor2株S1蛋白编码序列。将重组子转染Vero E6细胞，收集细胞总蛋白，Western检测获得特异蛋白带。结论：成功克隆并表达了SARS-CoV S1蛋白，为其作为SARS基因疫苗研究打下基础。     

重组人MUC1-MBP融合蛋白在大肠杆菌中的表达、纯化及其免疫活性测定

目的 :以MUC1为靶点研制抗肿瘤蛋白疫苗。方法 :将MUC1基因连入pMAL p2原核表达载体 ,并转化大肠杆菌 ,通过IPTG诱导MUC1表达 ,经Westernblot鉴定 ,Amylose亲和层析纯化蛋白。用MUC1 MBP免疫健康C5 7BL 6小鼠 ,测定其免疫活性 ,通过ELISA测定血清中抗MUC1抗体的效价 ;采用MTT法测定小鼠脾CTL活性 ,通过3H TdR掺入法测定T细胞增殖能力。结果 :成功构建了pMAL MUC1表达载体并得到稳定表达MUC1的菌株 ,鉴定了MUC1在大肠杆菌中的表达 ,纯化了MUC1蛋白。经重组MUC1 MBP免疫的C5 7小鼠 ,血清抗MUC1抗体的效价为 1:5 76 0± 32 2 1;脾CTL对MCF 7及Lewis肺癌细胞的杀伤率分别为 4 7 7%± 4 3%和 6 7 5 %± 6 5 %。结论 :人类重组MUC1融合蛋白可引发小鼠CTL反应和体液免疫应答 ,有希望研制成抗腺癌蛋白疫苗。     

风疹病毒JR23株糖蛋白E1在毕赤酵母表达系统中的表达和抗原性分析

目的在毕赤酵母表达系统中表达风疹病毒(rubella virus，RV)JR23株包膜糖蛋白E1，为研究E1蛋白的结构功能、开发基因工程疫苗和重组蛋白诊断试剂盒奠定基础。方法E1基因的表达质粒pGAPZαa-E1经AVRⅡ线性化后用LiCl法转化酵母菌，在YPD(含100μg／ml Zeocin^TM)平板上两次筛选，挑出单菌落，于液体YPD中培养，并在不同时间收集培养物，用SDS-PAGE和Western blot进行分析。结果SDS-PAGE显示E1重组蛋白在毕赤酵母中高效稳定表达，在48h时表达量达到最高，之后趋于稳定，上清和细胞中均有蛋白表达。Western blot结果表明，上清中的E1重组蛋白能够分别与抗RV的阳性血清和单克隆抗体反应，而细胞中的E1重组蛋白只能与抗RV的阳性血清反应，不能与单克隆抗体反应。这说明所表达的蛋白一部分在信号肽的引导下分泌出胞，并经过折叠形成了正确的构像，能够与单克隆抗体结合；而另一部分由于蛋白本身的跨膜区连在了细胞膜上没有分泌出去，没有形成能够被单抗识别的构像，不能与单抗结合。结论E1包膜糖蛋白在酵母菌中成功表达，且免疫反应性良好。     

单核细胞趋化蛋白—1在大肠杆菌中的表达

将人单核细胞趋化蛋白－１（ＭＣＰ－１）的ｃＤＮＡ插入融合蛋白表达载体ｐＧＥＸ－４Ｔ－１中，构建成质粒ｐＧＥＸ／ＭＣＰ转化大肠杆菌ＪＭ１０９，经ＩＰＴＧ诱导后合成ＧＳＴ－ＭＣＰ－１融合蛋白。用１２％ＳＣＳ－ＰＡＧＥ检测在３０ｋＤ左右有新生蛋白条带出现，表达量约占菌体总蛋白的３１．７％，趋化实验证明，该产物具备明确的单核细胞趋化活性。     

nm23—H1与p21、p53蛋白在人卵巢癌中表达的相关性研究

目的：研究人卵巢癌组织中肿瘤转移抑制基因nm23-H1、抑癌基因p21^WAFI及p53蛋白的表达,探讨它们在卵巢癌发生、发展中的作用。方法：采用免疫印迹技术,对74例卵巢癌组织及21例卵巢非癌组织中nm23-H1p21^WAFI及p53蛋白进行检测。结果：在卵巢癌中nm23-H1、p53蛋白的表达高于卵巢非癌组织,p21^WAFI蛋白的表达呈下调;肿瘤发生转移时卵巢癌组织中nm23-H1和p21WAF蛋白表达显著低于未发生肿瘤转移的癌组织。p53蛋白表达与肿瘤转移无关。nm23-H1 \p21^WAFI 蛋白与卵巢癌组织类型无关,但与卵巢癌的临床分期相关。p53蛋白的表达与卵巢癌组织类型及卵巢癌的临床分期无关。nm23-H1与p53、p21^WAFI蛋白间表达在卵巢癌中呈相关性。结论：nm23-H1、p53、p21^WAFI 基因在卵巢癌发生、发展中起一定的作用,nm23-H1与p53、p21^WAFI基因在卵巢癌发生、发展中可能起协同作用。     

重组狂犬病毒在原核细胞中的表达

目的：探讨狂犬病毒Ｎ蛋白的免疫原性,方法：采用生物工程技术,基因重组方法。结果：以狂犬病毒基因文库及ＩＬ－２基因文库设计两对引物,基因扩增后分别得到完整狂犬病毒Ｎ蛋白基因片段（１．４ｋｂ）和ＩＬ－２基因片段（０．４ｋｂ）两基因片段经重组后,构建了狂犬病毒Ｎ蛋白及ＩＬ－２重组基因工程菌,重组基因产物具有特异性生物活性,用ＩＬ－２单抗检测有一定ＩＬ－２活性,免疫小鼠后,小鼠可抵抗狂犬病毒脑内攻击,结论