抗阿尔茨海默病重组真核表达载体的构建

目的:将淀粉样蛋白N端的抗原表位基因以4种不同的组合与小鼠IgG重链区基因融合,构建抗阿尔茨海默病的重组质粒.方法:通过RT-PCR技术从小鼠脾组织中克隆IgG重链区cDNA,将柔性接头与抗原表位基因序列设计在5′端引物中,然后以克隆出的小鼠IgG重链区cDNA为模板,用PCR法克隆出由柔性接头将抗原表位和IgG重链区基因融合在一起的序列,并插入到pVAX质粒载体中.结果:扩增出来的4种不同组合的抗原表位基因和IgG重链区基因融合序列大小分别为999、1 020、1 005、1 026 bp,均与GenBank上登录的相符;pVAX重组质粒酶切结果表明融合基因正确地插入到pVAX载体中,全自动测序亦显示抗原表位基因和IgG重链区基因为所需基因,接头序列也完全正确.结论:成功构建了抗阿尔茨海默病的4种表位基因-IgG重链区融合表达的重组质粒,为探索防治阿尔茨海默病打下基础.     

结核分枝杆菌抗原蛋白ESAT—6基因重组穿梭质粒的构建与鉴定

目的：构建分泌性表达结核分枝杆菌抗原蛋白ESAT－6的重组卡介苗，方法：分别以卡介苗（BCG）和结核分枝杆菌H37Rv株基因组DNA为模板。通过PCR扩增得到的117bp的BCGα抗原（α－Ag)信号肽序列和285bp的结核杆菌esat-6基因序列，将esat-6基因与大肠杆菌－卡介苗穿梭质粒载体pMV261重组，得到重组质粒pME,再将BCGα－Ag信号肽序列克隆至pME中，得到重组质粒pSME。结果：质粒pSME用双酶切和PCR扩增鉴定证实，克隆基因α-Ag信号肽序列和esat-6正确插入载体pMV261，结论：重组质粒pSME可望在BCG中分泌性表达结核分枝杆菌的免疫保护性抗原蛋白ESAT－6，该质粒的构建成功为改造卡介苗，发展新型结核病疫苗奠定了基础。     

结核杆菌Ag85B的基因克隆及在大肠杆菌中的表达

目的：通过结核杆菌Ag85B基因的克隆和在大肠杆菌表达的研究,探讨Ag85B蛋白作为候选疫苗用于结核免疫预防和治疗的可行性。方法：用PCR技术,扩增人结核杆菌Edman株Ag85B基因序列,并将扩增的DNA片段插入克隆质粒载体pUC18,用质粒酶谱和DNA充阢分析鉴定重组克隆。克隆的Ag85B基因插入原核表达质粒pBV220,构建重组Ag85B表达质粒,用SDS－PAGE和Western blot鉴定大肠杆菌表达的重组蛋白。结果：成功克隆了结核杆菌Ag85B基因,构建了Ag85B的原核表达载体,获得了高效表达菌株,目的蛋白的表达量达菌总蛋白的25％－30％。结论：获得了高效表达人结核杆菌Ag85B成熟蛋白的工程菌株,为Ag85B保护性抗原位点分析和新型结核疫苗的研制奠定了基础。     

乙肝HBsAg和结核杆菌HSP70融合表达载体的构建

目的：构建乙肝HBsAg和结核杆菌HSP70融合表达质粒。方法：用PCR方法从结核杆菌H37Rv基因组中扩增出结核杆菌HSP70基因序列,应用T－A克隆技术,克隆到质粒pGEM-T vector,经DNA测序证实基因碱基无误后,亚克隆到真核表达质粒pcDNA3.1( ),构建成pcDNA3.1-HSP70重组质粒,然后,再用PCR方法,从质粒pEcob6中扩增出HBsAg基因,并克隆到质粒pcDNA3.1-HSP70,将HBsAg基因的C端与HSP70基因N端连接,构建HBsAg和HSP70融合表达质粒pcDNA3。1－SHSP70,结果：经酶切鉴定和DNA测序证实重组质粒构建正确,结论：乙肝HBsAg和结核杆菌HSP70融合表达载体构建成功。     

真核表达载体pVAX1-mSLC的构建及在COS-7细胞中的表达

目的：构建小鼠次级淋巴组织趋化因子（mSLC）高效真核细胞表达载体pVAX1-mSLC。方法：用BamHⅠ和XbaⅠ双酶切重组克隆pMD-mSLC,胶回收约410bp的SLC基因片段,以亚克隆法构建于真核表达载体pVAX1的相应酶切位点。转化后进行菌落PCR分析和HinDⅢ酶切鉴定。阳性克隆提取质粒,体外电穿孔法转染COS-7细胞,用Western blot检测转染细胞中mSLC的瞬时表达。结果：菌落PCR和HindⅢ酶切鉴定证实,mSLC基因片段正确插入到真核表达载体pVAX1中。Western blot检测表明,以重组质粒pVAX1-mSLC转染的COS-7细胞能表达mSLC,表达产物的相对分子量同预期的结果相一致。结论：成功地构建小鼠SLC基因的真核表达质粒pVAX1-mSLC,用它转染COS-7细胞后,能瞬时表达mSLC,为下一步mSLC的肿瘤基因治疗研究奠定了基础。     

结核杆菌Ag85B的基因克隆及在大肠杆菌中的表达

目的通过结核杆菌Ag85B基因的克隆和在大肠杆菌表达的研究,探讨Ag85B蛋白作为候选疫苗用于结核免疫预防和治疗的可行性。方法用PCR技术,扩增人结核杆菌Edman株Ag85B基因序列,并将扩增的DNA片段插入克隆质粒载体pUC18,用质粒酶谱和DNA序列分析鉴定重组克隆。克隆的Ag85B基因插入原核表达质粒pBV220,构建重组Ag85B表达质粒,用SDS-PAGE和Westernblot鉴定大肠杆菌表达的重组蛋白。结果成功克隆了结核杆菌Ag85B基因,构建了Ag85B的原核表达载体,获得了高效表达菌株,目的蛋白的表达量达菌体总蛋白的25％～30％。结论获得了高效表达人结核杆菌Ag85B成熟蛋白的工程菌株,为Ag85B保护性抗原位点分析和新型结核疫苗的研制奠定了基础。     

结核杆菌免疫保护性抗原Ag85A的基因克隆与表达研究

目的 为结核病新型疫苗研制提供靶基因和鞭抗原。方法 根据结核杆菌H37Rv株免疫保护性抗原Ag85A的基因序列自行设计一对寡核苷酸引物，以结核杆菌H37Rv株基因组DNA为模板，通过PCR扩增获得具有完整开架读码框（ORF）的Ag85A抗原基因，并将其正向插入真核和原核穿梭表达型载体pBK-CMV构建重组质粒，重组质粒转入大肠杆菌后IPTG诱导表达，并对其表达产物进行Western-blotting分析。结果 PCR扩增获得了具有完整开架读码框的Ag85A抗原基因；构建了Ag85A抗原基因真核和原核穿梭表达型载体；Ag85A抗原基因在大肠杆菌中实现了稳定表达，结论 成功地对结核杆菌免疫保护性抗原Ag85A进行了基因克隆与表达，为进一步研究其在结核病新型疫苗研制中的应用奠定了基础。     

结核分支杆菌Mtb8.4抗原原核表达质粒的构建与鉴定

目的构建结核杆菌低分子质量抗原Mtb8.4基因的原核表达重组质粒,为其蛋白质的表达及免疫学研究打下基础.方法 PCR扩增目的基因,克隆到质粒pET-His T7启动子的下游,转化大肠杆菌TOp10F‘,进行重组子的筛选、鉴定.结果 Mtb8.4基因正向插入表达载体中,测序证实具有正确的读码框,基因序列与文献报道一致.结论重组原核表达质粒pET-His-Mtb8.4构建成功.     

结核杆菌HSP70真核表达载体的构建

目的：构建结核杆菌HSP70重组真核表达质粒。方法：用PCR方法从结核杆菌H37RV基因组中扩增出结核杆菌HSP70基因DNA序列,应用T－A克隆技术,克隆到质粒GPEM－G vector, 经DNA测序证实基因碱基无误后,亚克隆到真核表达质粒PCDNA3．1（＋）,构建成PCDNA3．1－HSP70重组质粒。结果：经酶切鉴定,证实重组质粒构建正确。结论：结核杆菌HSP70真核表达载体构建成功。     

鼠源轮状病毒抗原基因的表达载体构建及农杆菌转化研究

目的 构建表达鼠源轮状病毒抗原基因vp4的植物载体及农杆菌转化。方法 抗原基因vp4经PCR扩增后直接克隆到pUC-T载体，双酶切目的片断和植物表达载体，以T4连接酶将目的片断与载体相连接，电转化方式将重组质粒转入农杆菌。结果 成功地将目的基因定向克隆到表达载体，并转入到农杆菌中。结论 pUC-T载体可直接进行PCR扩增产物克隆，便于测序：电转化方式可以有效、快速地将大分子量质粒（＞10kb）转入农杆菌中。     

结核杆菌ＥＳＡＴ-６抗原多表位ＤＮＡ疫苗的构建与表达

目的:构建含3个结核杆菌ESAT-6抗原T细胞表位及Fh3配体基因的重组质粒,并使其在大鼠肾小球系膜细胞(GMCs)中表达.方法:用计算机软件预测结核杆菌ESAT-6抗原的T细胞表位谱,选取3个T细胞表位,并以Ala-Ala-Tvr(AAY)序列作为接头,合成全基因序列,定向克隆入真核双表达载体pIRES及质粒plRES-FL.在酶切分析与序列测定后.用PEI转染至GMCs细胞,并行Western blot鉴定其体外表达.结果:核酸序列测定证实重组质粒构建正确,Western blot证实该重组质粒能在体外GMCs细胞中表达融合蛋白.结论:成功构建了结核杆菌ESAT-6抗原多表位基因重组质粒.     

结核分枝杆菌Ag85B-Ag85A双抗原融合真核表达质粒的构建及表达

目的：构建结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B-Ag85A融合基因及其双价抗原真核表达载体．方法：采用gene SOE-ing法将Ag85B和Ag85A编码基因用疏水甘氨酸接头(Gly4Ser)3行PCR扩增融合，经限制性内切酶消化后克隆入pcDNA3．1( )中构建真核表达质粒pCDAg85B-A，酶切、DNA测序鉴定，用脂质体法将pCDAg85B-A转染COS-7细胞，采用RT-PCR，ELISA方法检测其表达．结果：Ag85B-Ag85A融合基因定向克隆人pcDNA3．1( )，双向测序表明碱基无突变，Ag85B-Ag85A融合基因在真核细胞中能表达．结论：成功构建结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B-Ag85A融合基因及其双价抗原真核表达载体，为结核病基因疫苗的研究奠定基础．     

结核分枝杆菌Ag85B-MPT64融合基因的构建表达

目的：构建结核分枝杆菌(H37Rv)Ag85B-MPT64融合基因并在真核细胞中表达．方法：采用序贯PCR(geneSOEing)法将Ag85B和MPT64编码基因用疏水甘氨酸接头(Gly4Ser)3经PCR扩增融合，定向克隆入pcDNA3．1( )中。采用脂质体转染法将pcDNA／Ag85B—MPT64(pcDNA／AM)转染COS-7细胞，用RT-PCR、ELISA和斑点印迹法检测其表达。结果：Ag85B-MPT64融合基因经双向DNA序列测定，碱基突变率为0．11％(2／1707)，突变为无意义突变；重组质粒转染COS-7细胞后经检测证实，该融合基因能在真核细胞中表达。结论：成功地构建了Ag85B-MPT64融合基因并在真核细胞中表达，融合蛋白具有良好的抗原性。     

E型沙眼衣原体MOMP基因重组质粒的构建与表达

目的：构建E型沙眼衣原体（Ct）主要外膜蛋白（MOMP）基因重组真核表达质粒pVAX1-MOMP,为探索安全的E型CtDNA疫苗奠定基础。方法：根据Genebank中E型Ct MOMP基因序列设计引物,用高保真PCR方法从E型Ct基因组DNA中扩增得到约1.1kb的MOMP片段,克隆至pcDNAⅡ载体,测序后亚克隆至表达载体pVAX1,构建卡那霉素抗性真核重组表达质粒pVAX1-MOMP,并以重组质粒转染COS-1细胞进行表达,用Western blotting方法鉴定表达产物。结果：从E型Ct基因组DNA中扩增出特异的MOMP基因片段,酶切鉴定及DNA序列测定证实pVAX1-MOMP重组质粒构建正确,能在COS-1细胞内表达,表达产物能与抗MOMP单克隆抗体特异性结合。结论：成功构建E型沙眼衣原体MOMP真核表达质粒pVAX1-MOMP,并在真核细胞内获得表达。     

结核分枝杆菌抗原MPT83和MPT64 二价基因疫苗的研究

目的探讨结核杆菌两种抗原MPT83 和MPT64基因疫苗的免疫原性和免疫保护性.方法用成对引物扩增MPT83 和MPT64两种抗原基因,构建到同一载体pJW4303中,测序正确和体外表达验证后免疫小鼠,间接酶联免疫吸附试验(ELISA)方法测定3次免疫后小鼠的抗体滴度.对3次免疫后的小鼠脾细胞进行培养,抗原刺激,用夹心 ELISA方法测定细胞因子IFN-γ和IL-4的含量.免疫小鼠攻毒,进行细菌培养,检测肺脏和脾脏的载菌量.结果每次免疫后抗原的滴度分别为 1∶ 200、1∶ 800、1∶ 6400,而卡介苗(BCG)组的抗体滴度为1∶ 800,空载体组未检测到抗体滴度.融合的二价基因疫苗免疫小鼠,主要诱发Th1 型细胞因子,IFN-γ占优势,二价组中的含量为7520 pg/ml, IL-4的含量仅为ng级.H37Rv攻毒后,二价组小鼠的肺脏载菌量为(2.21±0.03) ×105,比空载体免疫小鼠低103倍,比BCG免疫小鼠低10倍.结论抗原MPT83和MPT64二价基因疫苗有效提高了机体保护效力,对于结核病的防治具有一定的借鉴价值.     

铜绿假单胞菌外膜蛋白F与HSV-1VP22融合DNA疫苗的构建与表达

目的:构建铜绿假单胞菌外膜蛋白F与Ⅰ型单纯疱疹病毒(herpes simplex virus 1,HSV-1) VP22融合表达的DNA疫苗,并研究其在真核细胞中的表达情况.方法: 构建重组质粒 pVAX1-OprF、 pVAX1-VP22、 pVAX1-VP22-OprF、 pVAX1-OprF-VP22.原核表达VP22 的碳端蛋白,以电洗脱的方法得到纯化蛋白,免疫BALB/c小鼠,制备VP22蛋白的抗血清,West-ern blot鉴定抗体特异性.最后,以脂质体法将重组质粒转染真核细胞,利用Western blot检测其在真核细胞中的表达情况.结果: 成功制备了抗VP22的抗血清,重组质粒在真核细胞中得到了表达.结论: 铜绿假单胞菌OprF与 HSV-1VP22融合表达的重组质粒能够在真核细胞中表达,这为进一步的动物实验打下了基础.     

Rv1272和Rv1273与结核分枝杆菌耐药相关性研究

目的研究结核分枝杆菌Rv1272和Rv1273基因编码蛋白与药物外排的关系。方法利用生物信息学方法分析Rv1272和Rv1273基因及其编码蛋白的结构,采用PCR技术扩增该两个基因,并与pMF406质粒连接构建重组质粒,测序正确后,电穿孔法将重组质粒转化耻垢分枝杆菌m c2155。采用W estern b lotting对两个目的蛋白进行亚细胞定位;试管法测定重组菌株对常用的9种抗菌药物的最低抑菌浓度(M IC),以转化pMF406空质粒的耻垢分枝杆菌作为对照菌株。结果经测序验证重组质粒构建成功,W estern b lotting结果显示Rv1272和Rv1273为膜蛋白。试管法测定结果显示:含有目的基因的重组菌株对9种抗菌药物的M IC与对照菌株比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论 Rv1272和Rv1273蛋白为膜蛋白,未发现其与结核菌耐药之间的直接关系。     

真核表达质粒pVAX1-Der p 1的构建及在真核细胞中的表达

目的:构建真核表达质粒pVAX1-Der p 1，检测质粒编码的重组蛋白在真核细胞293T中的表达，为进一步的动物实验打下基础。方法:分离屋尘螨总RNA，根据GenBank已公布的Der p 1核酸序列设计引物，PCR扩增Der p 1编码基因，以其全长为目的基因，定向克隆至真核表达载体pVAX1，将其转化大肠杆菌DH...     

颗粒溶素对结核分枝杆菌感染小鼠的保护效应

目的:构建颗粒溶素(GNLY)真核表达质粒,并将重组质粒肌肉注射结核分枝杆菌感染小鼠观察其保护效应。方法:将人颗粒溶素cDNA插入pcDNA3.1(-)构建真核表达质粒。18只感染结核分枝杆菌H37Rv株的BALB/c小鼠随机分为生理盐水组、pcDNA3.1(-)质粒组和GNLY质粒组。感染第1天和第6天各组小鼠分别从后腿股四头肌注射生理盐水、pcDNA3.1(-)质粒、GNLY质粒,免疫2次。感染4周后,处死各组小鼠,检测器官活菌数[lgCFU/(g.ml)],脾重指数(WI),并观察肺、脾组织病理情况及抗酸染色情况。结果:GNLY质粒组肺组织活菌数为6.688±0.003,显著低于生理盐水组(7.821±0.090,P<0.01)和pcDNA3.1(-)质粒组(7.848±0.017,P<0.01);GNLY质粒组脾组织活菌数为7.140±0.034,显著低于两对照组(7.805±0.080,7.858±0.043,P<0.01)。GNLY质粒组脾重指数(2.575±0.649)也显著低于生理盐水组(4.580±0.967,P<0.01)和pcDNA3.1(-)质粒组(3.885±0.228,P<0.01)。GNLY质粒组肺脏病理学损害明显轻于两对照组,组织抗酸染色细菌荷载数量明显较两对照组低。结论:GNLY对结核分枝杆菌感染小鼠具有一定的保护作用。     

结核分支杆菌抗原85B真核表达质粒的构建

目的:构建结核分支杆菌分泌性抗原85B的真核重组表达质粒。方法:设计85B的特异引物,采用多聚酶链反应(PCR)技术从含85B基因质粒DNA中扩增85B基因片段,克隆至pMD18-T载体,经测序分析后,亚克隆至真核表达载体pVAX1,PCR和双酶切鉴定阳性菌株。结果:PCR扩增获得85B的基因片段,测序获得的正确片段被亚克隆至真核表达质粒pVAX1构建真核重组表达质粒pVAX1-85B。结论:成功构建了85B的真核重组表达质粒pVAX1-85B。