组织块法分离培养小鼠脾脏间充质干细胞

目的通过组织块培养法,建立一种高效可靠的小鼠脾脏间充质干细胞分离扩增策略。方法无菌条件下取小鼠脾脏组织充分碾碎,使用胶原酶消化获得的脾脏基质组织,将消化后的组织块种于培养瓶中,观察从组织块中迁移出的细胞形态,采用流式细胞术分析其表型,并将其做成骨和成脂肪诱导分化。结果消化后的脾脏组织块中迁移迁移出大量梭形纤维样细胞,流式细胞术检测结果表明,该种细胞高表达CD29、CD44、Sca-1和CD105,低表达CD11b、CD34、CD45和Ia。多向分化实验结果表明:小鼠脾脏基质组织中迁移出的细胞具有较好的成脂肪和成骨分化能力。结论组织块法可以分离培养出小鼠脾脏间充质干细胞,所获得的细胞纯度高,分化能力强,为开展相关研究提供了良好的细胞模型。     

人脂肪间充质干细胞的原代培养及体外成骨成脂诱导分化

目的: 建立体外分离培养获得人脂肪间充质干细胞（human adipose derived mesenchymal stem cells,hADSCs）的方法,并观察其形态、免疫表型、生物学特性。初步探讨其体外成骨过程中出现成脂现象的原因及机制。方法 ： 剖宫产手术获得腹部皮下脂肪,0.15%Ⅰ型胶原酶消化法获得人脂肪间充质干细胞并进行体外培养。行MTT细胞增殖实验绘制增殖曲线,使用流式细胞及细胞免疫荧光技术检测细胞表面抗原,行成骨成脂分化鉴定其分化潜能。通过RT PCR技术检测成骨成脂过程中过氧化物酶体增殖物激活受体γ 2（peroxisome proliferator activated receptorγ 2,PPARγ 2）和骨桥蛋白mRNA表达情况。结果 ： 通过分离培养,获得了大量旋涡状生长的人脂肪间充质干细胞。MTT法显示细胞增殖能力强。流式细胞鉴定结果显示,CD29、CD73、CD105、CD166高表达,CD31、CD34、CD45、HLA DR低表达。细胞免疫荧光结果与之相符。hADSCs在特定诱导条件下,具有成骨成脂分化潜能。在成骨分化过程中同时伴有成脂发生。RT PCR结果显示,与对照组相比,成脂诱导组PPARγ 2 mRNA有时间依赖性递增表达,差异具有统计学意义（P<0.01）。与对照组相比,成骨诱导组骨桥蛋白,PPARγ 2 mRNA均有时间依赖性递增表达,差异具有统计学意义（P<0.01）。结论： 建立了一种分离培养hADSCs简单可靠的方法。获得的细胞具有贴壁生长、增殖活性强、干细胞表型以及多向分化等特征。hADSCs体外成骨过程中,三酰甘油的形成对成骨具有一定的促进作用。     

小鼠脂肪源性干细胞的成骨分化研究

目的 体外分离培养和鉴定小鼠脂肪源性干细胞,向成骨方向分化,为后续的实验选取合适的种子细胞奠定基础.方法 从白色脂肪组织中分离培养脂肪源性干细胞,应用流式细胞仪分析其表面的标记.分别通过碱性磷酸酶、茜素红和油红-O染色方法染色方法鉴定向成骨和成脂方向分化.结果 脂肪源性干细胞高表达表面标记CD29、CD44,并且能够向成骨和成脂方向分化.结论 利用胶原酶消化法,在小鼠脂肪组织中成功分离、培养出脂肪源性干细胞,获得的细胞具有多向分化潜能,为后期组织工程技术修复骨组织,提供了坚实的实验基础.     

两种分离胎盘间充质干细胞方法的比较

目的：寻找从胎盘组织中分离培养间充质干细胞的最佳方法。方法：分别采用外植块贴壁法和酶消化法从胎盘组织中分离间充质干细胞,并对其形态、免疫表型、生长动力检测和多向分化能力进行检测。结果：流式细胞术和诱导分化实验表明酶液消化法分离得到的贴壁细胞表型符合间充质多能干细胞特征,且在合适诱导条件下能向造骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞分化,而外植块贴壁法获得的贴壁细胞弱表达CD29和CD105,仅能向脂肪细胞分化。结论：酶消化法可有效的从胎盘组织中分离间充质干细胞,增殖能力强,具备多向分化能力。     

人脐带华通氏胶间充质干细胞的分离、培养、鉴定及冻存、复苏

目的：探讨从人脐带华通氏胶（Wharton’s jelly,WJ）中分离、培养、鉴定间充质干细胞（mesenchymal stemcells,MSCs）及其冻存、复苏的方法。方法：采用植块法分离、培养间充质干细胞,流式细胞仪检测P3代细胞免疫表型,鉴定其向成骨、成脂方向诱导分化的能力;将P1细胞冻存6个月后复苏,鉴定复苏后细胞的特性。结果：植块法容易从人脐带华通氏胶中获得间充质干细胞;组织块贴壁后6 d可见组织块周围细胞爬出,原代培养14~18 d细胞融合70%~80%;P3代细胞强烈表达CD73、CD90、CD105,不表达CD14、CD34、CD45、CD79a和HLA-DR;成骨诱导分化后10 d,可见明显钙结节;成脂诱导14 d,有明显的脂滴出现,油红O染色阳性。冻存再复苏细胞活力达80%,细胞免疫表型及成骨、成脂诱导显示与冻存前细胞呈相同的特性。结论：组织块培养法可从人脐带华通氏胶中分离、培养出纯度较高间充质干细胞,冻存、复苏不改变其特性。     

小鼠脐带间充质干细胞的体外诱导分化

目的分离扩增小鼠脐带间充质干细胞（mouse umbilical cord mesenchymal stem cells,mUCMSCs）探讨其是否可诱导成软骨、脂肪和成骨细胞。方法 通过贴壁培养法将mUCMSCs体外分离、扩增、纯化,倒置显微镜下观察细胞的形态特征,运用流式细胞仪检测分析细胞的抗原标志表达进行鉴定。运用诱导培养液对分离的mUCMSCs分别定向诱导培养为软骨、脂肪和成骨细胞。结果 运用组织贴块培养法可从新鲜脐带中分离到贴壁生长的成纤维样细胞,这些细胞高表达CD29、CD90和CD105,低表达CD34。成软骨诱导后阿新兰染色呈蓝色;成脂诱导后油红O染色,出现红色脂滴;茜红素染色成骨诱导的mUCMSC,可见红色结节。结论 贴壁培养法分离培养所获得的mUCMSCs在体外可诱导分化为软骨、脂肪和成骨细胞。     

大鼠脂肪干细胞体外定向诱导分化为脂肪细胞和成骨细胞的研究

目的研究大鼠脂肪干细胞的基本生物学特性及其向脂肪细胞和成骨细胞诱导分化潜能。方法取6周龄SD大鼠腹股沟处脂肪组织,胶原酶消化法分离出脂肪干细胞,体外培养。取第3代细胞,免疫细胞化学测定其CD44、CD34抗原表达,分别用成脂和成骨诱导培养液诱导其向脂肪细胞及成骨细胞分化。油红染色、碱性磷酸酶染色和vonKossa染色鉴定其分化能力。结果大鼠脂肪干细胞生长能力旺盛,表达CD44,而不表达CD34;定向诱导后,油红染色、碱性磷酸酶染色和vonKossa染色阳性。结论大鼠脂肪组织可分离培养出脂肪干细胞,能向脂肪细胞和成骨细胞诱导分化,有可能成为组织工程理想的种子细胞来源之一。     

小鼠脂肪干细胞分离培养方法

目的：建立一种简单高效的小鼠脂肪干细胞分离培养方法,为小鼠模型中间充质干细胞研究提供充足的细胞来源。方法体外分离小鼠腹股沟皮下脂肪组织,应用0．1％胶原酶NB4消化,含10％ FBS的低糖DMEM培养基贴壁培养小鼠脂肪干细胞,并对其细胞形态、体外增殖能力、多向分化潜能及表面标记进行分析研究。结果体外分离培养的小鼠脂肪干细胞具有良好的细胞形态、极强的增殖能力,体外经三向诱导,具有成脂、骨及软骨分化潜能,表面标记CD34、CD105阳性,Sca-1高表达,不表达CD45及 SSEA-1。结论利用该实验方法,能培养出高纯度、具有良好干性及极强增殖能力的小鼠脂肪干细胞。     

人毛囊干细胞的分离培养鉴定与生物学特性的初步研究

目的 探讨人毛囊干细胞分离获取的方法 及其相关生物学特性,作为组织工程研究的种子细胞的可行性.方法 整形美容手术中废弃的人头皮组织,通过单细胞培养法和组织块培养法获得人毛囊干细胞,体外传代培养及生物学特性研究：细胞形态学观察,细胞生长曲线测定,免疫组化染色鉴定与流式细胞仪检测其细胞表型,将HFSCs进行成骨,成脂肪,成软骨多向分化诱导检测.结果 HFSCs生长旺盛,呈成纤维细胞样生长,多角形或梭形;免疫组化染色显示K19表达阳性,流式细胞仪检测显示：K15,K19,CD200和整合素β1为阳性,CD31,CD45,HLA-DR为阴性;成骨诱导von Kossa染色显示钙化基质沉积表达;成脂肪诱导油红-O染色阳性,胞浆内见脂滴形成;成软骨诱导细胞聚集成小团块,Alcian Blue染色显示硫酸蛋白聚糖表达阳性.结论 HFSCs体外生长能力旺盛,高表达干细胞相关抗原,具有向软骨,骨,脂肪多向分化潜能.     

人脐带间充质干细胞原代培养方法的改良

目的: 探讨体外组织块培养原代人脐带间充质干细胞(human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells,hUC-MSCs)的改良方法,并观察其形态,免疫表型,成脂成骨分化等生物学特性。方法: 从健康足月儿获得脐带,将血管剥离后,余下的结缔组织剪成小块,分别用传统植块法和改良植块法分离培养原代hUC MSCs。MTT法检测细胞增殖情况并绘制细胞生长曲线,流式细胞仪检测细胞免疫表型,成脂成骨诱导分化检测其分化潜能,化学染色鉴定诱导分化结果。结果： 改良植块法脐带组织贴壁培养3～4 d即可从组织块边缘长出长梭形成纤维样原代细胞,5～6 d后细胞可长满80%,比传统植块法原代细胞培养周期缩短了一半以上时间,细胞传代后流水状或漩涡状生长,MTT法显示细胞增殖能力强,流式细胞仪检测提示CD90, CD105,CD73,CD166,CD29,CD44均阳性表达,阳性率均在95%以上,CD45和HLA-DR均阴性表达,阳性率低于2%;诱导分化实验及化学染色结果证实, 该细胞具有成脂和成骨多向分化潜能。结论：应用与酶消化法相结合的改良植块法可以获得hUC-MSCs,比传统植块法缩短了原代培养周期,提高了细胞培养效率,所获得细胞贴壁生长,增殖能力强,表达间充质干细胞相关免疫表型,具有多向分化潜能,可在科研和临床应用中作为种子细胞来源。     

Biological characteristics of human adipose-derived stem cells and their response to periostin in vitro

Background Many studies on periostin have focused on its role in tumors and vascular reconstruction.However,the effect of periostin on stem cell function remains unclear.The aim of this study was to en...     

近交系五指山小型猪脂肪间充质干细胞分离培养及生物学特性

目的：建立近交系五指山小型猪(inbreed line miniature pig of Wuzhishan,ILMW)脂肪间充质干细胞(adipose-derived mesenchymal stem cells,ASCs)体外分离培养和鉴定方法。方法：选取6月龄健康ILMW 3头,从颈部皮下无菌获取脂肪组织约100 g,采用0.1% I型胶原酶消化组织,获得ILMW-ASCs,并进行体外培养和增殖;取第3,5,8,13代细胞进行如下实验：测量细胞大小,观察细胞形态,检测细胞表型、细胞周期、细胞凋亡,并进行细胞诱导分化和绘制细胞增殖曲线。结果：体外分离培养的ILMW-ASCs在体外贴壁,呈成纤维样或旋涡状生长;原代细胞培养 36 h出现贴壁,第5天进入对数增殖期,约7 d后80%的细胞汇合。 ILMW-ASCs细胞直径及体积分别为(17.00±0.54) μm和(2.58±0.24)×10–9 L。细胞表面抗原CD29,CD44和CD90呈高表达,不同代数之间的差异不明显(均P>0.05);CD45,CD8a和HLA-DR呈低表达,与第3代相比,随着代数的增加细胞表面抗原的阳性率逐渐增高(均P<0.05)。ILMW-ASCs成脂诱导结果为油红O染色呈阳性;ILMW-ASCs成骨诱导结果为茜素红染色呈阳性。ILMW-ASCs的第13代细胞出现凋亡和衰老,与较低培养代数相比细胞周期S期的比例下降(均P<0.05)。结论：ILMW-ASCs取材方便,贴壁时间早,细胞增殖活跃,传代周期短,传代后能保持稳定的生物学特性,是猪来源ASCs的最佳选择之一,可为大动物疾病模型和组织器官修复的细胞治疗提供候选干细胞来源。     

脂肪组织来源干细胞的细胞生物学研究

目的 探索从脂肪抽吸物中脂质部分分离、培养脂肪组织来源干细胞(ASCs)的方法,并通过其生长动力学、形态学、分化能力、细胞衰老和表面标记物轮廓5个方面的特征进行鉴定.方法 酶消化法处理脂类抽吸物,分离培养ASCs,观察细胞形态;MTT比色法测细胞活性并绘制细胞生长曲线,流式细胞仪测定细胞周期,丫啶橙染色检测细胞的衰老;流式细胞仪、免疫组织化学染色法鉴定其表面分子表达;成脂定向诱导分化后油红"O"染色定性.结果 原代培养的ASCs呈成纤维细胞样贴壁生长,具有很强的增殖能力;MTT比色法活性测定均证实ASCs具有很强的增殖活性,细胞周期研究发现ASCs具有干细胞的特性.丫啶橙染色3、4、6、8代无明显衰老.流式细胞仪检测显示干细胞标志的CD29、CD44、CD34的表达均成阳性;HLA-DR、CD133表达为阴性;免疫化学染色发现Ⅷ因子、CD31、CD34、CD105、SMA表达阳性;成脂诱导分化2周后,细胞内可见有大量脂滴,油红"0"染色可见胞浆内有大量红染颗粒.结论 自人体脂类抽吸物中通过酶消化法能分离和培养出具有干细胞特性的成纤维细胞样细胞群,该细胞具有很强的增殖活性且不易衰老,能稳定表达干细胞表面标志并能实现定向成脂分化.     

大鼠脂肪干细胞分离培养及细胞表型的研究

目的：分离、培养和冻存大鼠脂肪干细胞,并对其相关的细胞表型进行研究,为利用脂肪干细胞治疗梗阻性肾病肾纤维化等实验提供依据。方法取大鼠3只,经消毒麻醉,采集其腹股沟处脂肪组织分离培养其中的脂肪干细胞,用相差倒置显微镜观察细胞生长方式及形态变化。取第三代细胞用流式细胞仪作细胞免疫表型的鉴定。冻存复苏后再次检测干细胞生长情况及表型。结果大鼠脂肪组织中含有大量间充质干细胞,原代培养的ASCs呈小圆形或星形,经传代后的脂肪干细胞形态比较均一,呈长梭形,个别略呈多角形、漩涡样生长。其细胞表型为CD29、CD44高表达,CD73、CD105中等程度表达,CD34极低表达。脂肪干细胞经低温冻存3个月,复苏后,生长活力和存活率与冻存前未见明显区别,CD44和CD29检测与冻存前表达率也一致。结论建立了一种脂肪干细胞的有效分离、培养及保存方法,并对其表面标志物进行鉴定,为利用脂肪干细胞进行进一步的实验研究提供了依据。     

胎鼠皮肤间充质干细胞的体外培养及成骨分化研究

目的：分离、纯化胎鼠皮肤间充质干细胞(MSCs)，在体外培养、扩增并促其成骨分化，为骨组织工程学研究与骨质疏松症的细胞学治疗提供一种可能。方法：体外培养胎鼠皮肤MSCs，并在培养液中加入成骨诱导剂诱导培养，观察其成骨分化潜能。 结果：胎鼠皮肤MSCs传代培养第15代仍具有增殖能力,说明该细胞为干细胞源性;贴壁细胞在成骨诱导剂作用下,碱性磷酸酶(ALP)水平升高，ALP钙钴染色呈阳性反应，钙结节茜素红染色反应阳性。 结论：胎鼠皮肤MSCs具有很强的自我增殖能力，成骨诱导剂可促其向成骨分化。     

新生小鼠颅盖骨间充质干细胞原代培养模型的建立

目的:探索新生小鼠颅盖骨间充质干细胞原代培养的方法?方法:取新生小鼠颅盖骨,采用胶原酶消化获得间充质干细胞,观察细胞的形态及增殖情况,通过细胞周期分析细胞增殖能力,通过流式测定细胞表面标志来分析细胞纯度,对细胞进行成骨成脂诱导分化,并分别予茜素红及油红O染色定性,荧光定量PCR检测成骨标志基因Osteocalcin及成脂标志基因PPARγ?Fabp4表达情况?结果:培养出的纺锤形细胞均一性好?增殖能力强?流式测定细胞表面标志显示细胞纯度好,高表达CD29?CD44,几乎不表达CD34?CD45?诱导分化后分化率高,茜素红染色及油红O染色分别可见较多矿化结节及脂滴,荧光定量PCR显示随分化相关标志基因均明显增高?结论:本研究成功建立了新生小鼠颅盖骨间充质干细胞原代培养模型,为进一步研究间充质干细胞奠定基础?     

内皮祖细胞条件培养基对间充质干细胞增殖和成骨分化的影响及其机制

目的:探讨小鼠骨髓来源的内皮祖细胞(EPCs)条件培养基(CM) 对同源间充质干细胞(MSCs)增殖和成骨分化功能的影响,并阐明其作用机制。方法:小鼠骨髓细胞经差速贴壁法结合专用培养基分别培养扩增MSCs和EPCs,采用流式细胞术(FCM)检测MSCs和EPCs表面标记物,以成骨、成脂和成软骨诱导分化对MSCs进行功能鉴定,以成血管对EPCs进行功能鉴定。将MSCs分为0% EPCs-CM组(对照组,采用LG-DMEM培养)、50% EPCs-CM组(采用50% EPCs-CM+50% LG-DMEM培养)和100% EPCs-CM 组(采用100% EPCs-CM培养)。采用MTT比色法检测各组MSCs的增殖活性;采用茜素红染色检测各组MSCs的成骨分化能力。结果:FCM法检测,第3代MSCs高表达Sca-1、CD29, 低表达CD45、CD11b;经诱导可向成骨、成软骨和成脂方向分化。第3代EPCs 高表达CD34、CD133和VEGFR2;在铺有基质胶的96孔培养板中可形成血管样结构。与对照组比较,50% EPCs-CM组和100% EPCs-CM组MSCs增殖活性明显增加,且呈浓度依赖性(P<0.05)。茜草色素红染色法检测,培养21 d后50%和100% EPCs-CM组MSCs的钙结节数量和钙盐沉积均高于对照组(P<0.05)。结论:利用差速贴壁法可同时分离MSCs和EPCs,EPCs-CM能促进MSCs 的增殖和成骨分化。     

新生大鼠视网膜干细胞分离培养及其生物学特性

目的：探讨新生大鼠视网膜干细胞的分离培养及其生物学特性。方法：采用机械酶-分离法体外扩增培养SD大鼠视网膜干细胞,观测细胞增殖能力,绘制CCK-8检测生长曲线;诱导细胞分化,免疫组织化学检测细胞巢蛋白、溴脱氧尿核苷、微管缔合蛋白-2、神经胶质原纤维酸性蛋白、胸腺糖蛋白1．1的表达。结果：原代视网膜干细胞形成大量的细胞球悬浮生长,传代后的细胞也可以形成细胞球,呈线性生长,巢蛋白和溴脱氧尿核苷表达阳性;诱导分化后的细胞部分原纤维酸性蛋白、微管缔合蛋白-2、胸腺糖蛋白1．1表达阳性。结论：新生SD大鼠视网膜干细胞可在体外分离培养和扩增,表达干细胞特性,并可向视网膜节细胞分化。     

人骨髓间充质干细胞体外增殖及成骨分化的增龄变化

目的观测年龄对人骨髓间充质干细胞(human mesenchymal stem cells,hMSCs)体外增殖、成骨分化的影响.方法使用密度梯度离心法分离不同年龄人骨髓MSCs进行培养,保留贴壁细胞传代,观察细胞生长情况,检测其增殖活性、细胞周期、碱性磷酸酶活性.结果低龄hMSCs较高龄hMSCs体外生长快、增殖期比例大、MTT及碱性磷酸酶活性高.结论hMSCs的增殖和成骨分化的能力和活性随着年龄的增加而降低,建立其参数可满足组织工程种子细胞在临床应用中不同患者的要求.     

人胎盘来源间充质干细胞和大鼠骨髓间充质干细胞的生物学特征比较

目的:从人足月的胎盘羊膜中和Wistar 大鼠股骨及胫骨骨髓中分离、培养间充质干细胞（MSCs）,研究人胎盘来源MSCs（HPMSCs）和大鼠骨髓来源MSCs（BMSCs）的分离培养方法和生物学特征、表面标志及其多分化潜能。方法:将人足月胎盘组织通过胶原酶Ⅱ消化培养获取HPMSCs,采用全骨髓贴壁法从4周龄Wistar大鼠双侧股骨及胫骨中分离、纯化大鼠BMSCs,运用活细胞计数法检测其增殖能力,采用流式细胞术检测2种细胞表面标志物的表阳性率;
用地塞米松、维生素C和β磷酸甘油诱导其向成骨细胞分化,用茜素红染色鉴定;用胰岛素、地塞米松、IBMX和吲哚美辛诱导其向脂肪细胞分化,以油红O染色鉴定。结果:HPMSCs为梭形贴壁细胞,增殖能力较强,CD44和CD34表达阳性率分别为94.45%和1.67%;BMSCs为圆形、梭形和多角形,增殖能力强,CD44和CD34表达阳性率分别为93.11%和2.68%。2种细胞经过成脂诱导液和成骨诱导液诱导后,茜素红和油红O染色结果均为阳性,表明2种细胞均可向脂肪细胞和成骨细胞分化。结论:HPMSCs与大鼠BMSCs的生物学特征相似,同样具有多分化潜能,HPMSCs具有更强的增殖能力。