黄芪多糖对肌源性干细胞Wnt信号相关基因表达的影响

目的 探讨黄芪多糖干预的肌源性干细胞Wnt/β-catenin信号通路的相关基因表达的变化。方法 将经混合酶消化法、多次差速贴壁法分离纯化的MDSCs随机分为6组,进行实验干预,即空白对照组、APS组、Wnt激动剂组、APS+Wnt激动剂组、Wnt抑制剂组及APS+Wnt抑制剂组。Realtime PCR检测MDSCs Wnt信号通路上下游节点基因Wnt3、β-catenin及MDSCs增殖分化相关基因CyclinD1、c-myc、CD34mRNA的表达变化。结果 流式细胞仪检测结果表明MDSCs CD34、Sca-1阳性。倒置显微镜下观察,APS组、Wnt激动剂组、APS+Wnt激动剂组MDSCs较空白对照组生长密集,APS+Wnt激动剂组聚团明显,Wnt抑制剂组MDSCs增殖明显受到抑制。PCR检测结果显示:APS+激动剂干预组的Wnt信号通路各节点基因表达水平最高,Wnt激动剂组与APS组其次,空白对照组最低。结论 在黄芪多糖的干预作用下,持续激活Wnt信号通路能够促进MDSCs的增殖分化。     

基于Notch4和Delta4研究当归补血汤协同肌源性干细胞移植促造血重建的作用

目的:基于Notch4和Delta4探讨当归补血汤(Danggui Buxue Decoction,DBD)协同肌源性干细胞(Musclederived stem cells,MDSCs)向造血方向调控的作用机制。方法:将雌性昆明小鼠随机分成6组,分别为照射模型组、骨髓移植组、MDSCs移植组、等效剂量DBD预处理+MDSCs组(给药1组)、3倍DBD预处理+MDSCs组(给药2组)和5倍DBD预处理+MDSCs移植组(给药3组)。照射前各组分别给予生理盐水和不同剂量DBD灌胃1周,经8Gy~(137)Cs-γ射线照射后,尾静脉分别移植骨髓细胞和MDSCs。用real-time PCR检测3周末时小鼠骨髓中CD34、Notch4和Delta4 mRNA表达量。结果:与照射模型组比,干预组中CD34 mRNA上调(P0.05),且以给药3组上调幅度最大;Notch4 mRNA下调(P0.05),且给药1组下调幅度最大;除骨髓移植组外,其余各组Delta4 mRNA均上调(P0.05),且给药3组上调幅度最大。结论:当归补血汤协同肌源性干细胞移植能促进受照射小鼠造血重建,且5倍当归补血汤协同MDSCs移植效果最佳。Notch4和Delta4在骨髓造血干细胞移植和MDSCs移植中的作用不同,其促进骨髓造血干细胞、MDSCs向造血细胞分化的具体调控机制尚待深入探索。     

Notch2、Notch3、Jagged2和Hes3在当归补血汤协同肌源性干细胞移植鼠骨髓中的表达和作用

目的探讨Notch2、Notch3、Jagged2和Hes3在当归补血汤(Danggui Buxue Decoction,DBD)协同肌源性干细胞(Muscle-derived stem cells,MDSCs)移植小鼠骨髓中的表达和作用。方法将雌性昆明小鼠随机分为6组:照射模型组、骨髓移植组、MDSCs移植组和当归补血汤不同剂量(1、3和5倍)预处理+MDSCs移植组。各组分别给予生理盐水和不同剂量DBD灌胃1周后,经8Gy~(137)Cs-γ射线照射,尾静脉分别移植骨髓细胞和MDSCs。用Real-time PCR分别检测3周和8周末时小鼠骨髓中Notch2、Notch3、Jagged2和Hes3 mRNA表达量。结果 3周末,骨髓移植组和MDSCs移植组Notch2mRNA上调,给药组下调,组间比较无统计学差异(P0.05)。Notch3 mRNA均下调(P0.05),且给药2组下调幅度最大;8周末,除MDSCs移植组外,其余各组Notch2 mRNA均下调(P0.05),且以给药2组下调幅度最大。各干预组Notch3 mRNA均下调(P0.05),其中骨髓移植组下调幅度最小;Jagged2和Hes3 mRNA均未见表达。结论 Jagged2配体和Hes3靶基因既不参与造血干细胞向造血前体细胞分化过程,也不参与MDSCs向造血干细胞分化、增殖过程。而Notch2受体和Notch3受体在这些过程中扮演不同的角色。在造血重建后期,5倍当归补血汤可通过上调Notch2和Notch3表达来促进淋巴细胞的发育。     

祛痰化瘀利湿方对人滑膜细胞Wnt/β-catenin信号通路β-catenin、Cyclin D1、MMP-7的调控作用

目的观察祛痰化瘀利湿方对人滑膜细胞Wnt/β-catenin信号通路的调控作用。方法将GSK-3β选择性小分子抑制剂作用于正常人滑膜细胞,以激活Wnt/β-catenin信号通路。提取并检测胞核蛋白β-catenin的表达,从而确定最佳激活时间点。将对数生长期的滑膜细胞分为正常组、SB-216763激活组、祛痰化瘀利湿方组,分别采取相应的干预措施。Western blot方法检测滑膜细胞胞核蛋白β-catenin及其下游基因Cyclin D1和MMP-7的表达,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测滑膜细胞培养上清液中Cyclin D1和MMP-7的表达。结果成功激活正常人滑膜细胞Wnt/β-catenin信号通路,SB-216763干预后激活组胞核蛋白β-catenin及其下游基因Cyclin D1和MMP-7表达较正常组显著升高(P0.05);经中药含药血清干预后,祛痰化瘀利湿方组胞核蛋白β-catenin及其下游基因Cyclin D1和MMP-7表达与激活组相比显著下调(P0.01)。结论印证了GSK-3β作为选择性小分子抑制剂能够激活人滑膜细胞Wnt/β-catenin信号通路;通路激活后,其下游基因Cyclin D1和MMP-7的表达显著升高;祛痰化瘀利湿方能够明显下调β-catenin、Cyclin D1、MMP-7的表达;提示从单一信号通路方面可阐释祛痰化瘀利湿方治疗骨性关节炎的分子作用机制。     

雷公藤甲素通过PTEN表达调控Wnt/β-catenin通路抑制黑色素瘤的机制研究

目的:探讨雷公藤甲素的抗黑色素瘤作用是否与PTEN表达及Wnt/β-catenin通路相关。方法:实验分为5组:空白对照组、雷公藤甲素(20 nmol/L)组、β-catenin抑制剂(5μmol/L IWR-1-endo)组、雷公藤甲素+β-catenin抑制剂组、ATRA(100μmol/L)组。分别采用CCK8法、Annexin V-FITC/PI双染色法、实时定量PCR法和Western blot法检测各组A375细胞活力、凋亡率及PTEN、β-catenin、Bcl-2、Caspase-3、PCNA mRNA及蛋白的表达。结果:雷公藤甲素、β-catenin抑制剂和ARTA处理能抑制A375细胞的增殖并诱导其凋亡,在增强Caspase-3和PTEN表达的同时抑制β-catenin、Bcl-2、PCNA的表达。结论:雷公藤甲素能抑制黑色素瘤细胞A375的增殖并诱导其凋亡,该作用可能是通过增加PTEN的表达进而抑制Wnt/β-catenin通路的激活来实现。     

毛冬青甲素促进骨髓间充质干细胞迁移的实验研究

目的观察毛冬青甲素（ilexonin A, IA）干预大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）后基质细胞衍生因子（SDF-1）特异性受体CXCR4和Wnt通路中β-连环蛋白（β-catenin）、糖原合成激酶（GSK-3β）的表达情况,探讨IA预处理促进BMSCs体外迁移的分子机制。方法采用全骨髓贴壁法体外分离、培养、纯化大鼠并行BMSCs鉴定。将BMSCs分为对照组、Wnt3a组、IA组、IA + Wnt3a组、IA + Dkk1组、Dkk1组。以Wnt 信号通路的激动剂Wnt3a、抑制剂Dkk1干预,Western blot法观察β-catenin、GSK-3β与CXCR4的表达关系。结果与对照组比较,Wnt3a组、IA组CXCR4、β-catenin蛋白表达显著增强、GSK-3β蛋白表达显著减弱;（P<0.05）,Dkk1组CXCR4、β-catenin蛋白表达显著减弱（P<0.05）;与Wnt3a组、IA组分别比较,IA+Wnt3a组CXCR4蛋白显著增强,GSK-3β蛋白表达显著减弱（P<0.05）;与Dkk1组比较,IA+Dkk1组CXCR4、β-catenin蛋白表达显著增强,GSK-3β蛋白表达显著减弱（P<0.05）;与IA组比较,IA+Dkk1组β-catenin的表达显著减弱,GSK-3β蛋白表达显著增强（P<0.05）。结论IA上调CXCR4 的表达,可能与 BMSCs 的Wnt/β-catenin信号通路激活有关,发挥其促迁移的作用。     

扶正补血食疗方含药血清干预Notch通路调控骨髓造血干细胞化疗后损伤的机制研究

目的:通过扶正补血食疗方含药血清干预5-FU损伤小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)和造血干细胞(HSCs)体外共培养模型,探讨补血食疗方对化疗后模拟"造血龛"中小鼠HSCs增殖、凋亡以及Notch信号通路的影响.方法:建立小鼠BMSCs和HSCs的共培养模型.共培养细胞随机分为空白组、5-FU组和扶正补血食疗方含药血清...     

竹节参皂苷Ⅳa对高脂饮食小鼠小肠干细胞及其微环境Wnt/β-catenin信号通路的影响

目的:探讨竹节参皂苷Ⅳa对高脂饮食小鼠小肠干细胞及其微环境Wnt/β-catenin信号通路的影响。方法:C57BL小鼠雌雄各半随机分成4组,每组10只,即正常对照组、模型组及竹节参皂苷Ⅳa低、高剂量组。HE染色观察小肠形态学变化,免疫组化检测各组小肠干细胞数量、PCNA表达及其微环境Wnt/β-catenin信号通路的变化。结果:与正常对照组比较,模型组小肠绒毛长度、V/C值、PCNA表达量及杯状细胞数量、Bmi1阳性表达的小肠干细胞数量显著升高,小肠干细胞微环境Wnt/β-catenin信号显著上调(P0.05或P0.01)。与模型组比较,竹节参皂苷Ⅳa组绒毛长度、V/C值、PCNA表达量、杯状细胞数量、Bmi1阳性表达的小肠干细胞数量显著降低,小肠干细胞微环境Wnt/β-catenin信号显著下调(P0.05或P0.01)。结论:竹节参皂苷Ⅳa可通过Wnt/β-catenin信号通路调控小肠干细胞微环境,改善其过度增殖分化状态和抑制小肠干细胞增多,调节小肠干细胞功能。     

十四酸甾醇酯调控Wnt/β-catenin信号通路促皮肤创面修复的研究

目的探讨十四酸甾醇酯(cholesterol myristate)对大鼠皮肤创面修复过程中Wnt/β-catenin通路的调控。方法十四酸甾醇酯作用于大鼠触须部皮肤创面,观察皮肤创面的修复情况,免疫荧光检测皮肤组织中Wnt/β-catenin通路蛋白的表达;体外分离培养SD乳鼠毛囊干细胞(Hair Follicle Stem Cells,HFSCs),免疫荧光检测细胞表面标志物CD34、CK15的表达,CCK-8法检测十四酸甾醇酯对HFSCs增殖的影响,RT-q PCR、Western-blot检测其对HFSCs中Wnt/β-catenin通路相关蛋白的表达。结果术后7 d,十四酸甾醇酯组创面基本愈合,表皮细胞排列紧密,表皮与真皮层连接牢固,可见新生毛细血管;对照组表皮与真皮连接不牢固,表皮排列不规则,仍有炎症浸润。术后4 d,免疫荧光检测十四酸甾醇酯组修复皮肤中β-catenin、Lymphoid enhancing factor 1(LEF1)、cancer-myc(c-myc)、cyclin D1的表达均强于对照组。所培养的细胞表达HFSCs标志物CD34、CK15,十四酸甾醇酯对HFSCs有促增殖作用(P0.01),且β-catenin、LEF1、c-myc、cyclin D1表达上调。结论十四酸甾醇酯通过激活HFSCs中的Wnt/β-catenin通路促皮肤修复。     

双黄升白颗粒对荷瘤鼠化疗骨髓抑制期Wnt信号通路的调控作用

目的探讨双黄升白颗粒对荷瘤鼠化疗骨髓抑制期Wnt信号通路的调控作用。方法采用Lewis肺癌荷瘤鼠腹腔注射环磷酰(cyclophosphamide,CTX)胺造成化疗骨髓抑制模型,用双黄升白颗粒干预治疗,常规计数白细胞、红细胞、血小板数量和肿瘤质量,流式细胞法检测骨髓造血干细胞比例(Sca、CD34双阳性细胞),实时荧光定量PCR(FQ-PCR)法检测Wnt信号通路主要基因(Wnt、β-catenin、Frizzted、DSH、GSK3)mRNA的表达。结果治疗组白细胞数量、造血干细胞比例均高于模型组(P0.05),Wnt、β-catenin、Frizzted、DSH、GSK3 mRNA在骨髓中的表达高于模型组(P0.05),Wnt、β-catenin、Frizzted、DSH mRNA在肿瘤中的表达则低于模型组(P0.05);各组红细胞、血小板、肿瘤质量、GSK3 mRNA在肿瘤中的表达差异无统计学意义(P0.05)。结论双黄升白颗粒治疗骨髓抑制的作用机制与调控Wnt信号通路有关,且该调控作用具有双重特性,即在上调骨髓Wnt信号通路主要基因表达同时抑制肿瘤中部分基因表达。