建立基于自主复制型载体的端粒酶转录调节细胞系

端粒酶通过催化端粒合成，保持端粒长度，从而保证细胞的持续分裂能力。其活性与生殖细胞和干细胞的增殖，体细胞的衰老和异常增殖、癌变等病理生理过程密切相关。逆转录催化亚单位hTERT的转录调节是端粒酶活性调节中的限速步骤，然而，目前对hTERT基因表达的具体机制仍不明了。研究基因转录调控的体内方法多通过瞬时转染及检测报告基因表达情况来分析启动子活性。由于众多因素的存在，这种瞬时转染的敏感性较低、重复性差。如将报告基因整合细胞基因组则容易受到基因组本身的影响。复制子Episome是一类可以在细胞中以染色体外形式独立复制的环状质粒。本研究中，我们运用EB病毒的复制子载体p220，建立了稳定的hTERT启动子介导-荧光素酶报告细胞系，并以此分析了c—MYC，p53基因对hTERT启动子的转录调节作用。     

P53对涎腺腺样囊性癌细胞端粒酶活性的抑制作用

目的为了探讨P53基因对腺样囊性癌细胞端粒酶活性的抑制作用及机制。方法构建携带人野生型P53基因的腺病毒表达载体，以脂质体法瞬时转染腺样囊性癌SACC-83细胞，RT-PCR检测转染细胞P53基因mRNA的表达，TRAP-PCR-ELISA法检测转染细胞端粒酶活性的改变。并将P53基因与含有hTERT启动子核心调控区的荧光素酶报告基因pGL2—630共转染SACC-83细胞，测定转染细胞荧光素酶报告基因活性。结果1．瞬时转染含人野生型P53基因的重组腺病毒表达载体p△E1-P53于腺样囊性癌SACC-83细胞后，其P53基因mRNA的表达明显增强；2．基因转染后，SACC-83细胞内源性端粒酶活性显著降低。3．P53基因与含有hTERT启动子核心调控区的荧光素酶报告基因pGL2-630共转染SACC-83细胞后，其荧光素酶活性显著下降。结论外源性表达P53基因可以降低腺样囊性癌细胞SACC-83细胞端粒酶活性，并可能通过抑制端粒酶hTERT基因启动子的转录活性实现。     

辐射敏感性启动子调控CD基因表达联合125I照射对膀肤癌EJ细胞的杀伤作用

以脂质体介导的辐射敏感性基因联合胞嘧啶脱氨酶(cytosine deantinase,CD)基因转染膀胱癌EJ细胞,研究放射性核素125 I照射后5-氟胞嘧啶(5-fluorocytosine,5-FC)对转染膀胧癌EJ细胞的杀伤作用.人工合成辐射敏感性启动子E8,将启动子克隆至质粒pCD2的CD基因上游,构建以E8为...     

SPA基因启动子的克隆及转录靶向活性分析

目的：克隆大鼠肺表面活性蛋白A（SPA）基因启动子并构建该启动子的荧光报告系统,探讨该启动子的活性及转录靶向性，为进一步研究SPA 基因的表达调控机制和探讨靶向性基因治疗奠定基础。方法:①从GenBank中获取大鼠SPA 基因序列，对其上游基因组序列进行计算机生物信息学分析，推断其上游序列约163bp的区域具有启动子功能。②利用PCR技术扩增SPA 基因上游启动子序列,将其亚克隆入pGL3-basic 中,构建pGL3-SPA 质粒，将其亚克隆于pGL3-control 中，构建pGL3-SPA-enhancer 质粒。③将构建pGL3-SPA质粒、pGL3-SPA-enhancer 质粒、pGL3-control质粒和pGL3-basic 质粒分别与内参质粒pRL-TK共转染入A549细胞和H441细胞, 用双荧光素酶报告系统检测该质粒在两种细胞中的荧光素酶活性表达。 结果:酶切及测序结果均证实成功克隆了SPA基因启动子序列,并已将该序列正确插入到荧光素酶报告基因系列载体中。重组的pGL3-SPA-enhancer 质粒、pGL3-SPA质粒转染H441 细胞后可以检测到荧光素酶的高表达。结论:成功构建了含有SPA 基因启动子序列的荧光素酶基因报告系统,证实了它在高表达SPA蛋白的细胞中有较高的转录活性， 为下一步研究SPA 基因功能及其转录调控以及探讨基因治疗的靶向性奠定了基础。     

新基因AngRem104对纤粘连蛋白基因上游序列的调控分析

目的：探讨新基因AngRem104对纤粘连蛋白（FN）基因启动子转录活性的影响，为揭示AngRem104对FN表达的调控机制提供线索。 方法： 构建了FN基因上游调控序列的系列缺失体-荧光素酶（luciferase）报告基因，瞬时转染人系膜细胞，检测报告基因的活性变化。 结果： FN507-pGL3+正义AngRem104质粒转染组和FN1280-pGL3+正义AngRem104质粒转染组的luciferase相对活性较FN122-pGL3+正义AngRem104质粒转染组luciferase相对活性明显升高（P＜0.01）。 结论： 在FN基因上游调控序列中-122到-507之间存在新基因AngRem104的正反应调控区。     

HIV-1感染相关细胞因子IFN-γ通过Rta基因启动子激活人类疱疹病毒8型

目的　研究HIV 1感染中相关细胞因子IFN γ对人类疱疹病毒 8型 (HHV 8)Rta基因启动子活性影响 ;评价Rta基因启动子在多种细胞中的启动活性。方法　将已构建的HHV 8Rta启动子 虫荧光素酶报告基因重组质粒和含HIV 1Tat基因重组表达质粒转染多种细胞 ,转染后 2 4h加入IFN γ和 或重组HIV 1gp12 0刺激 ,刺激后 2 4h收集细胞 ,进行虫荧光素酶活性检测。试验同时以佛波酯类化合物TPA刺激为阳性对照 ,进行最佳刺激时间点的选择和不同转染方法转染效率的比较。结果　①HHV 8Rta启动子启动活性在TPA刺激后的 2 4h达到最高峰 ;②HHV 8Rta启动子启动活性的发挥不依赖于HHV 8和 或EBV基因组的存在 ,且在血管内皮细胞 (HUVECs)中启动活性最佳 ;③IFN γ可以诱导Rta启动子活性 ;但HIV 1Tat和gp12 0蛋白与IFN γ协同上调Rta启动子活性的能力较弱。结论　HIV 1感染中相关细胞因子IFN γ至少部分通过Rta基因启动子激活HHV 8的复制     

HBV通过增强DNAJB4启动子活性调节其在HepG2.2.15细胞中的表达

目的 初步探讨HBV与DNAJB4基因的转录调节作用机制.方法 用RT-PCR及Real-time PCR检测HepG2.2.15细胞和HepG2细胞中DNAJB4在mRNA水平上的表达差异.构建DNAJB4启动子虫荧光素酶报告质粒,分别与HBV、HBs、HBp、HBc、HBx表达质粒共转染HepG2细胞,比较虫荧光素酶活性.结果 在mRNA水平上,DNAJB4在HepG2.2.15细胞中的表达量是其在HepG2细胞中表达量的2.59倍,且二者有显著性差异(P＜0.01).DNAJB4启动子虫荧光素酶报告质粒与HBV表达质粒共转染组的相对荧光素酶活性是其对照组的2.28倍.转染HBs和HBc表达质粒组的相对荧光素酶活性分别是其对照组的2.11倍和1.77倍,而HBx、HBp表达质粒对荧光素酶活性没有影响.结论 在HepG2.2.15细胞中,HBV能通过增强DNAJB4启动子活性增加DNAJB4转录水平的表达,其中HBs和HBc蛋白起主要作用.     

Wilson病ATP7B基因启动子区突变对基因表达的影响

目的 探讨Wilson病ATP7B基因启动子区突变与Wilson发病的关系。方法 在48例患者中发现2例存在-183（C→T）突变，对发现存在突变的样本的DNA片段进行分离，克隆入pGL2荧光素酶报告基因，转染细胞，测定荧光素酶的活性，以野生型的ATP7B基因启动子作为对照，分析ATP7B基因启动子点突变对转录活性的影响。结果 含正常与含突变ATP7B启动子区序列的pGL2载体的荧光素酶转录活性相比较差异无统计学意义（n=3，P〉0．05）。结论 启动子区-183（C→T）突变不影响基因转录活性。提示该突变的意义有待进一步的探讨。     

人支气管上皮细胞GCLC基因调控区ARE及E-box顺式调控元件调控功能的研究

目的 通过对人γ-谷氨酰半胱氨酸酶催化亚单位(GCLC)基因调控区的ARE及E-box顺式调控元件诱导缺失突变,研究它们在人支气管上皮细胞内对GCLC基因转录调控功能的影响.方法 应用PCR方法克隆人GCLC基因调控区的大部分核苷酸序列,构建表达虫荧光素酶报告基因的野生型质粒PL45.采用PCR重叠延伸产生特异位点诱变的方法对ARE及E-box顺式调控元件进行缺失突变,构建相应的突变型质粒PLdel-ARE及PLdel- E-box.通过瞬时基因转染方法将上述质粒转染人支气管上皮细胞系16HBE,观察基因突变后的基因转录调控功能.结果 质粒PL45的虫荧光素酶相对活性值为9949.75±1441.33、质粒PLdel-ARE的虫荧光素酶相对活性值为21258.75±1563.64、质粒PLdel-E-box的虫荧光素酶相对活性值为17082.00±89.51.与野生型质粒PL45相比,PLdel-ARE、PLdel-E-box突变型质粒表达的虫荧光酶相对活性值显著上升.结论 ARE及E-box顺式调控元件具有负性调控作用.     

膀胱肿瘤细胞产生的白介素-10对T细胞功能的抑制作用

目的 :了解膀胱肿瘤细胞产生的白介素 10对T细胞功能的抑制作用。方法 :用ELISA法检测膀胱肿瘤细胞株EJ、T2 4和正常移行上皮细胞培养上清中IL 10含量。用MTT法检测加与不加IL 10拮抗剂时膀胱肿瘤细胞株EJ、T2 4和正常移行上皮细胞对共培养的T细胞增殖情况的影响。结果 :EJ和T2 4细胞培养上清中IL 10水平明显高于正常移行上皮和T细胞 (P <0 0 1)。EJ组与IL 10阻断EJ组比较 ,T细胞的增殖反应降低 (P <0 0 5 ) ;IL 10阻断EJ组与IL 10阻断正常移行上皮组、正常移行上皮组、IL 10阻断T细胞组和T细胞组比较 ,T细胞的增殖反应降低 (P <0 0 5 ) ;T2 4组与IL 10阻断T2 4组比较 ,T细胞的增殖反应降低 (P <0 0 5 ) ,IL 10阻断T2 4组与IL 10阻断正常移行上皮组、正常移行上皮组、IL 10阻断T淋巴细胞组和T淋巴细胞组比较T淋巴细胞的增殖反应降低 (P <0 0 5 )。结论 :膀胱肿瘤细胞株EJ、T2 4细胞可通过产生IL 10 ,抑制T细胞增殖能力 ,但可能还存在其它机制。     

Bcl-2 siRNA表达载体的构建及生物活性鉴定

目的: 构建bcl-2特异性siRNA真核细胞表达载体，并初步观察其对膀胱癌细胞生长的影响。方法： 根据GenBank 提供的bcl-2 cDNA序列，设计双链小干扰RNA（siRNA），再转化为能表达其小发卡结构RNA（shRNA）的DNA 序列，并与含U6启动子的pGenesil-1质粒定向连接，构建真核表达载体pGenesil-1545、pGenesil-1555。经限制性内切酶酶切和DNA测序进行鉴定。转染T24细胞，采用半定量RT-PCR观察重组质粒对bcl-2 mRNA表达的影响；用MTT法观察重组质粒对T24细胞体外生长的抑制作用。结果: 构建了bcl-2 siRNA的真核表达载体pGenesil-1545、pGenesil-1555，并经限制性内切酶酶切和DNA 测序证实与设计完全一致。转染T24细胞72 h后，RT-PCR显示bcl〖STBX〗-2〖STBZ〗基因表达下调接近80％；MTT发现T24细胞的体外生长受到明显抑制。结论: bcl-2的特异性siRNA真核细胞表达载体成功构建，有效沉默 bcl-2在膀胱癌细胞中的表达，抑制了癌细胞的生长。     

F10基因对转录因子NF-κB、AP1活性的影响

目的： 研究F10基因对转录因子NF-κB、AP1活性的影响。方法：质脂体共转染F10基因和报道质粒NF-κB-Luc、 AP1-Luc，通过测定荧光素酶的活性以确定F10基因对NF-κB和AP1转录活性的影响;提取各实验组不同时点细胞核蛋白，用电泳迁移率改变实验（electrophoretic mobility shift assay, EMSA）检测AP1、NF-κB和DNA的结合活性。结果: F10基因瞬间转染A549细胞48 h NF-κB-Luc和AP1-Luc荧光素酶的活性较其对照组分别下降0.3和上升2倍、AP1和NF-κB与DNA的结合活性分别上升23%和下降49%。结论：F10基因上调AP1活性、下调NF-κB的活性。     

Adiponectin 基因转染对肌细胞糖原合成和葡萄糖氧化的影响

目的：研究adiponectin对C2C12肌细胞糖原合成和葡萄糖氧化的影响。 方法： 用阳离子脂质体介导转染和随后G418筛选建立稳定转染小鼠adiponectin cDNA真核表达质粒（pcDNA3.0-mad）及空载pcDNA3.0的C2C12细胞株并鉴定。C2C12肌细胞糖代谢实验分对照组、空载体组和pcDNA3.0-mad(mad)组共3组进行，每组又分 0、0.5、5、100 nmol/L胰岛素刺激4个亚组。通过液闪测定细胞合成的糖原中［14C］的放射活性和氧化产生的［14CO2］，分别检测肌细胞的糖原合成和葡萄糖氧化情况。 结果： Western blotting和免疫组化检测证实mad组细胞表达adiponectin蛋白。Mad组葡萄糖氧化量随胰岛素浓度增加的速率较其它两组快，对照、空载体和mad组线性回归系数分别为23.34、23.23和26.06。Mad组C2C12肌细胞基础状态下和胰岛素刺激下的葡萄糖氧化和糖原合成与其它两组无显著差异（P>0.05）。 结论： 转染adiponectin基因对C2C12肌细胞葡萄糖氧化和糖原合成无显著影响。     

3种反义核酸增加白血病细胞K562对顺铂的敏感性

目的：研究和探索hTERT、bcl-2、c-myc基因的反义核酸对K562细胞顺铂（cisplatin）敏感性影响,以期增强顺铂对白血病疗效。方法：采用MTT法检测3种反义核酸和顺铂对K562细胞抑制率。结果：顺铂20μmol/L对K562细胞抑制率为17.17%±1.36%,顺铂+hTERT反义序列对K562细胞抑制率为25.41%±1.77%,顺铂+bcl-2反义序列对K562细胞抑制率为26.18%±1.43%,顺铂+c-myc反义序列对K562细胞抑制率为28.29%±1.05%。结论：hTERT、bcl-2、c-myc基因的反义核酸能显著提高K562白血病细胞对顺铂的敏感性。     

siRNA干扰 BMI-1 基因对膀胱癌EJ细胞增殖的调控作用及其机制

目的: 对比观察膀胱癌EJ细胞及人膀胱移行上皮细胞中 BMI-1 基因及下游 p16^INK4a、p14^ARF 基因的mRNA及蛋白表达水平,探讨siRNA干扰 BMI-1 基因后对EJ细胞增殖的影响及其调控机制。方法: 细胞免疫荧光观察BMI-1、p16^INK4a和p14^ARF蛋白在EJ细胞中表达情况及定位。Real-time RT-PCR检测EJ细胞及膀胱正常移行上皮细胞中3种基因的表达水平,Western blotting检测蛋白水平。构建干扰 BMI-1 基因siRNA,通过脂质体转染导入EJ细胞中,设立空白对照和阴性干扰对照组,检测 BMI-1 及下游 p16、p14 基因表达水平及蛋白表达水平的变化;以CCK-8检测细胞生长观察siRNA干扰 BMI-1 表达对EJ细胞增殖的抑制作用;用流式细胞术分析细胞凋亡的改变。结果: BMI-1mRNA及蛋白水平在EJ细胞表达高于膀胱移行上皮细胞,而p16^INK4a和p14^ARFmRNA及蛋白在EJ细胞表达水平稍低于膀胱移行上皮细胞。siRNA干扰 BMI-1 后可以上调EJ细胞中其下游p16和p14 mRNA及蛋白水平,使EJ细胞增殖能力下降,细胞凋亡增多。结论: siRNA干扰 BMI-1 基因表达对EJ细胞的体外生长具有明显的抑制作用,其作用机制与上调其下游 p16^INK4a、p14^ARF 基因的表达有关。     

阻断PLCE基因对膀胱癌细胞侵袭能力的影响

目的构建PLCE基因的shRNA表达载体转染膀胱癌细胞T24株,观察其对T24细胞转移侵袭等恶性行为的影响。方法设计合成PLCE基因mRNA的寡核苷酸序列,插入绿色荧光蛋白质粒真核表达载体pGenesil中,构建重组载体pGenesil-PLCε。重组载体转染T24细胞后,RT-PCR和Western blot检测PLCE基因和蛋白表达;以侵袭小室、明胶酶谱分析及免疫组化检测细胞侵袭能力。结果成功构建了针对PLCE基因的shRNA表达载体。两个阳性重组质粒P1和P2转染膀胱癌细胞T24,P1和P2组目的基因/内参照吸光度比值较空载HK-A组明显降低(P<0.01);P1和P2组目的蛋白/内参照吸光度比值较空载HK-A组明显降低(P<0.01)。细胞侵袭实验中阳性质粒P1和P2转染组穿膜细胞数也明显低于空白对照组和阴性质粒HK-A转染组(P<0.01);转染P1、P2均使细胞分泌MMP-2、MMP-9明显低于空白对照和HK-A转染组(P<0.01)。结论阻断PLCE基因能有效抑制膀胱癌T24细胞系中PLCE基因和蛋白表达,并对T24细胞的侵袭转移能力具有一定的抑制作用。     

端粒酶逆转录酶和c-myc基因在子宫内膜样癌及子宫内膜增生中的表达

目的　探讨端粒酶逆转录酶 (hTERT)及c myc基因在子宫内膜增生及癌变过程中的作用、意义及二者相关性。方法　所用标本包括 14例子宫内膜单纯增生 ,8例复合增生 ,10例不典型增生 ,42例内膜样癌 ,用原位杂交法检测hTERT和c mycmRNA表达。结果　 (1)hTERT在子宫内膜单纯、复合、不典型增生病变和内膜样癌中阳性结果分别 2 / 14、4/ 8、8/ 10和 92 9% (3 9/ 42 ) ,前两组均为弱阳性表达 ,后两组多为中度和强阳性 ,统计分析表明不典型增生病变和内膜样癌中hTERT表达高于单纯和复合增生 (P <0 0 5)。c myc在子宫内膜单纯、复合、不典型增生病变和内膜样癌中阳性结果分别 3 / 14、1/ 8、5/ 10和 54 8% (2 3 / 42 ) ,后两组c myc阳性率显著高于前两组 (P <0 0 5) ;不典型增生病变的c myc阳性水平高于单纯及复合增生 (P <0 0 5)。(2 )hTERT阳性水平与内膜样癌分化相关(P <0 15) ;c myc阳性率随内膜样癌浸润深度增加而递增 (P <0 0 5)。 (3 )子宫内膜增生和内膜样癌各组中hTERT与c myc表达均不相关 (P >0 0 5)。结论　hTERT及c myc基因过表达与子宫内膜不典型增生及恶性转化相关 ,并与内膜样癌演进以及不良预后有关 ,但其两者表达之间无相关性