高渗盐液对豚鼠离体耳蜗外毛细胞内游离Ca2+浓度的影响

细胞内游离钙浓度的改变是细胞生理功能的重要物质基础 ,也是多种受体被激活后信息传递过程的中心环节[1 ] 。高渗盐液对离体外毛细胞 (ＯＨＣ)的影响研究较多 ,但尚无定论。本文采用粘附式的细胞仪 (ＡＣＡＳ 5 70 ,美国Ｍｅｒｉｄｉａｎ公司生产 )对 1 8%ＮａＣｌ引起的豚鼠离体耳蜗外毛细胞内游离Ｃａ2 浓度的变化进行定量分析 ,报告如下 :1　材料和方法1 1　药物试剂与仪器　用去离子水配制 1 8%ＮａＣｌ;胶原酶Ⅳ型 (Ｓｉｇｍａ公司生产 ,浓度为 0 5ｇ Ｌ ,Ｄ -Ｈａｎｋ’ｓ溶液配制 ) ;伴刀豆球蛋白 (ＣｏｎＡ) (浓度为 0 1ｍｇ ｍ…     

Ca2+在内耳疾病的变化及钙拮抗剂的作用

近年来的研究表明钙超载与内耳的病理过程紧密联系 ,钙拮抗剂的应用也越来越广泛 ,特作如下综述。1　细胞水平的Ｃａ2 病理作用生理状况下胞质内处于低Ｃａ2 水平 ,与胞外及胞内某些细胞器之间有 10 0 0倍的浓度梯度 ,维持低Ｃａ2 是一个耗能过程 ,对细胞的生理活动是必需的。在病理状态下 ,如缺氧、耳毒性药物损伤时 ,钙平衡失调 ,Ｃａ2 内流的增加、细胞胞浆内钙离子浓度 [Ｃａ2 ]ｉ释放增多及Ｃａ2 外流的抑制导致[Ｃａ2 ]ｉ持续地增加。 [Ｃａ2 ]ｉ增高将在以下方面对细胞产生损伤 :(1)推动氧化应激过程 ,导致能量贮存的耗竭 ,…     

豚鼠耳蜗Ca2+-ATP酶活性的超微细胞化学定位

目的为观察耳蜗Ca^2 -ATP酶的定位，建立一种检测内淋巴积水的超微细胞化学手段，进一步探讨CCa^2 -ATP酶在调节耳蜗钙浓度方面的作用。方法采用柠檬酸铅超微细胞化学染色方法观察12只豚鼠耳蜗内Ca^2 -ATP酶活性。结果Ca^2 -ATP酶活性反应产物是柠檬酸铅颗粒，主要表达在前庭膜内淋巴侧的细胞膜表面和微绒毛上，内、外毛细胞的静纤毛和皮板上，外毛细胞的基底侧细胞膜和血管纹基底细胞的内皱折膜上也可观察到Ca^2 -ATP酶反应产物。结论柠檬酸铅组织化学一步法能系统测定Ca^2 -ATP酶在耳蜗的定位，为探索此酶在耳蜗的作用建立了一种观察手段。本文结果提示Ca^2 -ATP酶在调节内耳钙浓度方面起着重要的作用。     

CICR在哺乳动物耳蜗神经突触传递中的作用

Ca2 作为细胞内的第二信使,几乎参与细胞所有的生理活动,在耳蜗毛细胞的换能、调谐、神经递质释放及基底膜的非线性响应等方面起重要作用.Ca2 在细胞内的浓度受到精细的调控,其中一个重要的调节机制就是Ca2 介导的Ca2 释放(Ca2 -induced Ca2 release,CICR),即细胞外的Ca2 进入胞内,然后诱发了细胞内的钙库释放.     

新生大鼠耳蜗K(o)lliker器支持细胞ATP释放的机制

目的 观察体外培养的新生大鼠耳蜗K(o)lliker器支持细胞是否存在并释放ATP,初步探讨其释放机制.方法 选取出生后ld的Sprague-Dawley大鼠,分离耳蜗膜迷路,采用机械分离与酶消化相结合的方法获得单离的K(o)lliker器支持细胞.观察膜迷路和K(o)lliker器支持细胞的喹丫因染色情况.采用生物发光法,通过影响K(o)lliker器支持细胞ATP代谢、改变细胞内外Ca2浓度、抑制细胞内磷脂酶信号通路及添加缝隙连接半通道阻断剂,观察K(o)lliker器支持细胞释放ATP浓度的变化.结果 用喹丫因染色体外培养的K(o)lliker器支持细胞,发现胞质中存在大量绿色星点状染色.采用生物发光法检测的ATP标准曲线呈明显的对数线性关系.随着巴佛洛霉素A1浓度增加,K(o)lliker 器支持细胞培养液中ATP浓度逐渐降低,而随着己二酸二癸酯浓度的增加,培养液中ATP浓度逐渐升高;在一定浓度范围内,随着细胞外Ca2浓度增加,K(o)lliker器支持细胞ATP的释放减少,而随着细胞内游离Ca2浓度增加,K(o)lliker器支持细胞释放ATP量增加;培养液中加入甘珀酸钠或乌热酸抑制半通道后可以显著的降低ATP释放.此外,抑制细胞内磷脂酶信号通路也可以减少ATP的释放.结论 体外培养的新生大鼠耳蜗K(o)lliker器支持细胞存在并释放ATP,细胞内、外液中Ca2+浓度的变化可能通过调节半通道的开放而影响其ATP的释放.     

钙离子载体A23187对喉癌细胞株胞内游离钙浓度及凋亡的影响

目的:观察钙离子载体A23187对喉癌细胞株(Hep2)胞内游离钙[Ca2 ]i浓度及凋亡的影响。方法:将Hep2随机分成3个A23187处理组及对照组;以Fura2/AM为荧光指示剂,RF5301PC荧光光度计测定处理后5、24、48h后Hep2[Ca2 ]i浓度的变化;用FACS420型流式细胞仪测定细胞凋亡率;DNA琼脂糖凝胶电泳分析不同时间A23187处理Hep2后特征性降解。结果:A23187处理组5、24、48hHep2[Ca2 ]i的浓度分别为(123.48±21.54)nmol/L、(110.54±11.32)nmol/L、(88.63±9.95)nmol/L均高于对照组(54.23±8.73)nmol/L,差异有统计学意义(P<0.01)。48h组指标值较5h组明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。A23187处理5、24、48h细胞凋亡率分别为(3.84±1.12)、(7.65±1.35)、(9.49±1.31),均高于对照组(2.63±0.75),差异有统计学意义(P<0.01),且有时间反应关系(r=0.923、0.748)。DNA电泳呈典型的“梯状”条带。结论:A23187可影响Hep2[Ca2 ]i浓度,Hep2[Ca2 ]i与其凋亡率密切相关。     

声音在耳内的信号转导及其分子生物学机制(5)

近年来对豚鼠的实验研究发现，与外淋巴接触的毛细胞的基底膜上存在两种可被Ca^2＋激活的钾通道，两者的开放均依赖于细胞内Ca^2＋浓度的升高。纤毛的弯曲使毛细胞顶部的机械门控离子通道开放，导致内淋巴中高浓度的K^＋流向细胞内，使毛细胞发生去极化反应。     

细胞内钙离子释放在嗅觉信号转导机制中的作用

目的:建立组织块法体外培养嗅觉受体神经元(ORNs)细胞内游离钙离子浓度([Ca2+]i)的实时观察系统,分析嗅觉信号转导体系中几个关键环节的作用.方法:以双激发波长钙离子荧光探针Fura-2 AM孵育培养的ORNs,通过双波长比率法,实时定量观察ORNs的[Ca2+]i.分别以Forskolin和IBMX刺激ORNs,观察[Ca2+]i的改变.分别耗竭细胞内钙库和使用不含钙离子的细胞外液,判断细胞内[Ca2+]i的来源.结果:静息ORNs的[Ca2+]i为(58.5±12.8) nmol/L.Forskolin和IBMX刺激可使ORNs的[Ca2+]i快速升高,且作用可逆.二者所引发的钙信号来自于细胞外钙内流,而非细胞内钙库的释放.结论:本研究成功建立了实时定量观察ORNs细胞内[Ca2+]i的系统,ORNs的[Ca2+]i受第二信使门控钙离子通道的调节.     

新生大鼠耳蜗血管纹缘细胞释放ATP的机制

目的 证实体外培养的新生大鼠耳蜗血管纹缘细胞能够释放ATP,并进一步探讨缘细胞释放ATP的机制.方法 分离、培养新生大鼠耳蜗血管纹缘细胞,采用生物发光法分别检测巴佛洛霉素A1、己二酸二癸酯( didecyl adipate,DDA)、细胞外K+、毒胡萝卜素、细胞外Ca2、U73122及马兜铃酸钠对细胞外液中缘细胞ATP释放的影响.结果 随着巴佛洛霉素A1浓度的增加,细胞外液中ATP的浓度明显下降;当DDA浓度增加时,细胞外液中ATP的浓度几乎呈线性增加.随着细胞外液中的K+浓度的增高,缘细胞释放的ATP浓度呈现上升趋势,当细胞外液中的K+浓度为9.15 mmol/L时,ATP的释放量达到峰值,之后随着K+浓度的继续升高ATP的释放量呈下降趋势.随着毒胡萝卜素浓度的增加,缘细胞释放的ATP浓度呈现明显下降的趋势.当细胞外Ca2+浓度为0 mmol/L时,缘细胞仍然释放ATP;Ca2+浓度增加与ATP的释放呈负相关,但当细胞外的Ca2+浓度达到1.25 mmol/L以上时,ATP的释放量维持在一个较稳定的水平.U73122的浓度在0.25～1.25 μmol/L时,其与缘细胞释放的ATP浓度呈负相关.当马兜铃酸钠的浓度为12.5 ～ 100.0 μmol/L,缘细胞ATP释放呈明显下降的趋势;当其浓度＞100.0 μmol/L时,ATP释放浓度趋于平稳.结论 体外培养的新生大鼠耳蜗血管纹缘细胞能够释放ATP,其释放量与钙泵、K+通道状态以及细胞内信号传导通路相关酶的活性有关.     

水杨酸钠对豚鼠耳蜗单离外毛细胞游离钙浓度影响及其调控机制研究

目的　观察水杨酸钠对豚鼠耳蜗外毛细胞 (outerhaircells,OHC)内游离钙浓度 [Ca2 ]i的影响 ,并对钙通道调控药物的拮抗作用进行观察 ,以深入探讨水杨酸钠耳毒性的分子生物学机制。方法　豚鼠全身麻醉后断头活杀 ,酶 机械法分离获得耳蜗单离OHC。 10 μmol/L的Fluo 3/AM负载30min后用ACASUltima型激光扫描共聚焦显微镜观察不同药物灌流下OHC[Ca2 ]i的变化。结果　OHC在标准细胞外液灌流过程中 [Ca2 ]i保持稳定。 1mmol/L水杨酸钠灌流致 8/ 10个细胞的 [Ca2 ]i明显升高。无钙细胞外液中灌流亦有 10 / 10个细胞 [Ca2 ]i明显的升高。经 3mmol/L利多卡因作用1h后 ,水杨酸钠灌流不能使细胞 [Ca2 ]i升高 (n =10 )。盐酸氟桂嗪可以明显阻断水杨酸钠导致的OHC[Ca2 ]i升高效应 (3/ 12细胞的 [Ca2 ]i升高 ) ,而尼莫地平无此效应 (7/ 7细胞的 [Ca2 ]i升高 )。结论　水杨酸钠可以导致OHC[Ca2 ]i明显增加 ,OHC[Ca2 ]i升高来源于细胞内钙库的动员和释放。使细胞内 [Ca2 ]i升高可能是水杨酸钠的耳毒性机制之一。     

氨基糖甙类抗生素和爆震对前庭器暗细胞和壁细胞的作用

健康豚鼠34只分爆震1组、2组，链霉索组．庆大霉素组，多粘菌素B组和爆震对照1组、2组，链霉素和庆大霉素对照组及多粘菌素B对照组．应用扫描和透射电镜进行观察。发现氨基糖甙类抗生素和爆震主要引起暗细胞内小泡、大泡、线粒体和细胞内小体增多，在细胞表面附有许多脱落的耳石。各实验组在实验后期暗细胞和壁细胞表面的耳石较实验早期明显减少。氨基糖甙类抗生素对暗细胞的影响较爆震明显。壁细胞也有类似改变．但程度较轻。结果提示氨基糖甙类抗生素和爆震对豚鼠暗细胞和壁细胞组织结构无明显损伤，可使它们的代谢和功能增强。从而表示暗细胞和壁细胞是前庭器中不易受损的细胞。     

钙离子在嗅觉信号转导和适应中的作用

在嗅觉受体神经元将气味的化学信号转换为嗅觉电信号,嗅觉产生适应的过程中,Ca2+发挥着重要作用.气味分子与嗅觉受体神经元纤毛上的特异性受体结合后,经过一系列级联反应,细胞外的Ca2+进入细胞内.细胞内的Ca2+一方面是使受体电流放大并最终达到动作电位的第二信使,另一方面,细胞内Ca2+通过一系列反馈抑制机制,使嗅觉受体神经元对气味信号的刺激不再敏感,即产生了嗅觉适应.本文针对Ca2+在嗅觉信号的产生和适应中的机制进行综述.     

豚鼠耳蜗单离外毛细胞游离钙的胆碱能调控

目的　观察胆碱能兴奋剂和拮抗剂对豚鼠耳蜗单离外毛细胞 (OHC)内游离钙浓度 ([Ca2 + ]i)的影响 ,探讨OHC内 [Ca2 + ]i的胆碱能调控机制。方法　健康豚鼠 15只处死 ,Hanks液中分离活性单离OHC ,Fluo - 3/AM负载 30min。分 7组进行不同干预 ,包括乙酰胆碱 (ACH ,胆碱能M和N受体兴奋剂 )、毒蕈碱 (M受体兴奋剂 )、阿托品 (M受体拮抗剂 )、庆大霉素 (N受体拮抗剂 )、加Hanks液对照组和不加干预对照组 ;另 1组为dHanks液中加ACh。用激光扫描共聚焦显微镜 (Bio-Rad ,英国 )观察OHC内 [Ca2 + ]i的变化。结果　Hanks液中不加干预试剂、加毒蕈碱、加Hanks液对照和无钙dHanks液中加ACh等 4组 ,[Ca2 + ]i在 2 5～ 30min内升幅 <1.10倍。Hanks液中加ACh组 [Ca2 + ]i最高升幅平均为 3.0 9倍 ;阿托品 +ACh组 [Ca2 + ]i为 2 .92倍 ;庆大霉素 +ACh组[Ca2 + ]i为 1.81倍。结论　豚鼠耳蜗传出神经递质ACh通过兴奋N受体 ,开放OHC的细胞膜钙离子通道 ,使细胞外Ca2 + 内流外毛细胞内 ;[Ca2 + ]i增加需要细胞外液中钙离子存在。     

水通道蛋白最新进展与内耳疾病

二十世纪二十年代,细胞膜的脂质双层的发现解释了细胞如何在pH值或溶质(如Ca2 )浓度变化的细胞外液中维持最佳细胞内环境.五十年代发现的离子通道、离子交换和联合转运方式(ion chnnels,exchngers and co-transportrs)对溶质的跨膜运动提供了分子的解释.     

ATP和乙酰胆碱诱发豚鼠耳蜗外毛细胞内CICR的激光共聚焦研究

目的：运用激光共聚焦研究ATP和乙酰胆碱（ACh）对豚鼠耳蜗外毛细胞内游离钙离子浓度（[Ca^2＋]i）的影响以及诱发Ca^2＋介导的Ca^2＋释放（CICR）的可能机制。方法：用酶孵育机械分离法,分离豚鼠耳蜗外毛细胞（OHC）,钙敏荧光探针Fluo-3染色后,用激光扫描共聚焦显微镜分别记录在细胞外液有钙或无钙条件下,加入ATP、ACh、斯里兰卡肉桂碱（Ryanodine）＋ATP（或ACh）和毒胡萝卜素（Thapsigargin）＋ATP（或ACh）后的OHC的[Ca^2＋],的变化。结果：在含钙的细胞外液中,ATP、Ryanodine＋ATP、Thapsigargin＋ATP、ACh、Ryanodine＋ACh和Thapsigargin＋ACh均可引起[Ca^2＋],升高,引起明显的波峰,荧光强度相对峰值分别为1．60±0．01（ATP）、1．644±0．005（Ryanodine＋ATP）、1．491±0．005（Thapsigargin＋ATP）、1．43±0．01（ACh）、1．58±0．02（Ryanodine＋ACh）、1．398±0．003（Thapsigargin＋ACh）;而在不含钙的细胞外液中,ATP和Ryanodine＋ATP仍可引起[Ca^2＋]。出现幅度较小的波峰,分别为1．341±0．006和1．386±0．008,而ACh,Ryanodine＋ACh、Thapsigargin＋ACh和Thapsigargin＋ATP未引起明显[Ca^2＋],波峰出现,其中ACh不能引起[Ca^2＋]．的升高,Ryanodine＋ACh、Thapsigargin＋ACh和Thapsigargin＋ATP分别引起[Ca^2＋]。缓慢升高。结论：在细胞外液有Ca^2＋的条件下．ATP和ACh引起OHC的[Ca^2＋]。升高,除了通过离子通道引起胞外Ca^2＋内流,还有IP。敏感钙库的释放和诱发CICR。在无Ca^2＋的条件下,ATP仍能诱发CICR,其机制可能是ATP促进IP3敏感钙库释放Ca^2＋,Ca^2＋又诱发了CICR,而ACh的反应是Ca^2＋依赖性的,在细胞外液无Ca^2＋的条件下,ACh不能引起IP。敏感钙库的释放和诱发CICR。     

细胞外ATP诱导的豚鼠耳蜗Ⅰ型螺旋神经节细胞的Ca~(2+)动员

该研究旨在以钙敏荧光探针Fura－2检测细胞外ATP作用下豚鼠耳蜗1型螺旋神经节细胞内游离钙（［ca’“］．）的改变．从而确定在豚鼠耳蜗毛细胞传入神经突触中ATP是否起神经介质或神经调质的作用。结果发现：细胞外ATP能诱导豚鼠耳蜗1型螺旋神经节细胞内【ca’”］；升高，并且是与剂量相关的。在没有细胞外Ca’”存在的情况下，ATP仍能诱导1型螺旋神经节细胞内［Ca’”］．升高，但升高幅度较有细胞外Ca’”时明显减小。这种现象不是对ATP的脱敏，因为ATP的作用是可重复的。细胞外液中加入Ca’一通道阻滞剂La‘－H4，结果与细胞外…     

抑制水通道蛋白1对Hep-2细胞增殖和凋亡的影响

目的:观察水通道蛋白1(AQP-1)对喉癌Hep-2细胞增殖和凋亡的影响。方法:应用MTT法、流式细胞仪及原位末端标记(TUNEL)法、免疫组织化学SABC方法多种技术分别检测AQP-1的抑制剂乙酰唑胺对细胞生长抑制率、凋亡率和细胞内AQP-1蛋白表达的影响。结果:乙酰唑胺在5×10-5mol/L浓度下对Hep-2细胞内AQP-1蛋白表达有明显的抑制作用,细胞生长抑制率和细胞凋亡率均随时间延长而增大,呈时间依赖性。并且TUNEL法检测的细胞凋亡率与免疫组织化学SABC方法检测的AQP-1蛋白抑制率呈明显正相关(r=0.784,P<0.05)。结论:乙酰唑胺在一定浓度下对AQP-1的抑制可显著诱导喉癌Hep-2细胞凋亡,提示AQP-1可能成为治疗喉癌新的靶点。     

表达凋亡素基因的重组禽痘病毒对人喉癌细胞Hep-2的抑制效应研究

目的：探讨含鸡贫血病病毒（CAV）凋亡素（Apoptin）基因的重组禽痘病毒vFVApoptin诱导人喉癌细胞Hep-2凋亡的作用及其作用方式。方法：用vFVApoptin感染体外培养的人喉癌细胞Hep-2,运用MTT染色法检测重组质粒对肿瘤细胞的抑制作用;并运用流式细胞仪检测肿瘤细胞线粒体跨膜电位（△ψm）和细胞内活性氧（ROS）水平变化情况;通过免疫印迹检测细胞色素c（Cyto c）释放;应用底物显色法检测Caspase-3／9活性。结果：vFVApoptin感染可明显抑制Hep-2肿瘤细胞,并具有下调肿瘤细胞△ψm,上调其ROS水平,促进Cyto c释放和激活Caspase3／9的功能。结论：vFVApoptin通过上调Hep-2肿瘤细胞内线粒体ROS产生,造成Cyto c的释放,激活Caspase-9,进而激活Caspase-3等下游凋亡因子,最终通过线粒体途径诱导细胞凋亡抑制Hep-2肿瘤细胞。     

姜黄素联合白藜芦醇抑制人头颈部肿瘤细胞系增殖的机制研究

目的 探讨姜黄素联合白藜芦醇抑制人头颈部肿瘤细胞系增殖的机制。 方法 用姜黄素和白藜芦醇联合处理Hep2(人喉癌细胞株)及FaDu(人下咽癌细胞株),应用MTT(塞唑蓝)比色法检测细胞增殖抑制率,平板克隆增殖实验检测单个细胞集落形成能力,Hoechst33258染色检测细胞凋亡情况,同时应用Real-time PCR法检测Bax和Bcl-2 的mRNA 表达水平。 结果 姜黄素和白藜芦醇对Hep2和FaDu细胞增殖有抑制作用,二者联合处理后,对细胞增殖、细胞克隆形成能力及细胞凋亡的抑制均明显增强;同时,姜黄素和白藜芦醇上调细胞中Bax和下调Bcl-2的mRNA水平。 结论 姜黄素与白藜芦醇联合处理可抑制Hep2及FaDu细胞增殖,作用机制可能与上调Bax、下调Bcl-2基因表达有关。     

p-ERK2及ERK2在鼻息肉组织的表达及其意义

目的 检测磷酸化细胞外信号调节激酶2(p-ERK2)及细胞外信号调节激酶2(ERK2)在鼻息肉(NP)组织的定位及表达情况;初步探讨p-ERK2/ERK2在NP发病中的临床意义。 方法 应用间接免疫荧光技术(IIF)及蛋白免疫印记技术(WB)检测p-ERK2/ERK2在NP及正常鼻黏膜组织的定位及表达水平,并探讨其临床意义。 结果 NP:p-ERK2主要表达在增生的上皮细胞、炎症细胞以及腺上皮细胞,主要位于胞核;ERK2主要表达在腺上皮细胞、炎症细胞,主要位于胞质。正常鼻黏膜组织:p-ERK2主要表达在炎症细胞、腺上皮细胞,主要位于胞核;ERK2主要位于炎症细胞,主要位于胞质。荧光强度值:p-ERK2在NP和正常鼻黏膜组织的表达有统计学差异(P<0.05);ERK2在NP和正常鼻黏膜组织的表达无统计学差异(P>0.05)。WB灰度值:p-ERK2在NP和正常鼻黏膜组织的表达有统计学差异(P<0.05);ERK2在NP和正常鼻黏膜组织的表达无统计学差异(P>0.05)。 结论 p-ERK2在NP的发病机制中可能具有重要作用,而ERK2与NP的发生可能无关。ERK2在NP组及正常鼻黏膜组织均表达,提示ERK2可能参与鼻黏膜正常生理功能的维持。