Camk2b低表达对1,4-苯醌致K562细胞线粒体毒性的影响

目的：探讨钙/钙调素依赖性蛋白激酶2β（Camk2b）低表达对1,4-苯醌（1,4-BQ）致K562细胞线粒体毒性的影响,初步揭示Camk2b对于细胞抗氧化损伤的作用和意义。方法：检测在1,4-BQ染毒后K562细胞Camk2b mRNA的表达,选择Camk2b抑制剂KN93的适宜浓度,通过荧光定量PCR法和Western blot法验证Camk2b mRNA和蛋白表达,构建Camk2b低表达K562细胞。在0、10、20 μmol/L 1,4-BQ染毒后,通过细胞增殖实验、活性氧实验、ATP生成量实验、线粒体膜电位实验、钙离子检测实验及细胞凋亡实验,检测Camk2b低表达K562细胞和对照细胞的增殖、活性氧、ATP、线粒体膜电位、凋亡率的改变。结果：1,4-BQ染毒后K562细胞Camk2b mRNA的表达下降。与对照细胞相比,Camk2b低表达细胞ATP生成量降低,线粒体膜电位降低,钙离子浓度升高,凋亡率上升（P均 < 0.01）。1,4-BQ染毒后,与相同浓度1,4-BQ染毒对照细胞相比,Camk2b低表达细胞ROS水平升高,ATP生成量降低,线粒体膜电位降低,钙离子浓度升高,凋亡率上升（P均 < 0.05或0.01）。结论：1,4-BQ染毒后,K562细胞Camk2b mRNA的表达降低。与对照细胞相比,Camk2b低表达细胞在1,4-BQ染毒后出现更明显的线粒体损伤,Camk2b对于细胞的抗氧化损伤具有重要意义。     

HIF-1α高表达对苯代谢物诱导K562细胞毒性的影响

目的：研究缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）高表达对苯代谢物1,4-苯醌、氢醌、苯酚诱导K562细胞毒性的影响。方法：用不同浓度的1,4-苯醌（0、10、20、40、80 μmol/L）、氢醌（0、10、20、40、80 μmol/L）、苯酚（0、1、1.5、2、2.5、5 mmol/L）分别染毒对照组K562细胞及高表达HIF-1α的K562细胞24 h,MTT法检测细胞增殖情况,PI/FITC Annxein V双染结合流式细胞术检测细胞凋亡率,碘化丙啶结合流式细胞术检测细胞周期。结果：MTT实验结果显示,1,4-苯醌染毒后,两株细胞均出现增殖率下降且呈剂量效应关系,1,4-苯醌浓度为80 μmol/L时,高表达HIF-1α的K562细胞增殖率高于对照组K562细胞（P < 0.05）。氢醌和苯酚在较高浓度染毒后,对照组K562细胞亦出现增殖抑制,而高表达HIF-1α的K562细胞增殖无明显抑制。流式细胞术结果显示,1,4-苯醌染毒后,两株细胞的细胞凋亡率增加且呈剂量效应关系。20 μmol/L浓度1,4-苯醌染毒时,高表达HIF-1α的K562细胞较对照组K562细胞凋亡减弱（P < 0.05）。氢醌和苯酚染毒后,两株细胞的凋亡率与未染毒组比较,差异均无统计学意义（P均 > 0.05）,高表达HIF-1α的K562细胞的凋亡率较对照组K562细胞亦无显著差异。细胞周期检测结果显示,3种苯代谢物均可引起K562细胞周期阻滞在G0/G1期或S期。结论：3种苯的代谢物中,1,4-苯醌对K562细胞的毒性大于氢醌和苯酚,HIF-1α高表达可降低苯代谢物引起的细胞毒性,其作用的发挥可能是通过调节细胞增殖及凋亡而实现。     

维生素E琥珀酸酯诱导K562/ADM细胞凋亡过程中线粒体结构和功能的改变

目的：观察维生素E琥珀酸酯（vitamin E succinate，VES）诱导K562／ADM耐药细胞凋亡过程中线粒体形态及功能的改变。方法：采用annexin V／PI双标记法和透射电镜检测K562／ADM细胞凋亡；电镜观察凋亡细胞线粒体形态结构变化；流式细胞仪（FCM）检测线粒体跨膜电位（△ψm）和caspase-3活性变化；激光共聚焦显微镜分析细胞色素C（cytochrome c，Cyt c）的释放。结果：20μmol／L和40μmol／L VES处理K562／ADM细胞12～24h，annexin V／PI染色检测发现早期凋亡细胞明显增加，并呈现典型的凋亡形态改变。线粒体内外膜融合、缩小、碎片化，嵴减少且紊乱；线粒体△ψm降低，细胞质内Cytc释放增多；caspase-3活性显著增强。结论：VES可能通过改变线粒体的形态结构和稳定性，导致线粒体膜电位降低，Cytc释放，caspase-3激活而诱发K562／ADM耐药细胞凋亡。     

G6PD缺陷对 1,4-苯醌致K562细胞DNA甲基化的影响及其机制

目的：研究G6PD缺陷对1,4-苯醌（1,4-BQ）致K562细胞DNA甲基化的影响及其机制。方法：分别采用10和20 μmol/L的1,4-BQ溶液对G6PD缺陷K562细胞和正常表达细胞进行染毒,以未染毒组为对照,各组均设置12、24、48 h共3个染毒时间,另在20 μmol/L 1,4-BQ染毒组细胞中加入1.5 mmol/L谷胱甘肽（GSH）进行干预。采用比色法检测全基因组DNA甲基化相对水平,qPCR法检测甲基转移酶DNMT1、DNMT3a、DNMT3b mRNA表达水平,Western blot法检测DNMT1、DNMT3a蛋白表达水平。结果：10和20 μmol/L 1,4-BQ染毒后的K562细胞全基因组DNA甲基化水平升高（P<0.05）,除20 μmol/L 1,4-BQ染毒48 h组外,其他各染毒组的G6PD缺陷K562细胞全基因组DNA甲基化水平均高于正常细胞（P<0.05）。在1,4-BQ染毒后,G6PD缺陷细胞的DNMT1、DNMT3a、DNMT3b mRNA水平以及DNMT1、DNMT3a蛋白表达水平均高于正常细胞（P<0.05）。加入GSH后,G6PD缺陷细胞和正常细胞的全基因组DNA甲基化相对水平、DNMTs mRNA及蛋白表达水平的差异的无统计学意义（P均>0.05）。结论：G6PD缺陷可能以抑制K562细胞GSH合成的方式增加氧化应激水平,最终导致细胞DNMTs生成的增多以及全基因组DNA甲基化程度的升高。     

PKF118-310对白血病K562细胞凋亡的影响及其机制

目的：探讨小分子化合物PKF118-310对人慢性粒细胞白血病（CML）K562细胞凋亡的影响及其机制。方法用不同浓度PKF118-310处理K562细胞,用四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测其对细胞增殖的抑制;免疫荧光法观察细胞核β-catenin／TCF转录复合物的形成;流式细胞术检测细胞凋亡;Western blot检测caspase-3、caspase-8、XIAP、bcl-2、β-catenin、TCF、C-myc及cyclin D1的表达。结果PKF118-310能够抑制K562细胞生长,其对K562细胞在24、48、72 h的半数抑制浓度（IC50）值分别为5.388、3.290、1.566μmol ／L。细胞核内形成β-catenin／TCF转录复合物。分别用1.6、3.2μmol／L的PKF118-310作用于K562细胞48 h后,经Annexin V-FITC／碘化丙啶（PI）双标检测细胞凋亡率分别为（48.0±0.9）%、（80.2±1.2）%,均高于对照组的（1.2±0.6）%（均P＜0.05）。不同浓度PKF118-310处理K562细胞72 h后,caspase-3及caspase-8蛋白表达均高于对照组（均P＜0.05）,而XIAP、bcl-2、β-catenin、TCF、c-myc及cyclin D1蛋白表达均低于对照组（均P＜0.05）。结论PKF118-310可抑制K562细胞增殖,并诱导其凋亡。     

新型多胺缀合物NNAMB诱导K562细胞凋亡及其机制

目的 探讨新型多胺缀合物NNAMB诱导K562细胞凋亡及其分子机制.方法 采用二苯基溴化四氮唑蓝(MTT)法、台盼监拒染法检测细胞活力;Hoechst33258染色观察细胞形态变化;流式细胞仪检测细胞周期变化、凋亡率、线粒体膜电位的变化;Western blot检测caspase-3、caspase-8、caspase-9和cytochrome c的表达.结果 NNAMB抑制K562细胞的生长,并呈现剂量及时间依赖性.随着NNAMB浓度的增加和作用时间的延跃,Sub-G1期细胞明显增加,线粒体膜电位下降.经NNAMB处理后的K562细胞中,可见到明显的凋亡细胞.蛋白印迹检测表明,NNAMB可诱导caspase-3、easpase-9的活化及线粒体cytochrome c释放到胞浆中,但caspase-8的表达无明显变化.结论 NNAMB能显著抑制K562细胞增殖,并可通过内源性线粒体途径诱导细胞凋亡.     

三氧化二砷诱导K562细胞凋亡机制的研究

目的了解三氧化二砷(As2O3)诱导慢粒细胞系K562细胞株凋亡是否与线粒体跨膜电位(mitochondrial transmembrane potentials,△ψm)改变有关及其可能机制。方法联合应用As2O3、DTT和BSO处理K562细胞株,通过细胞内荧光染料PI/Rh123的色强度分析(△ψm),测定细胞活力、亚G1期细胞含量及形态学观察等鉴定细胞凋亡。结果As2O3可明显诱导K562细胞线粒体△ψm下降。BSO可加强As2O3诱导的K562细胞凋亡和线粒体△ψm下降,而DTT则有部分拮抗作用。在2×10-6mol/L As2O3处理72h的K562细胞,PI-Rh123-细胞达(26.0±2.5)%,当1×10-3mol/LBSO同时处理时,PI-Rh123-细胞和凋亡细胞数上升达(37.2±5.7)%和(39.1±4.5)%;而当2×10-4mol/L DTT同时处理时,PI-Rh123-细胞和凋亡细胞数分别降至(11.5±1.3)%和(15.4±3.5)%。结论线粒体跨膜电位下降是As2O3诱导K562细胞凋亡的关键环节,其机制可能与巯基氧化有关,巯基可能是As2O3凋亡细胞的重要靶分子。     

青蒿素诱导K562细胞凋亡研究

[目的]研究青蒿素对体外培养的K562细胞的凋亡诱导作用及机制。[方法]MTT法测定药物对K562细胞生长的抑制作用；透射电镜观察药物对K562细胞形态学的影响；流式细胞仪检测经药物作用后的细胞凋亡率；用Rhodamine(Rhl23)染色法检测细胞线粒体跨膜电位(Δψm)的变化。[结果]青蒿素对K562细胞生长有明显的抑制作用，细胞经药物作用48小时后的IC50为26．51μmol／L；电镜观察细胞有典型的凋亡形态特征；细胞凋亡率在一定范围内与药物浓度正相关。给药后跨膜电位明显下降。[结论]青蒿素可抑制K562细胞的生长，诱导K562细胞跨膜电位下降而导致细胞凋亡。     

姜黄素活化caspase-3诱导食管癌Ec-109细胞凋亡的研究

目的探讨姜黄素活化caspase-3诱导食管癌Ec-109细胞凋亡的作用机制。方法20、40、80mmol/L姜黄素作用于食管癌Ec-109细胞,流式细胞仪检测细胞亚二倍体凋亡峰变化及线粒体膜电位变化;Western-blot检测细胞色素C释放及caspase-3表达。结果姜黄素呈剂量依赖性诱导食管癌Ec-109细胞凋亡,20、40、80mmol/L姜黄素作用后,细胞亚二倍体凋亡峰分别为（16.07±1.71）%、（25.54±1.25）%、（37.67±1.09）%,对照组为（3.65%±0.56）%,比较有统计学意义（F=6.14,P〈0.01）。上述浓度姜黄素作用6小时后线粒体膜电位出现降低,比较均有统计学意义（F=5.37,P〈0.05）;12小时出现细胞色素C表达,24小时检测到caspase-3表达,且姜黄素浓度越高,细胞色素C及caspase-3表达越明显。结论姜黄素通过损伤细胞线粒体,使之释放出细胞色素C,激活caspase-3,而且其呈剂量依赖性诱导食管癌细胞凋亡。     

环孢霉素A对葡萄糖氧化酶诱导的HepG2线粒体功能损伤和细胞凋亡的保护作用

目的： 探讨环孢霉素A(CsA)对葡萄糖氧化酶(GOX)诱导的肝细胞线粒体功能损伤和细胞凋亡的影响。方法：HepG2细胞分别给予不同浓度的GOX和CsA处理,MTT 法检测细胞活力,确定所要选用的剂量和时间点。以10μmol/L的CsA 预处理2h, 并给予25U/LGOX 处理12h作为CsA+GOX组,同时设立空白对照组、GOX阳性对照组、CsA阴性对照组。分别采用Annexin V/PI双染色结合流式细胞术检测细胞凋亡率;GENMED活体细胞线粒体膜通道孔荧光试剂盒检测线粒体膜通透性转换;JC-1染色激光共聚焦检测线粒体膜电位变化;ATP检测试剂盒检测细胞内ATP水平;液相氧电极法检测线粒体耗氧量。结果：MTT 结果显示GOX能诱导HepG2细胞活力下降,且呈现时间和剂量效应关系(P均<0.05);与空白对照组比较,25U/LGOX作用12h可诱导HepG2细胞凋亡,同时伴有线粒体膜通道开放和膜电位下降,细胞内ATP水平和线粒体耗氧量下降(P均<0.05),而10 μmol/L的CsA预处理2h有一定的保护作用,可以有效阻断线粒体结构功能的损伤,降低凋亡率,CsA+ GOX组与GOX阳性对照组比较差异均具有统计学意义(P均<0.05)。结论：CsA对氧化应激诱导的肝细胞线粒体功能损伤和凋亡具有保护作用。     

Involvement of ROS in the inhibitory effect of thermotherapy combined with chemotherapy on A549 human lung adenocarcinoma cell growth through the Akt pathway

Mechanisms of synergistic effect of thermotherapy and chemotherapy on human lung adenocarcinoma cell growth are unclear. The purpose of this study was to investigate these effects and explore the function of ROS, Akt and caspase-3 in relation to these. A549 cells were subjected to different thermochemotherapy treatments: 43?C heat + 50?μg/l paclitaxel (thermochemotherapy group), 43?C heat + 50?μg/l paclitaxel + 1?μmol/l wortmannin (wortmannin group), 43?C heat + 50?μg/l paclitaxel + 30?μmol/l NAC (NAC group) and 50?μg/l paclitaxel (chemotherapy group). The cells without any treatment were regarded as controls. Cell proliferation rates were measured with MTT assay and intracellular ROS levels were detected with fluorescence labeling technologies. Phosphorylation of Akt and caspase-3 expression were determined by western blotting and the cell apoptosis rates were examined by flow cytometry. Tests in?vivo were carried out at the same time. It was found that the cell proliferation rates of the thermochemotherapy group were significantly lower compared to those of the controls or the chemotherapy group (P<0.05). The intracellular ROS levels of the thermochemotherapy group were elevated significantly compared with those of other groups, and these changes could be reversed using the ROS inhibitor NAC but not a PI3K inhibitor (wortmannin). Phosphorylation of Akt was significantly decreased in the thermochemotherapy group (P<0.05), which could be blocked by wortmannin, but increased by NAC (P<0.05). The caspase-3 expression levels and cell apoptosis rates of the thermochemotherapy group were higher compared to those of the other groups (P<0.05). All results have been confirmed by in?vivo tests. Thus, the combination of thermotherapy with chemotherapy showed a stronger inhibitory effect on A549 cell growth compared to chemotherapy alone, which may be able to cause additional cell apoptosis through inhibition of Akt phosphorylation and activation of caspases by increased intracellular ROS production.     

2-甲氧基雌二醇对白血病K562细胞凋亡相关基因表达的影响及其机制

 目的　探讨2-甲氧基雌二醇（2-ME）对白血病K562细胞凋亡的影响及其作用机制。方法　实验分为3组,对照组：培养基中不含2-ME;实验组：分别用1、2、4、8、16μmol／L的2-ME处理K562细胞36 h后观察各项指标的变化;阴性对照组：培养液中以无RNase蒸馏水代替K562细胞。应用原位细胞凋亡法（TUNEL）、流式细胞术（FCM）、半定量RT-PCR及黄嘌呤氧化酶法分别检测K562细胞凋亡率、Caspase-3、性连锁凋亡抑制蛋白（XIAP）及其基因表达、超氧化物歧化酶（SOD）与活性氧（ROS）水平。结果　不同浓度的2-ME与K562细胞作用36 h后,2-ME在一定的浓度范围内以剂量依赖形式诱导K562细胞凋亡;2-ME通过上调促凋亡因子Caspase-3和（或）下调抗凋亡因子XIAP的表达,降低SOD及增加ROS水平等途径促进K562细胞凋亡,这可能是2-ME诱导K562细胞凋亡的机制之一。结论　2-ME能够以剂量依赖形式诱导K562细胞凋亡,显示了其在慢性粒细胞白血病（CML）治疗中的潜在价值。     

Susceptibility of HIV-1-TAT transfected cells to undergo apoptosis. Biochemical mechanisms

The effects of HIV-1 Tat protein on mitochondria membrane permeability and apoptosis were analysed in lymphoid cells. In this report we show that stable-transfected HIV-Tat cells are primed to undergo apoptosis upon serum withdrawal. This effect was observed in both the Jhan T cell line and the K562 cells, the latter expressing the bcr-abl chimeric gene, which confers resistance to apoptosis induced by different stimuli. Using a cytofluorimetric approach we have determined that serum withdrawal induces a disruption of the transmembrane mitochondrial potential (Deltapsim) followed by an increase of reactive oxygen species (ROS) and the subsequent DNA nuclear loss in K562-Tat cells but not in the K562-pcDNA cell line. These pre-apoptotic events were associated with the cleavage of the caspase-3, while the expression of Bcl-2, Bcl-XL and Bax proteins was not affected by the presence of Tat. Regardless of the steady state of the Bax protein, we found that in both K562 and K562-Tat cells, this protein is located in the nucleus, but after serum withdrawal its localization was mainly in the cytoplasm. The activity of caspase-3 detected in K562-Tat cells after serum withdrawal paralleled with the mitochondria permeability transition. Nevertheless, in Jhan-Tat cells the inhibition of this caspase with the specific inhibitor, z-DEVD-cmk, did not affect the disruption of the mitochondria potential induced by serum withdrawal. Interestingly, we found that HIV-Tat protein accumulates at the mitochondria in the K562-Tat cells cultured under low serum conditions, and this mitochondrial localization correlated with the Deltapsim disruption detected in these cells. In addition, HIV-1 Tat protein synergies with protoporphyrin IX (PPIX), a ligand of the mitochondrial benzodiazepine receptor, in the induction of apoptosis in both Jhan and K562 cells. Thus, HIV-1 Tat protein may induce apoptosis by a mechanism that involves mitochondrial PT and may contribute to the lymphocyte depletion seen in AIDS patients.     

1,4-二（2-苄硒乙氧基）蒽诱导人喉癌Hep-2细胞凋亡的研究

背景与目的：硒是人类生命活动中必不可少的微量元素之一,对人类健康的巨大作用是其他物质无法替代的。硒的小分子化合物1,4-二(2-苄硒乙氧基)蒽{1,4-bis[2-(benzylselanyl)ethoxy] anthracene, BSEA}具有杀菌消炎的作用,但BSEA的抗癌作用尚未见报道。该研究旨在探讨BSEA诱导人喉癌Hep-2细胞凋亡及其作用机制。方法：不同浓度的BSEA处理人喉癌Hep-2细胞24 h后,采用四甲基偶氮唑盐(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)法检测细胞生长抑制率;在荧光显微镜下观察细胞形态;Annexin Ⅴ-FITC法检测细胞凋亡;JC-1检测线粒体膜电位;酶标分析仪检测caspase-3和caspase-8活性;实时荧光定量聚合酶链反应(real-time flu-orescent quantitative polymerase chain reaction,RTFQ-PCR)和蛋白[质]印迹法(Western blot)分别检测Bax、XIAP mRNA和蛋白表达水平。结果：BSEA处理人喉癌Hep-2细胞24 h后,BSEA对其生长抑制呈剂量依赖性,IC50为35.74μmol/L;80μmol/L BSEA处理的Hep-2细胞在荧光显微镜下可观察到明显的凋亡小体;磷脂酰丝氨酸外翻加剧;线粒体膜电位开始下降;caspase-3活性的影响呈剂量依赖趋势,而caspase-8活性未见显著变化;Bax的mRNA和蛋白表达水平上升,XIAP的mRNA和蛋白表达水平下降。结论：BSEA对人喉癌Hep-2细胞生长有明显的抑制作用,并能通过线粒体途径诱导细胞凋亡。     

线粒体途径在大黄素促人混合培养淋巴细胞凋亡中的作用

目的:探讨大黄素促进人混合培养淋巴细胞凋亡的作用机制,为进一步研究大黄素的免疫抑制作用奠定实验基础。方法:建立混合淋巴细胞培养模型,给予不同浓度大黄素（1μmol/L、10μmol/L、100μmol/L）培养24、48、72h后检测各组淋巴细胞凋亡、细胞内活性氧及线粒体膜电位情况。Western blot法检测共培养48h后淋巴细胞中细胞色素C、caspase-3、caspase-9、Bcl-2/Bax蛋白表达变化。给予还原性谷胱甘肽（GSH）清除细胞内活性氧后,检测其对线粒体膜电位及淋巴细胞凋亡的影响。结果:随着培养时间和药物浓度的增加,大黄素对淋巴细胞增殖抑制和促凋亡作用逐渐增强,呈现浓度和时间依赖性。高浓度大黄素提高细胞内活性氧、降低线粒体膜电位水平,激活线粒体凋亡通路。使用还原性谷胱甘肽清除细胞内活性氧后,能够降低线粒体膜电位和淋巴细胞凋亡率。结论:线粒体信号途径的激活在大黄素促淋巴细胞凋亡中发挥重要作用。     

异烟肼通过ROS/Caspase-3信号通路诱导L-02细胞凋亡及槲皮素的保护作用

目的：探讨ROS/Caspase-3信号通路在异烟肼（INH）诱导人正常肝细胞（L-02细胞）凋亡中的作用及槲皮素的保护效应。方法：将L-02细胞随机分为对照组、INH组（10 mmol/L INH）、25 μmol/L槲皮素组（10 mmol/L INH和25 μmol/L槲皮素）、50 μmol/L槲皮素组（10 mmol/L INH和50 μmol/L槲皮素）。各组均处理24 h后,应用MTT法检测L-02细胞存活率,分光光度法检测细胞上清液中LDH活性,Hoechst33258荧光染色法检测细胞凋亡率;制备L-02细胞线粒体,利用DCFH-DA和Rho-123荧光探针检测活性氧（ROS）水平及线粒体膜电位（△Ψm）,应用Western blot检测Caspase-3蛋白的表达。结果：与对照组比较,INH组细胞存活率显著降低（P < 0.01）,与INH组比较,50 μmol/L槲皮素处理组细胞存活率明显增加（P < 0.01）;INH组细胞LDH活性、细胞凋亡率、线粒体ROS水平较对照组显著升高（P < 0.01）,25和50 μmol/L槲皮素组细胞LDH活力、细胞凋亡率、线粒体ROS水平较INH组明显降低（P < 0.05或P < 0.01）,且50 μmol/L槲皮素组作用更显著;INH组细胞线粒体△Ψm较对照组显著降低（P < 0.01）,25和50 μmol/L槲皮素组细胞线粒体△Ψm较INH组明显升高（P < 0.05或P < 0.01）,50 μmol/L槲皮素组的作用更加明显;与对照组比较,INH组细胞Caspase-3蛋白表达显著增加（P < 0.01）,与INH组比较,25和50 μmol/L槲皮素组细胞Caspase-3蛋白表达明显减少（P < 0.05或P < 0.01）,且50 μmol/L槲皮素组作用更明显。结论：INH可以诱导L-02细胞发生凋亡,ROS/Caspase-3信号通路参与了其凋亡的过程;槲皮素对INH诱导的细胞凋亡具有保护效应,机制可能与其减少ROS释放,抑制ROS/Caspase-3信号通路有关。