Ⅱ型糖尿病大鼠颌骨骨髓基质干细胞体外培养及其成骨特性观察

目的:观察Ⅱ型糖尿病大鼠颌骨骨髓基质干细胞(BMSCs)的成骨分化特性。方法:无菌条件下从10周龄GK大鼠(实验组)及同龄正常Wistar大鼠(对照组)下颌骨获取BMSCs,采用全骨髓贴壁培养法对细胞进行纯化及培养,流式细胞仪检测干细胞表型.取第3代细胞成骨诱导培养,分别对两组细胞行茜素红染色,碱性磷酸酶染色及活性测定,培养基钙、磷含量测定,以及real-time PCR测定Runx2基因表达变化。结果:成功培养出Ⅱ型糖尿病大鼠颌骨来源的BMSCs,与正常组比较,实验组BMSCs茜素红染色变浅、钙结节形成减少,碱性磷酸酶(ALP)活性下降,细胞钙、磷分泌显著降低,差异有统计学意(P<0.05);Runx2 mRNA表达也明显降低(P<0.05)。结论:Ⅱ型糖尿病大鼠颌骨来源的BMSCs的成骨分化能力受到损害,并且即使在正常糖浓度下培养其成骨能力仍无法恢复。     

颌骨骨髓基质细胞与牙周膜细胞的生物学特性比较

目的:比较颌骨骨髓基质细胞与牙周膜细胞的基本生物学特性。方法:分离颌骨来源骨髓基质细胞和牙周膜细胞,进行改良体外原代培养。倒置显微镜观察细胞生长及克隆形成情况;CCK-8检测细胞生长曲线;免疫荧光染色检测STR0-1表达;成脂诱导后检测脂滴形成,矿化诱导后检测碱性磷酸酶的变化并用RT-PCR检测7、14 d成骨相关基因OCN的表达水平。结果:两种细胞体外培养均呈成纤维样细胞外形,能克隆生长,均具有活跃的增殖能力;两种细胞STR0-1表达阳性;成脂诱导后可见脂滴形成;矿化诱导后骨髓基质细胞的碱性磷酸酶活性较强,而且OCN基因表达较早且较强。结论:颌骨来源骨髓基质细胞具有较强的增殖及成骨分化能力,具有干细胞特性,可能是有较大临床应用潜力的组织工程种子细胞。     

大鼠颌骨与胫骨骨髓基质细胞生物学特性和基因表达差异的比较

目的 :比较大鼠颌骨来源骨髓基质细胞(M-BMSCs)与胫骨来源骨髓基质细胞(T-BMSCs)生物学特性的差异。方法:体外通过全骨髓贴壁法,分离和培养SD大鼠M-BMSCs和T-BMSCs,取第3代细胞用于:1流式细胞检测鉴定表面标志;2MTT、细胞周期、克隆形成率检测细胞增殖能力差异;3成骨、成脂诱导及染色检测细胞多项分化潜能;4碱性磷酸酶(ALP)活性、染色、免疫荧光染色检测细胞成骨活性的差异;5荧光定量PCR检测Wnt1、Wnt5a、Hoxa11、Runx2、Ocn、Col I的表达差异和成骨诱导后各基因的表达变化。结果:1 M-BMSCs和T-BMSCs阳性表达CD29、CD44,阴性表达CD45;2MTT、细胞周期检测、克隆形成率显示T-BMSCs细胞增殖能力较高;3M-BMSCs在成骨诱导后矿化能力更强;而T-BMSCs成脂诱导形成脂滴的能力更强;4M-BMSCs表达ALP的水平更高;5荧光定量PCR示2种细胞的Wnt1、Wnt5a、Hoxa11、Runx2、Ocn、ColⅠ表达存在差异。结论:体外培养的M-BMSCs和TBMSCs有着不同的生物学特点,其相关基因Wnt1、Wnt5a、Hoxa11、Runx2、Ocn、ColⅠ的表达上存在差异。     

体外培养的大鼠骨髓基质细胞的生物学特性

目的：研究体外培养的大鼠骨髓基质细胞的生物学特性及基成骨细胞表型特征。方法：分离大鼠四肢长骨髓基质细胞,常规和矿化培养液培养,测定细胞生长曲线,碱性成纤细胞生长因子（bFGF）、重组人骨形成蛋白－2（rhBMP-2)及矿化培养液对骨髓基质细胞性磷酸酶（ALP）活性的影响,观察矿化结节的形成。结果：大鼠骨髓基质细胞群体倍增时间（DT）为66．1h;在矿化液培养条件下细胞DT为50．3h。bFGF和rhBMP－2均不同程度增加骨髓基质细胞碱性磷酸酶的活性。矿化液有较明显的增加骨髓基质细胞碱性磷酸酶活性的作用,用茜素红染色法显示较多的深红色矿化结节。常规培养条件下大鼠骨髓基质细胞生长虽呈现密集单层,没有矿化结节形成。结论：大鼠骨髓基质细胞在体外可以稳定传代培养,在矿化培养液诱导培养条件下可以向成骨细胞分化,bFGF和rhBMP－2有助于骨髓基质细胞表现成骨细胞表型特征,提示骨髓基质细胞在骨移植研究领域有重要的应用价值。     

骨髓基质细胞体外培养成骨的研究进展

骨髓具有成骨潜能的现象在一百年前人们就观察到了。近年来,随着对成骨细胞来源和骨髓成骨潜能研究的深入,通过体内外培养骨髓基质细胞证实了骨髓成骨的细胞学基础是骨髓基质细胞中含有向成骨细胞系转化的骨祖细胞及基质干细胞,为临床研究及应用骨髓或骨髓基质细胞提供...     

大鼠骨髓间充质干细胞与脂肪间充质干细胞生物学特性的比较

目的:本研究旨在比较同一个体来源的脂肪间充质干细胞(Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells,ADSCs)和骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)的生长特点和诱导分化能力。方法:取7～10 d SD大鼠的脂肪和骨髓,体外分离、纯化脂肪和骨髓来源间充质干细胞,分别从细胞形态、生长动力学、表面标志、分化潜能等方面进行鉴定和比较。结果:脂肪间充质干细胞的增殖速度明显大于骨髓间充质干细胞(P<0.05),两种细胞所表达的表面蛋白标志物基本相似,但脂肪间充质干细胞表面蛋白标志CD106呈阴性,而骨髓间充质干细胞CD106呈阳性。在成软骨分化中脂肪间充质干细胞弱表达Ⅱ型胶原,而骨髓间充质干细胞不表达。第5、10、15、20代ADSCs及BMSCs经成骨诱导后茜素红染色均呈阳性且有"矿化"结节形成,碱性磷酸酶活性以第5代最强,随着细胞代次的递增,碱性磷酸酶活性呈递减趋势。结论:ADSCs较BMSCs更易于分离培养及体外扩增,诱导条件下成骨、成脂、成软骨能力较强,适合作为再生医学的种子细胞。     

不同来源骨髓间充质干细胞成骨能力的比较

目的 比较人不同来源骨髓间充质干细胞(human bone marrow mesenchymal stem cells,hBMSCs)的骨向分化能力,为骨组织工程筛选种子细胞提供一定的理论基础.方法 体外组织块培养法和有限稀释法培养颌骨来源骨髓间充质干细胞(jaw bone-marrow-derived mesenchymal stem cells,JMMSCs);骨髓穿刺法和密度梯度离心法培养长骨来源骨髓间充质干细胞(bone-marrow-derived mesenchymal stem cells,BMMSCs).流式细胞仪鉴定细胞表面抗原标记,成骨分化诱导后茜素红染色检测细胞矿化能力,成骨分化诱导后qRT-PCR及Western Blot检测细胞成骨相关分子:Runx2、1型胶原(Collagen Type 1,COL-1)、OCN.结果 JMMSCs和BMMSCs均阳性表达CD90、CD105,阴性表达CD34、CD14、CD45.成骨分化诱导21 d后,茜素红染色显示JMMSCs矿化能力强于BMMSCs.成骨诱导7 d、14 d、21 d后,JMMSCs成骨相关分子在基因和蛋白水平上均强于BMMSCs.结论 与BMMSCs相比,JMMSCs成骨分化能力较强,颌骨骨髓可能更适于用作骨组织工程的成体干细胞来源.     

小鼠骨髓基质细胞Kusa-Al体外成骨活性评价

目的：检测骨髓基质细胞系Kusa-Al体外成骨活性，分析其用于成骨细胞功能和分化机制研究的价值。方法：培养Kusa-Al细胞，在常规培养和成骨诱导培养条件下，分别检测细胞的体外成骨活性，包括碱性磷酸酶(ALP)活性、细胞钙沉积能力、体外矿化结节(CN)形成能力、骨桥蛋白(OPN)和骨钙素(0c)表达水平、NF-κB受体激活因子(RANKL)水平。结果：常规培养下，Kusa-Al细胞表现出较高碱性的ALP活性(约为0．75IU／mg)、一定的钙沉积能力，并可检测到OPN和OC表达，但无CN形成，RANKL蛋白低于可检测水平。诱导培养条件下，细胞ALP活性先升高后降低、钙沉积量持续升高、OPN和OC表达水平后期显著提高，汇片后3～7d检测到大量CN形成，汇片后24h可检测到RANKL蛋白。结论：Kusa-Al可能是一种成骨前体细胞，经诱导可以向成骨细胞分化，在体外表现出良好的成骨细胞活性。Kusa-Al细胞可作为成骨细胞功能及其分化机制研究的模型细胞。     

不同周龄大鼠骨髓基质干细胞成骨与成脂分化平衡的研究

目的研究不同周龄大鼠骨髓基质干细胞成骨与成脂肪能力。方法不同周龄(幼年组:2周,成年组:3个月,老年组:18个月)大鼠骨髓基质干细胞原代培养,成骨诱导分化,矿化结节染色,计算矿化率。成脂肪诱导分化,显微镜下观察脂肪滴及检测油红-O染色阳性细胞率。结果全骨髓细胞贴壁的方法得到大鼠骨髓基质干细胞,幼年组成骨分化的矿化率最高,老年组最低。成脂肪诱导油红-O染色阳性率老年组最高,幼年组最低。结论随着年龄的增长骨髓基质干细胞成骨能力减弱,成脂肪能力增强。     

雌激素对大鼠骨髓基质细胞增殖和分化的影响

目的：研究雌激素对大鼠骨髓基质细胞增殖和分化的影响,探讨其对成骨的影响。方法：体外培养4周龄雌性大鼠骨髓基质细胞,以不同浓度雌激素作用于成骨细胞,用噻唑蓝法测定细胞增殖情况;对硝基酚磷酸酯法测定细胞碱性磷酸酶活性;检测培养液中羟脯氨酸含量,了解细胞Ⅰ型胶原的分泌情况;通过矿化结节计数反映细胞的矿化能力。结果：雌激素促进成骨细胞增殖,增加碱性磷酸酶活性;提高培养液中羟脯氨酸含量,峰值浓度为10^-7mol／1,与对照组比较有统计学意义（P〈0．05）;雌激素显著提高细胞的矿化能力,10^-7mol／L浓度作用最显著（＋45．4％,P〈0．05）。结论：雌激素促进成骨细胞增殖和分化,提高其矿化能力,从而刺激骨形成。     

培养状态下成人骨髓基质细胞的生长特性

目的研究培养状态下成人骨髓基质细胞的生长特性,为自体骨组织工程的功能细胞培养提供实验基础研究。方法培养健康成人骨髓基质细胞连续8代,测定第3、6代细胞的生长曲线、分裂指数、贴壁率及倍增时间。结果所测第3、6代细胞生长曲线基本相同,12h内细胞贴壁率达88.54%,分裂指数最高达15‰。结论在本实验条件下,细胞生长较稳定,接种成活率较高,增殖速度较快,可用于自体骨组织工程。     

兔骨髓基质干细胞培养及鉴定

目的：对新西兰大白兔骨髓基质干细胞（BMSCs）进行体外培养及扩增,观察其原代及传代细胞的生长特点及生物学特点,获得足够量的细胞用于材料细胞相容性实验。方法：骨髓髓腔冲洗获得新西兰大白兔幼兔股骨骨髓,用全骨髓培养法进行体外培养获得BMSCs,胰酶消化传代,用条件培养基培养传代细胞。逐日倒置显微镜观察细胞生长情况,对传代细胞进行HE染色和碱性磷酸酶（ALP）染色。结果：幼兔骨髓基质干细胞体外培养生长良好,原代细胞约2周汇成单层,传代后1周左右长满瓶底。HE染色光镜下观察见兔骨髓基质干细胞为单核细胞,细胞呈梭形或不规则长多边形,传代细胞碱性磷酸酶染色呈强阳性。结论：兔骨髓基质干细胞的体外增殖能力强,可诱导为成骨细胞,可作为骨缺损材料细胞相容性研究的受试细胞。并且可以作为骨组织工程的种子细胞。     

富血小板血浆对犬骨髓间充质细胞矿化能力的影响

目的研究富血小板血浆(platelet-rich plasma,PRP)对犬骨髓间充质细胞(marrow stromal cells,MSCs)碱性磷酸酶(alka-line phosphatase,ALP)及矿化结节形成能力的影响。方法将不同浓度(10%、20%、30%)的PRP及重组人骨形成蛋白(rhBMP-2)加入体外培养的第3代MSCs中,对照组为无血清培养液,检测其对细胞ALP活性的影响;将第3代的MSCs在体外进行培养,实验组加入矿化液和PRP(10%或30%),对照组只加矿化液。4周后用茜素红及Von-Kossa染色检测矿化结节的形成。结果10%PRP和rhBMP-2能显著提高MSCs的ALP活性,其中10%PRP对体外矿化结节的形成,亦有一定程度的促进作用。结论PRP有促进MSCs向成骨细胞方向转化的趋势。     

富血小板血浆PRP的体外骨诱导作用研究

目的 :探讨在体外培养中富血小板血浆 (Platelet -RichPlasma ,PRP)对骨髓基质细胞诱导成骨的影响。方法 :从自体静脉血中提取PRP ,配制成条件培养液 ,并作用于培养状态的骨髓基质细胞 ,染色检测细胞碱性磷酸酶表达情况 ,钙化结节形成率 ,放免法测定培养液中骨钙素的含量。结果 :骨髓基质细胞经诱导培养后 ,碱性磷酸酶、骨钙素表达明显增加。结论 :体外培养时 ,PRP可促进骨髓基质细胞的成骨分化。     

降钙素基因相关肽通过Hippo通路调控小鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的实验研究

目的 前期研究发现降钙素基因相关肽（CGRP）能够促进成骨细胞的生物学活性,为了进一步揭示CGRP在骨修复中的作用,检测CGRP对小鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）成骨分化的影响,并对Hippo通路在这个过程中的作用进行了初步探讨。方法 在体外诱导培养的BMSCs中加入不同浓度的CGRP,处理48 h后测试碱性磷酸酶（ALP）活性,以筛选的优势浓度;处理7 d后进行茜素红染色,分别检测细胞的分化情况。应用Western blot检测CGRP作用于BMSCs后,Hippo通路核心分子Mst1/2蛋白磷酸化的表达水平;利用Hippo通路抑制剂维替泊芬（Verteporfin）阻断下游Yap信号,逆转录聚合酶链反应检测其对成骨相关因子Ⅰ型胶原蛋白（ColⅠ）、Runt相关转录因子2（Runx2）mRNA的表达影响。结果 ALP活性检测结果显示,与空白对照组相比,10^-9、10^-8、10^-7 mol·L^-1浓度范围的CGRP都能显著促进小鼠ALP活性的增加（P<0.05）,以10^-8 mol·L^-1浓度的CGRP为最佳刺激浓度。用10^-8mol·L^-1浓度的CGRP处理后,茜素红染色显示钙化结节明显增多。CGRP能够显著上调p-Mst1/2蛋白的表达（P<0.05）;当运用了抑制剂Verteporfin时,显著降低了CGRP诱导的Runx2、ColⅠ mRNA的表达（P<0.05）。结论 CGRP能够促进小鼠BMSCs的成骨分化,且Hippo信号通路介导了CGRP作用于小鼠BMSCs成骨分化的过程。     

骨髓基质细胞的体外培养和成骨方向的诱导分化

目的:体外分离狗的骨髓基质细胞,诱导其成骨分化并鉴定成骨活性.方法:体外分离培养狗的骨髓基质细胞,传代培养中加入10-8rnol/L地塞米松、50 μg/ml维生素C和10mmol/L β-甘油磷酸钠进行诱导分化,进行细胞形态和增殖观察,矿化结节Von Kossa染色,细胞碱性磷酸酶染色和Ⅰ型胶原免疫组化染色检测其成骨活性.结果:骨髓基质细胞经诱导后表现出明显的成骨活性,体外矿化结节Von Kossa钙染色阳性;传代细胞碱性磷酸酶染色阳性,酶活性＞80%,Ⅰ型胶原免疫组化染色强阳性.结论:体外分离培养的骨髓基质细胞中含有骨源性前体细胞,传代细胞具有较强的成骨潜能.     

bFGF真核表达载体的构建及骨髓基质细胞转染

目的：探讨bFGF基因转染骨髓基质干细胞的方法及可行性。方法：构建bFGF基因真核表达质粒,用脂质体法介导转染骨髓基质细胞,通过免疫组织化学、RT-PCR及Western blot方法检测bFGF基因转染骨髓基质细胞的成功性。结果：bFGF基因成功转染大鼠骨髓基质细胞,并能持续稳定地分泌bFGF蛋白。结论：bFGF基因可以转染骨髓基质细胞,并能在骨髓基质细胞内稳定表达。     

纳米羟基磷灰石复合骨髓基质细胞修复兔股骨缺损的实验研究

目的探讨使用纳米羟基磷灰石(Nano-Hydroxyapitite,n-HA)作为骨组织工程支架材料的可行性。方法以成骨条件培养液培养兔骨髓基质细胞(BMSCs)至第3代并以1×106/cm2的密度与n-HA复合培养后回植于骨缺损区(1.0cm×0.8cm×0.5cm)。术后6周、12周处死动物,取缺损区及周围骨质进行肉眼、X线片、免疫组化染色观察及计算机图像分析。结果所有植入物无排除或感染。6周及12周通过肉眼及免疫组化观察实验组修复效果明显优于对照组,新骨面积百分比高于对照组(P<0.05),差异有统计学意义。结论n-HA作为骨组织工程支架材料具有可行性。