表达狂犬病毒糖蛋白的非复制型重组痘苗病毒的构建 …

目的 提高表达狂犬病毒糖蛋白（ＲＧ）的重组痘苗病毒的安全性。方法 将编码中国狂犬病毒５ａＧ株糖蛋白的基因,插入痘苗病毒天坛株的ＴＫ区,获得重组病毒ＶＴＫＲＧ,通过两步同源重组,删除ＣＫ片段间与痘苗病毒毒力及宿主范围相关的基因,得到非复制型重组痘苗病毒ＶＴＫＲＧΔＣＫ。结果 经ＰＣＲ鉴定,ＣＫ间的核酸片段被成功删除,其缺失性状能稳定地遗传。     

狂犬病毒糖蛋白及核蛋白在非复制型痘苗病毒天坛 …

目的 提高重组痘苗病毒狂犬疫苗的有效性和安全性。方法 利用ＴＫ区表达狂犬病毒糖蛋白（ＲＧ）的重组痘苗病毒作为亲本株，通过两步同源重组，删除痘苗病毒基因组ＣＫ片段间与毒力和宿主范围相关的核酸片段，同时将狂犬病毒核蛋白（ＲＮ）基因插入Ｃ－Ｋ片段之间，获得了含有ＲＧ基因和ＲＮ基因的非复制型重组痘苗病毒ＶＴＫＲＧ△ＣＫＬａｃＺＲＮ。结果 经ＰＣＲ鉴定，ＲＮ基因已插入ＣＫ区；Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ结果显示     

中国狂犬病毒疫苗株（5aG）糖蛋白基因在痘苗病毒中的表达及免疫效果观察

将克隆到的中国狂犬病毒疫苗株（５ａＧ）的糖蛋白基因重组到痘苗病毒ＴＫ区，并在痘苗病毒Ｐ１１启动子的控制下，构建了狂犬－痘苗重组病毒（ＶＶａＧ）。经间接免疫荧光和Ｗｅｓｔｅｒｎ免疫印染证明，重组病毒ＶＶａＧ能良好地表达狂犬病毒糖蛋白，其分子量约为６６００。用ＶＶａＧ免疫小鼠，７ｄ便可诱生较高的狂犬病毒中和抗体，２１ｄ达４１６９，并能１００％保护狂犬病毒本毒株和国际标准攻击毒（ＣＶＳ）的致死量攻击。     

小鼠对表达狂犬病毒3aG株糖蛋白的重组复制缺陷型腺病毒的免疫应答

目的研究表达狂犬病毒3aG株糖蛋白(GP)的重组复制缺陷型腺病毒Ad/GP＇及Ad/GP免疫小鼠后所产生的特异性体液免疫应答,体外脾细胞增殖反应,及免疫小鼠对狂犬病毒致死性颅内攻击的保护力。方法1×10     

重组狂犬病毒糖蛋白的抗原性和免疫原性鉴定

本文采用间接免疫荧光试验和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ方法，对大肠杆菌和重组痘苗病毒表达的重组狂犬病毒糖蛋白进行抗原性检测，结果表明，均可与其单克隆抗体发生特异性反应；并且狂犬病毒糖蛋白基因重组痘苗病毒免疫小鼠，可诱导小鼠产生抗狂犬病毒特异性抗体，具有良好的免疫原性。     

非复制重组痘苗病毒中白细胞介素6的表达及其对重组病毒免疫效果的影响

目的 研究白细胞介素6（IL－6）在非复制型痘苗病毒中的表达及其对重组痘苗病毒免疫效果的影响。方法 利用非复制型痘苗病毒表达载体pNEOCK11β75IL6和重组病毒RVJ123，通过两步重组构建能同时表达IL－6和乙型肝炎病毒（HBV）HBsAg的非复制型重组痘苗病毒PVJ123ΔCK11β75IL6。免疫动物并观察其免疫效果。结果 Southern blot证实痘苗病毒C、K片段间基因缺失的同时伴有IL－6基因的插入，IL－6和HBsAg可同时表达。鼻腔吸入分别免疫BALB／c小鼠和新西兰白兔，ELISAPOT实验证实免疫后两周小鼠肺淋巴细胞的抗－HBsAg IgA、IgG抗体分泌细胞（ASC）数比对照组（RVJ123ΔCK11β75）显著增加，并可在小鼠血液、肺浸出液以及新西兰白兔血液、肺浸出液、其他分泌液样品中检测到抗－HBsAg的特异性的IgA、IgG抗体。与对照组相比，IgA、IgG抗体阳转率及抗体滴度提高。结论 非复制型痘苗病毒载体中表达的IL－6可增强其诱导的免疫反应，为细胞因子IL－6作为有效的载体疫苗佐剂提供了实验基础。     

中国狂犬病毒疫苗株（5aG）糖蛋白基因在痘苗病毒中的…

将克隆到的中国狂犬病毒疫苗株的糖蛋白基因重组到痘苗病毒ＴＫ区，并在痘苗病毒Ｐ１１启动子控制下，构建了狂犬－痘苗重组病毒。经间接免疫荧光和Ｗｅｓｔｅｒｎ免疫印染证明，重组病互惠ＶＶａＧ能良好地表达狂犬病毒糖蛋白，其分子量约为６６００。     

共表达HPV16型E6和E7突变基因重组痘苗病毒的构建及其抗肿瘤免疫效果的观察

目的：构建用于子宫颈癌治疗的HPV16型E6和E7重组痘苗病毒实验性疫苗株，并对其抗肿瘤免疫效果进行初步评价。方法：以痘苗病毒为载体、利用同源重组技术构建共表达HPV16 E6和E7基因的重组痘苗病毒。该病毒免疫C57BL／6小鼠后，检测其免疫原性和抗移植瘤生长情况。结果：PCR结果显示，重组病毒VmE6E7的TK基因内插入了分别由痘苗病毒早晚期启动子H6和7．5K表达的ME6和ME7－1基因。动物实验结果表明，rVmE6E7在C57BL／6小鼠体内可诱发E6和E7特异性抗体产生，被免疫小鼠能够抵抗HPV16 E6E7转化的同系肿瘤细胞的攻击。结论：获得1株用于宫颈癌治疗的HPV16型实验疫苗株，为进一步研制人用HPV16型疫苗株奠定了基础。     

SARS-CoV-2重组痘苗病毒疫苗rVTT△TK-RBD的构建、筛选及免疫原性研究

目的 构建重组痘苗病毒载体疫苗rVTT△TK-RBD,并评价其安全性和免疫原性。方法 参考严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)基因序列合成受体结合域(RBD)基因,并将其插入自主构建的重组质粒pSTKE的多克隆位点上,构建重组痘苗病毒穿梭载体pSTKE-RBD,并转染到预先感染天坛株痘苗病毒(VTT)的BHK-21细胞内,经多轮的荧光噬斑筛选成功获得重组痘苗病毒rVTT△TK-RBD;通过滴鼻方式免疫小鼠后,检测rVTT△TK-RBD对BALB/c小鼠体质量的影响;通过肌肉免疫小鼠后,分析rVTT△TK-RBD对BALB/c小鼠产生的特异性抗体和中和抗体的水平;通过流式细胞术检测rVTT△TK-RBD对BALB/c小鼠T细胞亚群的影响。结果 利用同源重组、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)筛选标记和多次荧光噬斑筛选,成功筛选获得了表达RBD的胸腺激酶(TK)基因缺失型重组痘苗病毒rVTT△TK-RBD,且PCR验证成功。BALB/c小鼠体内实验表明rVTT△TK-RBD具有较好的抗SARS-CoV-2的免疫原性且相比于亲本株VTT明显降低了对机体的毒性作用。结论 成功构建并...     

狂犬病毒CTN株糖蛋白重组鸡痘病毒与核酸疫苗的联合免疫

目的 构建狂犬病毒糖蛋白重组鸡痘病毒，研究联合运用重组病毒与同一抗原核酸疫苗对小鼠的免疫效果，为狂犬病疫苗的研究提供基础。方法 以中国鸡痘病毒疫苗株282E4为基础构建的表达载体pUTA-2的ATI-P7．5复合启动子下游，插入狂犬病毒CTN-18l株糖蛋白基因，构建了重组转移载体pUTA-RgC。以脂质体转染法将pUTA-RgC转染至已感染鸡痘病毒282E4株(FPV)2～3h的鸡胚成纤维(CEF)细胞中。待细胞出现明显病变后收获病毒，用BrdU进行连续3次加压筛选，挑取蚀斑毒株、纯化、扩增，间接免疫荧光鉴定。用重组鸡痘病毒vUTA-RgC单独及与核酸疫苗联合免疫小鼠，在细胞及体液免疫，攻毒保护水平评价所构建的重组病毒及联合免疫效果。结果 间接免疫荧光结果表明已成功构建重组鸡痘病毒，免疫后能诱导机体产生细胞与体液免疫，并能抵抗标准攻毒株的攻击，联合免疫效果较为理想。结论 获得一株能够表达狂犬病毒糖蛋白的vUTA．RgC，并证明有一定的免疫原性，与核酸疫苗联合应用能够克服各自的缺点。     

治疗性人源抗狂犬病毒抗体研究进展

<正>狂犬病是由狂犬病毒(rabies virus,RV)引起的人兽共患疾病,发病后死亡率几乎达百分之百。狂犬病毒属弹状病毒科(Rhabdoviridae)狂犬病毒属(Lyssavirus),基因组编码五种结构蛋白,其中由G基因编码的糖蛋白,是病毒与宿主细胞结合的配体,能诱导机体产生中和抗体,与病毒的毒力、致病性密切相关。根据世界卫生组织(WHO)推荐     

重组狂犬病毒在原核细胞中的表达

目的：探讨狂犬病毒Ｎ蛋白的免疫原性,方法：采用生物工程技术,基因重组方法。结果：以狂犬病毒基因文库及ＩＬ－２基因文库设计两对引物,基因扩增后分别得到完整狂犬病毒Ｎ蛋白基因片段（１．４ｋｂ）和ＩＬ－２基因片段（０．４ｋｂ）两基因片段经重组后,构建了狂犬病毒Ｎ蛋白及ＩＬ－２重组基因工程菌,重组基因产物具有特异性生物活性,用ＩＬ－２单抗检测有一定ＩＬ－２活性,免疫小鼠后,小鼠可抵抗狂犬病毒脑内攻击,结论     

中国狂犬病毒RdRp基因特点

目的 测定中国狂犬病毒人用疫苗株aG和减毒株CTN181的RdRp编码(L)基因序列并初步研究其结构和功能特点.方法 RT-PCR法获得若干交叉重叠小片段,序列拼接得到完整RdRp编码基因序列,利用生物学软件进行同源性和种系发生分析,并对RdRp保守功能序列和位点进行预测分析.结果 中国狂犬病毒aG和CTN181株的L蛋白分别由6387和6384个核苷酸编码的2128和2127个氨基酸组成,前者比后者在起始部位多编码一个Met.结构功能分析发现在L蛋白上存在若干可能对RNA合成、mRNA聚腺苷酸化和磷蛋白磷酸化以及甲基转移酶的功能起决定作用序列;种系发生树显示中国疫苗株aG相对独立于WHO推荐使用的其他疫苗株.结论 完整L基因结构揭示,对于全面了解中国狂犬病毒分子特征,发现新的功能位点,开发以RdRp为靶标的新型抗病毒药物研究以及弹状病毒科种系发生分析提供了有力的工具.     

湖南3县(市)狂犬病病毒分子生物学研究

目的研究湖南省狂犬病高发区和无病例区动物携带狂犬病的分子生物学特征。方法用直接免疫荧光法检测犬唾液及犬、猫脑标本，以RT．PCR法复核阳性进行遗传学分析。结果武冈市和洞口县送检的82只和17只犬中，分别有12只和1只检测到狂犬病毒抗原与核苷酸阳性，阳性率分别为14．63％和5．88％。凤凰县67份大脑标本未检测出病毒。28份猫脑组织标本也未检测出狂犬病毒。用RT-PCR法扩增阳性大脑组织（编号为Wg13，Dk13）的狂犬病毒N基因，两株病毒之间核苷酸与氨基酸的同源性分别为99、4％及99．1％；Wg13株与中国疫苗株CTN株和aG株的核苷酸同源性（氨基酸）分别为89．4％（98．2％）、86．1％（95．1％）；Dk13株与中国疫苗株CTN株和aG株的核苷酸同源性分别为89．1％（98．0％）、86．1％（94．9％）。与其他国家分离到的狂犬病毒相比，两株病毒与印度尼西亚的同源性最大，分别为92．8％、93．2％，而与印度、日本及斯里兰卡等其他国家同源性相对较小。结论两株狂犬病毒均为I型狂犬病毒。其N基因的核苷酸序列与当前使用的疫苗株相比，两株病毒与CTN疫苗株分在同一组，同源性较大。     

不同毒株制备的人用狂犬病疫苗免疫原性比较

目的:比较3种毒株(aG、CTN、CaG)制备疫苗的免疫原性及抗狂犬病毒攻击的能力。方法:应用ELISA法测定3种毒株制备的疫苗免疫家兔、豚鼠、地鼠所获的免疫血清效价;并通过用上述的地鼠免疫血清中和3种病毒后进行小鼠的中和试验。结果:在家兔、豚鼠两组内,细胞适应株毒种制备的疫苗(CaG和CTN株)血清免疫效价明显高于豚鼠脑毒种(aG株)。细胞适应株毒种制备的疫苗免疫地鼠所获得的免疫血清中和3株病毒的能力高于豚鼠脑毒种。结论:使用细胞适应株毒种生产狂犬病疫苗较豚鼠脑毒种具有更好的免疫原性。     

狂犬病病毒糖蛋白真核表达质粒的构建及免疫原性的初步研究

目的 构建狂犬病病毒糖蛋白基因DNA真核表达质粒,并检测其免疫原性.方法 用RT-PCR法扩增和分离CTN株狂犬病病毒糖蛋白基因,测序后克隆至pcDNA5.0载体,构建重组质粒pcDNA5.0-G,提取质粒,转化293T细胞,检测糖蛋白瞬时表达,并以该重组质粒肌肉注射免疫BALB/c小鼠,狂犬病病毒CVS株攻击,观察小鼠存活情况.结果 酶切、测序结果显示重组质粒pcDNA5.0-G构建成功,瞬时表达结果显示糖蛋白获得大量表达.经肌肉注射质粒常规免疫小鼠,病毒攻击后小鼠保护率为73.3％,对照组为6.7％.结论 所构建狂犬病病毒糖蛋白真核表达质粒pcDNA5.0-G经肌肉注射免疫后可有效保护小鼠免受狂犬病病毒攻击,具有良好的免疫原性,这为后期核酸疫苗的研发奠定基础.     

抗狂犬病病毒CVS-11株单克隆抗体的制备及鉴定

目的 制备抗狂犬病毒单克隆抗体,为建立快速准确的狂犬病毒抗原检测方法奠定基础.方法 将狂犬病病毒CVS-11株纯化浓缩后免疫6～8周龄雌性BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,经细胞克隆和间接ELISA筛选,获得稳定分泌抗狂犬病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株.小鼠腹腔注射法制备大量单克隆抗体并测定腹水效价,用G蛋白亲和层析柱进行纯化,间接ELISA法和间接荧光法鉴定单克隆抗体的类型、特异性及敏感性.结果 细胞融合率达100%,经克隆筛选获4株稳定分泌抗狂犬病病毒抗体的杂交瘤细胞株,其腹水效价分别为1×104,1×105,1×104和1×105;4株单抗均为IgG类型且特异性好.结论 制备的单抗具有良好特异性和敏感性.     

中国狂犬病固定毒aG株N,NS和M蛋白基因的核苷酸序列测定

报告了中国狂犬病固定毒ａＧ株核衣壳蛋白（Ｎ蛋白），核蛋白壳磷酸蛋白（ＮＳ蛋白，又称Ｍ１蛋白）和基质蛋白（Ｍ蛋白，又称Ｍ２蛋白）蛋白基因的核苷酸序列和氨基酸推导序列。各基因编码区的全长分别是：Ｎ基因１３５２，ＮＳ基因８９４和Ｍ基因６０９个核苷酸。ａＧ和ＣＶＳ株的Ｎ，ＮＳ和Ｍ基因的核苷酸序列都具有高的同源性，分别为９１．９５％，９０．２７％和９０．８０％。