宽体金线蛭5种提取方法的比较

宽体金线蛭５种提取方法的比较中国中医研究院基础理论研究所（北京１００７００）丁家欣，欧兴长，张秋海，张玲，刘振丽ＣｏｍｐａｒｉｓｏｎａｍｏｎｇＦｉｖｅＤｉｆｆｅｒｅｎｔＥｘｔｒａｃｔｉｎｇＭｅｔｈｏｄｓｏｆＷｈｉｔｍａｎｉａＰｉｇｒａＷｈｉｔｍａｎ￥...     

宽体金线蛭室内产茧、孵化及仔蛭饥饿研究

目的：建立宽体金线蛭室内网箱湿土养殖新模式,为中药材生产质量管理规范及规模化繁养殖提供参考依据。方法：以野外采捕的具有生殖环带的宽体金线蛭为试验材料,在室内采用网箱湿土法养殖,进行宽体金线蛭产茧、卵茧孵化及仔蛭饥饿试验研究。结果：亲蛭采用网箱湿土法养殖17d,其平均成活率为90％;产茧前具有生殖环带（土黄色）,产茧后生殖环带消失;亲蛭产卵茧后平均体重下降率达（29．94±0．01）％;产卵茧期间共收获卵茧79枚,平均产茧量为1．8枚／条,卯茧平均重量为（0．50±0．21）g／枚,平均长径和短径分别为（1．75±0．31）cm／枚和（1．10±0．18）cm／枚;卵茧在室温下（14—33℃）孵育34d,共孵出仔蛭865条,每枚卵茧孵出（11．4±2．0）条仔蛭,卵茧孵化率达92．57％。初孵仔蛭平均个体体重为（0．0205±0．0084）g。饥饿试验表明,在140d时,对照组存活11条水蛭,成活率仅22％,其平均个体体重为（0．1084±0．0877）g,仔蛭个体体重有随日龄的增加而增加趋势;饥饿组仔蛭在140d时全部死亡。结论：在适宜的条件下,采用网箱湿土养殖法,宽体金线蛭可在室内产茧,卵茧集中孵育及亲蛭和仔蛭分开饲养。     

基于分子模拟技术筛选宽体金线蛭抗凝活性肽

目的：采用分子模拟技术从宽体金线蛭来源多肽库中筛选抗凝活性多肽,结合分子对接初筛及分子动力学模拟复筛,最终通过抗凝实验验证得到宽体金线蛭抗凝活性多肽。方法：利用虚拟酶切技术对宽体金线蛭蛋白库进行酶切,得到宽体金线蛭多肽候选库;选择凝血酶为凝血活性靶点,采用HPEPDOCK及Discovery Studio CDOCKER两种方法进行分子对接,并利用分子动力学模拟技术对分子对接初筛结果中对接结合能高的复合物进行动力学模拟复筛,通过MM-PBSA模块分析计算凝血酶-多肽复合物结合自由能;最后采用固相合成法化学合成复筛中稳定结合的宽体金线蛭多肽并进行体外抗凝活性测定。结果：经过虚拟酶切共得到3317条无毒多肽,通过分子对接进行初筛,结合分子动力学模拟复筛,得到1条结合凝血酶效果最好的目标抗凝肽,该多肽序列为QNTVGLDDFFSSYER,结合自由能为–427.506 kJ·mol^–1。凝血酶Arg233残基是该凝血酶-多肽复合物中介导结合相互作用的关键氨基酸。该宽体金线蛭抗凝肽在体外活性测定中确能延长凝血酶时间。结论：利用分子模拟技术有效筛选出1条宽体金线蛭抗凝活性肽,...     

宽体金线蛭的特异性PCR分子鉴定

[目的] 实验旨在通过寻找宽体金线蛭单核苷酸多态性（SNP）位点,设计宽体金线蛭的特异性鉴别引物,建立宽体金线蛭特异性聚合酶链式反应（PCR）检测方法,实现对宽体金线蛭及其常见混伪品的快速鉴别。[方法] 通过比对宽体金线蛭与其常见混伪品的细胞色素C氧化酶亚基I（COI）序列,寻找宽体金线蛭COI基因序列内SNP位点,设计特异性鉴别引物。[结果] 进行PCR后仅宽体金线蛭能够扩增得到149 bp的条带,混伪品不能扩增出明显目的条带。向扩增产物中加入SYBR Green I核酸染料染色,宽体金线蛭样品在紫外灯下显黄绿色荧光,混伪品不显荧光。[结论] 该方法能够准确快速鉴别宽体金线蛭与其常见混伪品,为中药材市场上宽体金线蛭的快速鉴别提供技术支持。     

宽体金线蛭耗氧率与窒息点的初步研究

目的:研究宽体金线蛭的耗氧率和窒息点。方法:应用呼吸室法进行研究。结果:平均体重为10 g的宽体金线蛭,15~35℃变温下耗氧率为0.049~0.094 mg.g^-1.h^-1,耗氧量为0.44~0.67 mg.p^-1.h^-1,窒息点为0.9~1.51 mg.L^-1;20℃条件下耗氧率为0.044~0.058 mg.g^-1.h^-1,耗氧量为0.19~0.77 mg.p^-1.h^-1,窒息点为1.4~1.57 mg.L^-1。结论:宽体金线蛭的耗氧率随水温的升高而上升;窒息点与温度和体重呈负相关;体重与耗氧率呈负相关,与耗氧量呈正相关;耗氧率白天和夜晚的差异不大。     

微山湖地区宽体金线蛭的群体考察与产茧后药材质量评价

目的:建立科学的宽体金线蛭种蛭筛选原则,并对产茧后药材进行质量评价。方法:从微山湖地区采集野生宽体金线蛭1193条,对体质量和生殖环带发育等群体特征进行考察。将种蛭分为10、15、20 g 3个试验组,建立卵茧成熟度观察方法以判断适宜的挖茧时机,通过产茧数、茧体积、出苗数等指标考察体质量对宽体金线蛭繁殖性能的影响。依照2015年版《中华人民共和国药典》对产茧后水蛭药材的性状和抗凝血酶活性进行质量评价。结果:微山湖地区宽体金线蛭野生种群的体质量普遍较小,15 g及以上的种蛭仅占样本群体的19.53%;宽体金线蛭的繁殖性能随种蛭体质量的增加而显著提高,20 g试验组的产茧数(5.9个)和出苗数(37.3条)分别是10 g试验组的1.59倍和1.45倍。产茧后种蛭的死亡率和体质量损失率可高达37%和59%,药材厚度仅为产茧前的49%～72%,腥味散失严重、脆度下降,但产茧前后抗凝血酶活性变化不大,均为3～5 U·g~(-1)。结论:微山湖地区野生宽体金线蛭的种群有退化趋势,建议使用15 g及以上的种蛭进行繁殖生产。产茧后药材的商品规格和等级较低,不适宜作为饮片直接用于临床。     

宽体金线蛭不同炮制品抗炎作用及使用方法的药理研究

比较了宽体金线蛭3种炮制品,对小鼠急性炎症模型的抗炎作用、免疫吞噬能力。以体内、外抗凝及体内抗栓作用为指标,比较了供试品不同使用方法的活血作用,为全面认识宽体金线蛭的药理作用及合理使用方法,提供了初步实验依据。     

宽体金线蛭仿生酶解液物质基础分析

目的 对宽体金线蛭仿生酶解液进行物质基础分析。方法 采用化学定性和定量的方法,对固形物、无机盐、肽、氨基酸等物质进行含量测定,并进行核苷特征图谱及肽特征图谱研究。结果 通过对15批宽体金线蛭仿生酶解液中各物质含量测定及特征图谱研究,确定固形物、无机盐、肽、游离氨基酸、总氨基酸的质量浓度分别为75.5～79.7、10.7～12.7、42.6～49.4、1.9～3.1、49.4～51.6 mg·mL^–1。建立宽体金线蛭仿生酶解液核苷特征图谱,共标定和归属了4个特征峰;建立宽体金线蛭仿生酶解液肽特征图谱,共标定6个特征峰。结论 建立了宽体金线蛭仿生酶解液中各物质含量测定及特征图谱的研究方法,简便快捷、重复性好,可用于对其进行质量控制。     

不同基质和亲本密度对宽体金线蛭繁殖性能的影响北大核心

目的:探明不同基质和亲本密度对宽体金线蛭繁殖性能的影响,为促进宽体金线蛭规模化人工繁殖提供参考依据。方法:分别设置5种基质处理组:土壤组(A)、稻草组(B)、牛粪组(C)、土壤与稻草混合组(体积1∶1,D)、土壤与牛粪混合组(体积1∶1,E)和6个亲本密度处理组:30、60、90、120、150、180尾/m^(2),经过25 d的繁殖以及15 d的卵茧孵化后,观察其亲本存活率、产茧率、卵茧规格、卵茧的孵化率和孵化量等指标的变化。结果:不同基质对宽体金线蛭亲本存活率、产茧率、卵茧的孵化量有显著性影响(P<0.05),但对卵茧规格和卵茧的孵化率无显著性影响(P>0.05),其中基质D组亲本存活率(100.00%)和产茧率(3.70枚/尾)最高,基质B组卵茧的孵化量(32.2尾)最高。不同亲本密度对宽体金线蛭亲本存活率、产茧率有显著性影响,但对卵茧规格无显著性影响,其中,亲本密度30、60尾/m^(2)时,亲本存活率、产茧率最高(P<0.05)。结论:土壤与稻草(体积1∶1)混合基质是宽体金线蛭最适合的繁殖基质,稻草是其卵茧最适合的孵化基质。从经济效益角度考虑,宽体金线蛭亲本放养密度应以60尾/m^(2)较为适宜其人工繁殖。     

低分子量灰树花多糖的分离、纯化和抗肿瘤活性

目的：从灰树花菌丝体中分离纯化低分子量多糖并进行结构鉴定和抗肿瘤活性检测．方法：采用大孔吸附树脂和离子交换纤维素进行分离，SephadexG200柱层析纯化，HPGFC测定分子量，紫外光谱、红外光谱、薄层色谱和高效液相色谱和气相色谱等进行纯度和结构鉴定．用荷瘤小鼠检测抗肿瘤活性．结果：得到大、小两种多糖组分，其中低分子量多糖为白色粉末状，分子量约为2600，单糖组成为D-葡萄糖，含α—1，3，α-1，6，α-1，4-糖苷键，对S180肉瘤、EAC腹水瘤、Heps实体瘤都有明显抑制作用。结论：分离得到一种灰树花菌丝体多糖，为低分子量的α-葡聚糖，初步药效试验表明其具有抗肿瘤作用。     

蚂蝗及其混淆品菲牛蛭的高效毛细管电泳法鉴别

目的 探求更为快捷、准确的水蛭药材的鉴定方法.方法 采用高效毛细管电泳法对蚂蝗和混淆品菲牛蛭进行蛋白多肽的分析.条件为石英毛细管 (75 μm×57 cm ),电解缓冲液为20 mmol/L,硼酸盐溶液(pH 8.5),电压为20KV,检测波长254 nm.结果 蚂蝗与菲牛蛭的高效毛细管电泳图谱之间有明显差异,重复性良好.结论 高效毛细管电泳可作为鉴定方法,用于快速准确地鉴别蚂蝗与菲牛蛭.     

蚂蟥出冬眠模式的研究

采用石蜡切片和常规染色方法研究正常、冬眠及不同复温模式下蚂蟥消化道组织形态结构,同时采用生物学观测法、3,5-二硝基水杨酸比色法、对-棕榈酸硝基苯酯(p-NPP)比色法和福林-酚法观测和测定不同复温模式和投喂方式对蚂蟥出冬眠活动状态、消化道淀粉酶、脂肪酶和蛋白酶活性的影响,筛选适宜蚂蟥的出冬眠模式。结果表明:随着处理时间延长和温度升高,蚂蟥活跃程度增强,除直接复温投喂组在复温24,48 h有死亡外,其余方式均未出现死亡现象。与常温养殖相比,蚂蟥冬眠期间消化道结构松散,黏膜层褶皱稀疏,直接复温48 h、梯度复温15℃(第5天)前,组织结构无明显恢复;直接复温72 h、梯度复温20℃(第8天)后黏膜层褶皱增多、肌层增厚,已基本恢复至正常水平。各处理组消化酶活性随着处理时间延长呈上升趋势,且投喂组比非投喂组恢复较快,其中投喂组直接复温模式48 h、梯度复温20℃后,基本达到25℃正常养殖水平,并显著高于非投喂组活性(P<0.05)。直接复温和梯度复温都可应用于蚂蟥人工出冬眠处理,梯度复温模式按照2℃·d^-1的速度复温至15℃或20℃后投喂或直接复温模式复温72 h后投喂能减少蚂蟥出眠时死亡,有效提高蚂蟥人工养殖的经济效益。     

水蛭抗凝血活性成分的研究

目的：研究水蛭的抗凝血成分。方法：以血浆复钙时间为指标，应用Sephadex DEAE A-50阴离子交换树脂色谱、Sephadex G-25和Sephadex LH-20凝胶过滤色谱及反相高压液相色谱技术分离纯化。结果：得到3个抗凝血活性多肽，其中化合物1，2在自然条件下互相转化，它们的相对分子质量分别为7 100和5 531；采用HPLC及SDS-PAGE鉴定了化合物3的纯度，采用MALDI-TOF-MS法测定出其相对分子质量为8 608，并测定了其氨基酸组成。结论：推测化合物3为首次分离得到的抗凝血多肽，命名为蚂蟥多肽(whitmanin)。     

恒温越冬对蚂蟥生长及性腺发育的影响

为了探究恒温越冬对蚂蟥生长、性腺发育及内在品质的影响。将越冬期蚂蟥置于21℃的光照培养箱,以自然越冬蚂蟥为对照,越冬结束后测定蚂蟥的体质量、性腺质量及内在品质,石蜡切片观察蚂蟥精卵巢组织形态。结果表明,与自然越冬组相比,恒温越冬蚂蟥体质量是其2.35倍,雌雄性腺质量分别增加11.54%,48.33%,卵巢囊泡内卵黄期细胞和胶膜形成期细胞以及精巢囊腔内精原细胞和初级精母细胞均显著增加,抗凝血酶活性增加27.85%。综上,恒温能促进越冬蚂蟥生长、精卵细胞发育,提高抗凝血酶活性。     

蚂蟥蛋白激酶C基因的克隆和表达分析

蛋白激酶C(PKC)是一类广泛参与细胞增殖和发育的蛋白激酶,但在雌雄同体动物蚂蟥性腺中的发育机制尚不清楚.为探究蛋白激酶C在蚂蟥生殖细胞的发育过程中的作用,该研究克隆蚂蟥PKC基因,进行生物信息学分析,采用荧光定量PCR技术进行雌雄性腺的表达分析.结果 表明:①克隆得到的Wp-PKC全长2 580 bp,相对分子质量7...     

黄芪对蚂蟥生长和免疫及相关基因表达的影响

为了研究黄芪对蚂蟥生长和免疫影响及作用机制,在蚂蟥养殖水中添加黄芪,使养殖水中黄芪质量分数分别为0,0.01%,0.03%,0.05%,0.07%,0.09%。养殖60 d后测定生长性能、消化酶和抗逆酶活性、内在品质以及生长激素(growth hormone,GH)、胰岛素样生长因子-1(insulin like growth factor,IGF-1)和消化酶相关基因相对表达量;同时观察和统计热应激对蚂蟥生存状况的影响,测定热激蛋白HSP70和免疫相关基因相对表达量。结果表明:黄芪组最终体质量、增重率和特定生长率、消化酶和抗逆酶活性以及GH,IGF-1和消化酶相关基因相对表达量均高于空白组,且随浓度的增加呈先升后降趋势,其中0.05%组显著高于其他组别(P<0.05);黄芪组与空白组蚂蟥内在品质无显著性差异。蚂蟥存活率与热应激处理时间呈负相关;随着热应激处理时间的延长,蚂蟥HSP70和免疫相关基因相对表达量呈先升高后降低趋势,热应激24 h时最高;黄芪组存活率、HSP70和免疫相关基因相对表达量均高于空白组,其中0.05%组显著高于其他组别(P<0.05)。综上,黄芪能提高蚂蟥消化酶、抗逆酶活性及相关基因的表达,促进蚂蟥生长、提高免疫能力、增加其抗热应激能力。建议在蚂蟥实际生产中添加0.05%黄芪以提高养殖效益。