不同心血管风险的临床药物对hERG钾通道的作用研究

摘要：目的在GLP实验室评估膜片钳检测临床用药物对hERG钾通道作用的差异性和重复性,研究9种致尖端扭转性室速（TdP）风险的临床用药物（高风险临床用药物：苄普地尔、奎尼丁、索他洛尔;中风险临床用药物：昂丹司琼、西沙比利、特非那定;低风险临床用药物：雷诺嗪、维拉帕米和美西律）对hERG钾通道的阻断作用。方法采用全细胞膜片钳技术记录不同浓度的苄普地尔、奎尼丁、索他洛尔、昂丹司琼、西沙比利、特非那定、雷诺嗪、维拉帕米和美西律作用于外源稳定转染表达hERG钾通道的HEK293细胞（hERG-HEK293稳态细胞）后hERG电流（IKr）的变化,研究上述临床用药物对IKr作用的浓度依赖性及半数抑制浓度（IC50）。结果9种临床用药物对hERG-HEK293细胞上IKr作用具有浓度依赖性,且高风险临床用药物苄普地尔和奎尼丁的IC50值分别约为98.32 nmol?L-1和1.95 μmol?L-1,索他洛尔的IC50值大于300 μmol?L-1;中风险临床用药物昂丹司琼、西沙比利和特非那定的IC50值分别约为0.94 μmol?L-1、39.10 nmol?L-1和128.58 nmol?L-1;低风险临床用药物雷诺嗪、维拉帕米和美西律的IC50值分别约为9.94 μmol?L-1、235.49 nmol?L-1和65.56 μmol?L-1。本实验所得临床用药物IC50值基本与文献基本相符。结论临床用药物致TdP风险与hERG通道的阻滞作用密切相关,但hERG通道阻断不等同于TdP风险,还与心脏上表达的多种离子通道有关,某些临床用药物可以通过阻断钠通道和钙通道而降低风险。本研究结果提示本方法所得数据可靠,为国内GLP实验室进行hERG钾通道评价研究提供了参考依据,可用于药物心脏毒性评价。     

胃肠动力药西沙比利对表达于 HEK293细胞的人 ether-a-go-go相关基因2通道的影响

目的：研究胃肠动力药西沙比利对于在 HEK293细胞异源性表达的人 ether-a-go-go 相关基因2（human ether-a-go-go related gene 2,hERG2）通道性质的影响。方法用 Lipofectamine 2000将 hERG2（AF311913）瞬时转染至 HEK293细胞,使其表达hERG2通道,利用全细胞膜片钳技术记录 hERG2电流。加入西沙比利（终浓度分别为0.001,0.01,0.1,1.0,10.0μmol/ L）,分别记录加药前和加药后2~8 min 的 hERG2电流,分析西沙比利浓度和作用时间对此通道电流的影响。结果西沙比利各浓度实验组中,hERG2时间依赖性电流和尾电流幅度均下降。在去极化电压为＋20 mV 时,随西沙比利浓度升高,电流抑制率逐渐增加。西沙比利的抑制作用随时间延长逐渐增强,西沙比利浓度为1μmol/ L 时,电流在8 min 内完全消失。结论西沙比利对HEK293细胞表达的 hERG2通道的时间依赖性电流和尾电流均有抑制作用,该抑制作用具有浓度依赖性和时间依赖性,即浓度越高,时间越长,抑制效果越明显,直至电流降低至稳态或消失。     

复极时程和跨室壁复极离散在尖端扭转型室性心动过速中的作用

目的:探讨复极时程和跨室壁复极离散(TDR)在尖端扭转型室性心动过速(TdP)发生的作用. 方法:32只兔随机等分为4组,低浓度索他洛尔组(10 μmol/L),高浓度索他洛尔组(100 μmol/L),低浓度奎尼丁组(1 μmol/L),高浓度奎尼丁组(10 μmol/L). 采用Langendorff技术离体兔心脏灌流,同步记录用药后三层心肌的单相动作电位(MAP)和TDR,观察早期后除极(EAD)、TdP的发生情况. 结果:索他洛尔浓度依赖性地延长三层心肌MAP时程(MAPD)和TDR,高浓度索他洛尔组诱发EAD,TdP分别为8只和6只,而低浓度组诱发EAD,TdP分别为4只和0只. 奎尼丁浓度依赖性地延长三层心肌MAPD,但逆浓度依赖性地延长TDR,高浓度奎尼丁组诱发EAD,TdP分别为7只和1只,而低浓度组诱发EAD,TdP分别为6只和4只. 结论:与TdP的发生密切相关的主要是TDR,而不是复极时程.     

多非利特与维拉帕米联合应用对豚鼠乳头肌动作电位的影响

目的 研究钾通道拮抗剂多非利特与钙通道拮抗剂维拉帕米联合应用对豚鼠乳头肌动作电位各参数的影响.方法 应用标准微电极技术记录离体豚鼠乳头肌动作电位,观察在不同刺激频率下(0.2,0.5 ,1.0,1 25,2.0 Hz),不同浓度的胺碘酮(1,5,10 μmol/L)、多非利特(10,50,100 nmol/L)或100 nmol/L多非利特与1 μmol/L 维拉帕米联合应用对乳头肌动作电位的影响.结果 胺碘酮浓度依赖性的延长动作电位复极50%(APD50)和90%(APD90)的时程,其作用不表现为频率依赖性;多非利特延长APD具有明显的浓度依赖性,刺激频率增加时,延长APD的作用明显减弱,表现为明显的负性频率依赖性;100 nmol/L多非利特与1 μmol/L维拉帕米联用后,上述频率依赖性得到改善.结论 胺碘酮和多非利特均能浓度依赖性地显著延长动作电位时程,但复合性Ⅲ类抗心律失常药物胺碘酮对频率的依赖性明显低于纯Ⅲ类抗心律失常药物多非利特,而多非利特与维拉帕米联合应用达到一定的平衡状态时可以减少这种负性频率依赖性作用.     

藤黄酸对 K562 细胞 hERG 钾通道蛋白的调控作用

目的 探讨藤黄酸对白血病细胞系 K562 增殖、凋亡、细胞周期的影响,并观察藤黄酸对 hERG 钾通道蛋白的调控作用。方法 K562 细胞以不同浓度藤黄酸 (0.125～8.0 μmol/L) 处理 0～72 h 后,MTT 法观察藤黄酸对 K562 细胞生长抑制的情况,Annexin-V/PI 双标法及透射电镜检测细胞凋亡,PI 单染法检测细胞周期分布,Western blotting、RT-PCR 法分别检测藤黄酸对 K562 细胞内 hERG 通道的调控作用。结果 藤黄酸能明显抑制 K562 细胞增殖,具有时间-剂量依赖性,其 24 h 的 IC₅₀ 为 (2.637±0.208) μmol/L。此外,藤黄酸以浓度依赖性方式诱导 K562 细胞凋亡,并伴随明显的凋亡细胞形态学改变,而藤黄酸的凋亡诱导效应可能与其诱导 K562 细胞周期阻滞于 G₀/G₁ 期有关。hERG 钾通道蛋白在人白血病 K562 细胞中表达量较高,藤黄酸对 hERG 钾通道蛋白及其表达水平均有不同程度的抑制作用,该抑制作用呈明显的量效关系 (P＜0.01)。结论 藤黄酸可通过下调 hERG 钾通道蛋白的表达发挥较强的抗白血病效应,hERG 钾通道有望成为白血病诊治的新靶标。     

伏立康唑对HEK-293细胞中快速延迟整流钾通道及电压门控钠通道表达和功能的影响

目的 观察伏立康唑对快速延迟整流钾通道(hERG)及电压门控钠通道(Nav1.5)表达和功能的影响.方法 分别用浓度为0,2.5,5,10,50μmol/L伏立康唑干预稳定表达hERG通道蛋白及Nav1.5通道蛋白的HEK-293细胞24 h,Western blot检测hERG及Nav1.5的表达水平.用5μmol/...     

基于实时细胞分析技术检测前列腺癌细胞药物敏感性

目的基于实时细胞分析技术发展,以更加简便稳定的方法进行药物敏感性评估,为前列腺癌临床治疗提供参考。方法选取VCa P、DU145、PC-3、PC-3M-2B4和PC-3M-IE8五株人前列腺癌细胞,选用多西他赛、卡巴他赛和醋酸阿比特龙三种前列腺癌治疗药物,分别梯度浓度给药,利用RTCA检测给药前后的细胞生长情况,确定药物对前列腺癌细胞的半抑制浓度(IC50)。结果多西他赛对VCa P、DU145、PC-3、PC-3M-2B4、PC-3M-IE8五种细胞系24 h的IC50分别为8.81 nmol/L、11.61 nmol/L、1.78 nmol/L、1.44 nmol/L、8.69 nmol/L。卡巴他赛24 h的IC50依次为3.73 nmol/L、3.96 nmol/L、10.41 nmol/L、5.43 nmol/L、7.37 nmol/L。醋酸阿比特龙24 h的IC50依次为8.34μmol/L、8.60μmol/L、24.20μmol/L、8.59μmol/L、13.21μmol/L。结论 PC-3M-2B4及DU145、VCa P及PC-3可作为多西他赛、卡巴他赛及醋酸阿比特龙的对照,建立体外筛选药物的细胞模型,为临床推广提供参考。     

奎纳克林对人肾癌细胞系786-0的抑制作用研究

目的：研究奎纳克林（quanacrine,OC）对786-0细胞的抑制作用,为临床应用奎纳克林治疗肾癌提供理论依据。方法：采用细胞培养、光学显微镜及MTT法研究奎纳克林对786-0细胞的抑制作用。结果：MTT实验显示QC处理24h胚肾细胞HEK293IC50为24.836μmol/L,肾癌细胞系786-0IC50为10.421μmol/L;QC处理48h胚肾细胞HEK293IC50为21.044μmol/L,肾癌细胞系786-0IC50为6.822μmol/L;QC处理72h胚肾细胞HEK293IC50为15.643μmol/L,肾癌细胞系786-0IC50为3.859μmol/L。结论：QC对肾癌细胞系786-0有明显的增殖抑制作用,作用随时间延长和浓度提高而增强,且其抑制作用具有选择性。     

钾通道与肺动脉平滑肌细胞增殖和凋亡关系中钙通道所起作用的研究

目的:观察钾通道与肺动脉平滑肌细胞(PASMC)增殖和凋亡关系中钙通道所起的作用.方法:将PASMC分为对照、钾通道阻断剂四乙胺TEA (开放剂比那地尔Pin)、钾通道阻断剂(开放剂) 钙通道阻断剂硝苯地平Nif(开放剂Bay K8644)组,采用非核素增殖试剂盒、3H-TdR掺入测定细胞增殖.将PASMC分为对照、钾通道开放剂、钾通道开放剂 钙通道开放剂组,采用细胞凋亡检测试剂盒测定细胞凋亡.结果:与对照组相比,10～20 mmol/L的钾通道阻断剂TEA显著增加PASMC细胞数(P<0.01),15～30 mmol/L TEA显著增加DNA合成(P<0.05, P<0.01).TEA 5 μmol/L Nif组中只有20 mmol/L TEA使DNA合成增加(P<0.05),其余浓度组与对照组均无统计学差异.TEA Nif组与TEA组相比,TEA浓度在10～25 mmol/L时2组细胞数相差显著(P<0.01),15～30 mmol/L TEA时2组DNA合成相差显著(P<0.05,P<0.01).与对照组相比,25～500 μmol/L Pin显著减少PASMC细胞数和DNA合成(P<0.01).Pin 1 μmol/L Bay组与Pin组相比,当Pin浓度为25～500 μmol/L时2组PASMC细胞数相差显著(P<0.01),当Pin浓度在50～500 μmol/L时DNA合成相差显著(P<0.01).Pin Bay组与对照组相比,50～500 μmol/L的Pin仍能显著减少PASMC细胞数(P<0.01), 25～500 μmol/L的Pin显著减少DNA合成(P<0.01).与对照组相比,50～500 μmol/L的Pin显著增加PASMC凋亡率(P<0.05,P<0.01).Pin 1 μmol/L Bay组与Pin组相比,细胞凋亡率无显著差异.结论:钙通道在钾通道与PASMC增殖关系中起重要作用,但在钾通道与PASMC凋亡关系中无明显作用.     

比那地尔与肺动脉平滑肌细胞的增殖和凋亡

目的:研究钾通道开放剂比那地尔(Pin)对大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMC)增殖和凋亡的作用.方法:通过非核素标记细胞增殖检测、3H-TdR掺入、形态学、流式细胞术等方法研究Pin对大鼠PASMC增殖和凋亡的作用.结果:25～500 μmol/L的Pin呈剂量依赖性地减少大鼠PASMC的细胞数和DNA合成,500 μmol/L的Pin显著减少S期和G2/M期的细胞比例,增加G0/G1期细胞的比例.50～500 μmol/L的Pin呈剂量依赖性地增加大鼠PASMC的凋亡率.结论:钾通道开放剂抑制大鼠PASMC增殖并促进其凋亡.钾通道开放剂可能成为今后预防和控制低氧性肺动脉高压血管重建的有效药物.