可可毛色二孢菌对白木香产生倍半萜诱导作用

为了明确可可毛色二孢菌Lasiodiplodia theobromae对白木香产生倍半萜的诱导作用。采用气质联用（GC-MS）对可可毛色二孢菌PDA发酵液进行检测,发酵液中检测到茉莉酸类化合物（jasmonates,JAs）。利用固相微萃取-气质联用（SPME-GC-MS）检测发酵液处理后白木香愈伤中沉香倍半萜成分,发现其能够诱导白木香愈伤产生α-愈创木烯（α-guaiene）,δ-愈创木烯（δ-guaiene）,α-蛇麻烯（α-humulene）3种沉香倍半萜。推测可可毛色二孢菌可产生茉莉酸类物质,其作为伤害信号分子诱导白木香产生倍半萜。     

忍冬枝枯病对忍冬药材产量和质量的影响

目的:探究忍冬枝枯病对金银花产量、金银花和忍冬藤有效成分含量的影响,为忍冬枝枯病的防治和药材质量评价提供科学依据。方法:在金银花头茬花期比较各病级忍冬植株平均单株结蕾量,并称量花蕾的鲜重、干重;按照2015年版《中国药典》测定各病级忍冬植株金银花样品中绿原酸和木犀草苷的含量以及忍冬藤样品中绿原酸和马钱苷的含量。结果:忍冬0~7级植株平均单株结蕾量、鲜重、干重差异极显著(P0.01),其中健株结蕾量最多,7级植株结蕾量最少。病级越高,植株结蕾量越少,产量越低。各病级忍冬植株金银花样品绿原酸和木犀草苷以及忍冬藤样品绿原酸和马钱苷的含量均达到2015年版《中国药典》标准。金银花中绿原酸的质量分数为2.31%~3.46%,其中1级病树金银花中绿原酸的含量最高,健株(0级)金银花中绿原酸的含量最低。各发病等级植株金银花中绿原酸含量均高于健株,差异极显著(P0.01)。金银花中木犀草苷的质量分数为0.050%~0.065%,健株金银花中木犀草苷的含量最低。健株和其他各发病等级植株金银花中木犀草苷含量差异极显著(P0.01)。忍冬藤中绿原酸的质量分数为0.43%~0.54%,健康植株忍冬藤中绿原酸的含量高于其他各发病等级植株,差异极显著(P0.01)。忍冬藤中马钱苷的质量分数为0.82%~1.58%,各发病等级植株忍冬藤中马钱苷含量均低于健康植株,差异极显著(P0.01)。结论:忍冬枝枯病的发生,有利于金银花中绿原酸和木犀草苷的积累,但会显著降低忍冬藤中绿原酸和马钱苷的含量以及金银花的产量。     

白木香内生真菌的分离鉴定及诱导结香作用研究

目的 分离、纯化经通体结香技术诱导的白木香木质部真菌,筛选能够高效促进白木香产生优质沉香的菌株。方法 采用组织块分离法分离、纯化菌株,通过形态学特征结合内转录间隔区（ITS）序列分析鉴定真菌;将真菌菌液接种到白木香树4个月后进行功能验证;依据《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）2020年版沉香项下薄层色谱、浸出物含量测定、沉香四醇含量测定及特征图谱方法分析菌株诱导效果。结果 从白木香木质部中分离出48株真菌,优势菌株为镰刀菌;经刺盘孢菌属（Colletotrichum sp.）、黑曲霉Aspergillus niger、渐进绿木霉Trichoderma paraviridescens诱导的沉香薄层色谱斑点与对照药材一致;经镰刀菌属（Fusarium sp.）、黑曲霉、渐进绿木霉诱导的沉香浸出物质量分数均大于10%,与对照组差异有统计学意义（P<0.05）;经可可毛二孢菌Lasiodiplodia theobromae、黑曲霉、渐进绿木霉等6株菌诱导的沉香特征图谱与对照药材一致,沉香四醇质量分数均大于0.1%,与对照组差异有统计学意义（P<0.05）。结论 从白木香木质部分离出的内生真菌可诱导沉香形成,其中黑曲霉和渐进绿木霉能够较快速诱导白木香结香,结香所得的树脂品质符合《中国药典》2020年版标准。     

白木香叶化学成分的研究

目的:研究白木香叶的化学成分,为白木香的综合利用提供依据.方法:采用硅胶柱色谱、Sephadex LH-20柱色谱、重结晶等方法进行分离纯化,运用NMR,Ms等波谱学方法进行结构鉴定.结果:从白木香叶中分离鉴定了13个化合物,分别为7-羟基-5,4'-二甲氧基.黄酮(1),洋芹素-7,4'-二甲醚(2),木犀草素-7,3',4'一三甲醚(3),异紫堇啡碱(4),对羟基苯甲酸(5),正三十二(烷)醇(6),正三十一烷(7),α-豆甾醇(8),表木栓醇(9),木栓烷(10),木栓酮(11),芫花素(12),5,4'-二羟基_7,3'-二甲氧基黄酮(13).结论:化合物4为首次从该属中分离得到,化合物1,6～11,13为首次从该植物中分离得到.     

茉莉酸甲酯诱导的白木香cDNA文库的构建及初步鉴定

目的 通过构建茉莉酸甲酯（MeJA）处理的白木香cDNA文库,为揭示伤害诱导沉香倍半萜合成的分子机制奠定基础。方法 以MeJA处理的白木香愈伤组织为材料,以改造的pGADT为载体,利用SMART技术构建白木香全长cDNA文库。结果 构建的文库原始滴度为8.99×10⁶ pfu/mL,阳性克隆子的比例为97%,插入片段的大小在500～3 000 bp,平均大于1 000 bp。结论 构建的文库无论从库容量、克隆效率,还是全长率方面评价,均达到了高质量文库的要求。     

白木香种质资源ISSR标记的遗传多样性分析

目的 白木香Aquilaria sinensis是中国特有的、具有极高经济价值的珍稀濒危药用植物,由于人类对其自然资源的长期过度开发和生态破坏,白木香现仅有零星散生的野生资源,为更好地保护和利用白木香,现对其进行遗传多样性分析。方法 采集了中国14个地区的232份白木香样本,并利用ISSR标记对其进行遗传多样性评价。结果 ISSR标记具有较高的多态性（100%）,表明ISSR是检测白木香遗传多样性的有效方法。对所有样本进行遗传分析,在相似系数为0.71时,可将其聚为4个类群。期望杂合度（He）、Shannon’s信息指数（I）在XL群体中最高,而61.84%的遗传变异发生在群体之间。种群结构分析表明,14个种群能够按照区域和来源进行严格划分,说明种群间的基因交换很少。结论 白木香种源有较好的遗传多样性,但野生资源大幅减少,需加强白木香资源的保护、繁育和利用。     

基于PCR-DGGE技术分析白木香结香前后内生真菌的变化

目的比较白木香结香前后内生真菌群落结构和变化,探讨内生真菌对白木香结香的影响。方法分别提取白木香结香前后总DNA,采用真核生物r DNA ITS区通用引物ITS1F-gc/ITS2进行扩增,变性梯度凝胶电泳(Polymerase Chain Reaction-Denaturing Gradient Gel Electrophoresis,PCR-DGGE)分离后,切割回收条带进行克隆、测序和比对。结果 PCR-DGGE图谱聚类表明,未结香组与结香组分别聚在一起;与未结香组比较,结香组基因型丰富度、香农多样性指数显著提高(P0.01);回收条带测序比对结果多为真菌,极个别序列无比对结果。结论白木香结香前后内生真菌群落存在差异,内生真菌可能参与白木香的结香过程。     

基于PCR-DGGE技术分析白木香结香前后内生细菌的变化

目的比较结香与未结香白木香内生细菌群落结构及变化,探讨内生细菌在白木香结香过程中的作用。方法分别提取结香与未结香白木香总DNA,采用细菌16s r DNA通用引物进行扩增,聚合酶链反应-变性梯度凝胶电泳(Polymerase Chain Reaction-Denaturing Gradient Gel Electrophoresis,PCR-DGGE)比较各样品内生细菌群落结构差异,结合样品薄层色谱(TLC)分析,研究活性成分与内生细菌的关联。结果多食鞘氨醇杆菌Sphingobacterium multivorum在未结香白木香中普遍存在。结香后,内生细菌丰富度和多样性明显增加,PCR-DGGE图谱聚类表明,绝大部分结香样品细菌群态相似性较高,聚在一起;非结香样品间的细菌群态相似性也较高。结论白木香结香前后内生细菌群落存在明显差异,内生细菌可能参与白木香的结香过程。     

筛选诱导白木香产生沉香的真菌的研究

 目的 筛选诱导白木香产生沉香的活性真菌。 方法 野外条件下用真菌接种白木香,利用光学显微镜和扫描电子显微镜分别观察真菌诱导白木香树产生沉香过程中的真菌侵染、定植、真菌与植物的互作情况;用GC-MS检测诱导产生沉香材料中挥发油的主要成分。结果 筛选到三株具有诱导白木香产生沉香的活性真菌,这些真菌的诱导效果尚属首次报道。真菌菌丝能够侵入白木香组织细胞,诱导白木香产生的沉香与天然沉香的化学成分类似。结论 利用本实验得到的3株真菌诱导白木香结香具有重要的理论意义和实际应用价值。
     

人工沉香中白木香酸与浸出物含量的相关性

目的:建立高效液相色谱法测定人工沉香中白木香酸含量的方法,研究其白木香酸与浸出物含量之间的相关性。方法:按2015年版《中国药典》一部进行醇溶性浸出物的含量测定;采用CNW Athena C18-WP色谱柱(4.6 mm×250 mm,5μm),流动相乙腈-0.1%磷酸水溶液(40∶60),流速1.0 m L·min-1,检测波长217 nm,柱温35℃。结果:白木香酸线性范围0.24~24 mg·L-1(r=0.999 7),精密度(RSD)0.4%,24 h内稳定性RSD 0.9%,白木香酸的平均质量分数为27.86μg·g-1,平均回收率96.4%,RSD 2.8%。结论:高效液相法可准确测定人工沉香中白木香酸的含量,所选结香方式中综合法的白木香酸平均含量最高,且白木香酸的含量随着浸出物含量的增加而增加,结合白木香酸与浸出物含量的相关性,可为人工沉香的质量评价提供依据。     

白木香叶脂溶性化学成分研究

目的:研究白木香叶脂溶性化学成分.方法:应用溶剂法和色谱法分离纯化化合物,利用谱学技术鉴定化合物结构.结果:分离得到11个化合物,分别鉴定为β-谷甾醇(1)、二十六烷酸(2)、隐丹参酮(cryptotanshinone,3)、2α-羟基熊果烷(2α-hydroxyursane,4)、二氢丹参酮I(dihydrotanshinone I,5)、丹参酮I(tanshinone I,6)、丹参酮ⅡA(tanshinoneⅡA,7)、2α-羟基熊果酸(2α-hydroxyursolic acid,8)、对羟基苯甲酸(p-hydroxybenzoic acid,9)、对羟基苯酚(hydroquinone,10)和胡萝卜苷(11).结论:除化合物9外,其他化合物均为首次从白木香叶中分离得到.     

国产沉香中的倍半萜类和单萜类化学成分

目的:研究国产沉香的化学成分.方法:通过多种色谱手段,对国产沉香的石油醚及乙醇提取物进行化学成分分离,采用现代波谱技术对化合物的结构进行鉴定.结果:从国产沉香中分离得到9个化合物,分别鉴定为3,3,7-trimethyltri-cycloundecan-8-one(1),longifolene(2),norlongilactone(3),caryophyllenol-Ⅱ(4),humulene diepoxide A(5),kobusone(6),(一)-bornyl ferulate (7),(24R)-24-ethylecholesta-4,22-dien-3-one (8),(24R)-24-3-ono-4-en-sitosterone (9).结论:化合物2～9均为首次从国产沉香中分离得到的化合物.化合物1～6为倍半萜类化合物,化合物7为单萜衍生物,化合物8,9为甾类衍生物.     

白木香叶化学成分的研究

目的:研究白木香叶的化学成分。方法:应用溶剂法和色谱法分离纯化化合物,利用谱学技术鉴定化合物结构。结果:分离得到33个化合物,本文鉴定12个化合物的结构,分别为5-羟基-7,4’-二甲氧基黄酮(1)、金合欢素(2)、木犀草素(3)、芫花素(4)、芫花苷(5)、腺苷(6)、芫花素-5-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(7)、高次衣草素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(8)、次黄嘌呤(9)、尿嘧啶(10)、8-C-β-D-半乳糖基异牡荆素(11)、4-(1,2,3-三羟基丙基)-2,6-二甲氧基苯-1-O-β-D-葡萄糖苷(12)。结论:除化合物1,3,4外,化合物2,5～12均为首次从白木香叶中分离得到。     

白木香树干的化学成分研究

为了研究白木香树干的化学成分,该研究采用硅胶柱色谱与Sephadex LH-20凝胶柱色谱进行分离纯化,并运用波谱方法对所分离的化合物进行结构鉴定。从白木香树干正丁醇萃取物中分离鉴定了16个化合物,经波谱解析鉴定为threo-buddlenol C(1),thero-ficusesquilignan A(2),erythro-buddlenol C(3),(±)-buddlenol D(4),(-)-杜仲树脂酚(5),(-)-松脂素(6),5'-甲氧基落叶松脂醇(7),erythro-guaiacylglycerol-β-coniferyl ether(8), threo-guaiacylglycerol-β-coniferyl ether(9),herpetin(10),(+)-丁香树脂酚(11),curuilignan(12),刺五加酮(13),松伯醇(14),3,4,5-三甲氧基苯酚(15),雪胆甲素(16),其中化合物1~13为木脂素。化合物1~10,14~16均为首次从白木香中分离得到。     

镰刀菌诱导结香对白木香叶内生真菌分布和群落构成的影响研究

为了研究沉香形成前后白木香叶组织中内生真菌的分布和群落构成,采用石蜡永久制片法观察白木香叶组织显微结构,细胞化学法确定内生真菌的分布。通过改良的CTAB法对白木香进行总DNA提取,利用真核生物通用引物同时对植物和内生真菌rDNA ITS序列进行PCR扩增,构建内生真菌rDNA ITS文库,RFLP分析和序列测定,用PUAP软件进行系统发育分析,构建最大简约树。结果表明：镰刀菌诱导结香前后,白木香内生真菌菌丝主要分布于海绵组织和韧皮部,结香后韧皮部内生真菌菌丝相对丰度明显增大;茎点霉是未结香白木香叶内生真菌优势种群,刺盘孢菌是已结香白木香叶内生真菌优势种群;刺盘孢菌是未结香和已结香白木香唯一共有内生真菌,且丰度差异较大。不依赖分离培养的分子生物学方法可快速直观地用于植物组织内生真菌的鉴定。白木香叶内生真菌具有一定的遗传多样性,沉香形成前后白木香内生真菌群落构成差异较大。     

白木香叶的化学成分研究(二)

为综合利用白木香叶的丰富资源,阐明其物质基础,课题组再次对其化学成分进行了研究,采用多种色谱技术对其化学成分进行分离纯化,从白木香叶95%,70%乙醇提取物的氯仿和正丁醇萃取部位共分离得到12个化合物.经多种波谱方法鉴定其结构,分别为鸢尾酚酮2-(O-α-L)-吡喃鼠李糖苷(3),4'-羟基-5-甲氧基黄酮-7-O-葡萄糖(6-1)木糖苷(2),7,3',5'-三甲氧基黄酮苷(3),5-甲氧基芹菜素7-(O-β-D)-葡萄糖苷(4),2-苯乙基1-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(5),红景天苷(6),苯甲醇1-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(7),2,6-二甲氧基-4-羟基苯酚-1-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(8),vanilloloside(9),(+)-丁香脂素(10),β-维生素E(11),豆甾-5-烯-3β,7α-二醇(12),化合物 2,3,5~9,11和12 为首次从该属植物中分离得到.另外,对氯仿萃取部位的9个流分进行了4种人体肿瘤细胞毒活性筛选,均未显示明显活性.     

白木香查尔酮合酶基因的克隆和生物信息学分析

目的:对国产沉香的源植物白木香Aquilaria sinensis查尔酮合酶(chalcone synthase,CHS)基因AsCHS1编码区进行克隆,并对其进行生物信息学分析和表达分析。方法:根据已报道的白木香伤害转录组高通量测序结果分析获得1条具有查尔酮合酶保守结构域的CHS基因序列,采用RT-PCR技术,以不同伤害时间白木香木质部混合样品总RNA为模板克隆得到白木香AsCHS1的基因编码区序列,并对AsCHS1蛋白进行理化性质、蛋白二级结构及三维结构预测分析。另外,采用qRT-PCR方法,以组蛋白(histones)为内参对AsCHS1基因在伤害胁迫下的表达模式进行分析。结果:序列分析表明,所克隆的AsCHS1基因编码区开放阅读框(opening reading frame,ORF)长为1 194 bp,编码397个氨基酸残基,命名为AsCHS1。qRT-PCR实验证明该基因表达量在伤害后12 h最大,说明该基因能够在早期响应伤害胁迫。结论:白木香AsCHS1基因的编码区序列的分离克隆为进一步研究AsCHS1蛋白在白木香中黄酮合成途径中的功能及表达调控奠定基础。     

白木香乙酰乙酰基辅酶A硫解酶基因(AsAACT)的克隆与表达分析

目的：对国产沉香的基原植物白木香Aquilaria sinensis （Lour.）Gilg乙酰辅酶A酰基转移酶（acetyl-CoA C-acetyl transferase,AACT）基因AsAACT全长进行克隆并展开生物信息学分析和表达分析,为解析沉香萜类次生代谢产物的生物合成机制奠定基础。方法：根据获得的白木香转录组数据库AACT部分转录本序列设计引物,采用RT-PCR及RACE技术,以白木香茎cDNA为模板,克隆获得AsAACT全长,进行生物信息学分析;采用荧光定量PCR,以GADPH为内参,分析白木香愈伤组织受不同伤害胁迫AsAACT的表达模式。结果：AsAACT开放阅读框（opening reading frame,ORF）为1 236 bp,编码411个氨基酸残基,酶命名为AsAACT;白木香愈伤受物理伤害（切割）后表达量没有明显变化,但受化学伤害（MeJA）后4 h表达量升高了5.5倍,说明该基因对MeJA诱导的化学伤害较敏感,且能够在早期响应伤害胁迫。结论：通过AsAACT基因的全长cDNA克隆和表达特性分析,为后续深入研究其在沉香倍半萜合成途径的功能奠定基础。     

白木香内生真菌多节孢 Nodulisporium sp. A4的化学成分研究

目的:研究来源于药用植物白木香、具有抗肿瘤活性的内生真菌多节孢Nodulisporium sp.A4的化学成分.方法:采用马铃薯葡萄糖(PD)液体培养基培养、乙酸乙酯萃取得到内生真菌A4的发酵液和菌丝体粗提物,采用正相硅胶柱色谱、反相硅胶柱色谱、葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱色谱、制备薄层色谱和重结晶等方法对粗提物进行分离纯化,运用现代波谱技术(NMR,MS)结合文献对照鉴定化合物结构.采用MTT法测定化合物的体外抗肿瘤活性.结果:从内生真菌A4的发酵液中分离获得7个化合物,分别为5-methyl-2-vinyltetrahydrofuran-3-ol(1),6-methyl-2-(5-methyl-5 -vinyltetrahydrofuran-2 -yl)hept-5-en-2-ol (2),6α-hydroxycyclonerolidol(3),rel-( 1S,4S,5R,7R,10R) -10-desmethyl-1 -methyl-11 -eudesmene(4),酪醇(5),8-甲氧基-1-萘酚(6),1,8-二甲氧基萘(7).从内生真菌A4的菌丝体中分离获得3个化合物,分别为麦角甾醇(8),过氧化麦角甾醇(9),啤酒甾醇(10).药理活性评价结果表明在作用浓度为100 mg·L-1时,化合物3和4对肿瘤细胞SF-268和NCI-H460的抑制率分别为89.1％,44.2％和82.3％,79.8％.结论:化合物1为新的天然产物,化合物2,3,7,10为首次从该属真菌中分离得到,化合物3和4对肿瘤细胞SF-268和NCI-H460的增殖具有一定的抑制作用.