幽门螺杆菌Cag-PAI hp0523基因的克隆及功能预测

目的:明确幽门螺杆菌Cag-PAI hp0523基因的功能,探讨其在幽门螺杆菌致病中的作用.方法:设计引物,以幽门螺杆菌NCTC11637为模板,采用聚合酶链反应(PCR)扩增获得目的片段;将其进行T-A克隆后,进行测序.将该基因序列与其他菌株做BLAST比对分析,并结合生物信息学数据库和软件,分析其序列特征和理化特性.结果:经酶切,测序分析表明,插入的基因片断为510 bp,与基因库公布的幽门螺杆菌 26695及J99序列相比较,同源性高达 94%;软件预测其编码的蛋白为169个氨基酸,其相对分子质量约为19.7 kDa,等电点约为9.53;基序分析表明,在33～165位氨基酸之间存在一个保守的SLT催化基序,可能是溶菌糖基转移酶;对其催化能力进行预测,结果表明,HP0523(33.7%)催化能力可能较T4溶菌酶(32.3%)和溶菌酶SLT70(28.6%)的活性高.结论:成功克隆了幽门螺杆菌Cag-PAI的hp0523基因,对其序列进行了深入分析,为进一步研究其功能,阐明幽门螺杆菌Cag-PAI的致病机制奠定了基础.     

肝螺杆菌MCSTP的基因克隆及生物信息学分析

目的 克隆肝螺杆菌(H.hepatieus)基基团接受趋化信号转导蛋白(MCSTP)全基因,并应用生物信息学方法对其进行分析.方法 以肝螺杆菌全基因组作为模板,设计肝螺杆菌MCSTP c1977特异性引物,利用PCR方法扩增目的 基因片段,连接至原核表达载体pET22b(+).从而构建原核表达质料pET22b+/MCSTP并测序鉴定.廊用牛物信息学方法分析MCSTP基囚的序列同源性及其结构特征.结果 克隆的MCSTP基因经测序可知与GenBank公布的肝螺杆菌标准株ATCC51449序列一致性达99%,仅第1 160 bp处由A变为T.利用生物信息学方法进行分析可发现此基因与空肠弯曲杆菌、幽门螺杆菌具有非常低的相似性,表明其在微生物界巾具有一定的特异性.结论 成功构建pET22b+/MCSTP重组质粒,并通过生物信息学技术进行序列及结构分析,为进一步研究其生物学功能及致病机制提供了线索和依据.     

幽门螺杆菌4种黏附素基因保守区的克隆、序列及其生物信息学分析

目的克隆幽门螺杆菌(Helicobacterpylori, Hp)4种黏附素(BabA、AlpA、AlpB和HopZ)的保守区,并对其进行序列及生物信息学分析,为研究Hp黏附素的分子机制和免疫原性提供实验基础。方法利用ANTHEPROT V4.3c 软件分析已证实的Hp4种黏附素蛋白序列,发现共同保守区(命名为CB),推导出其DNA序列,设计CB特异引物,将PCR产物定向插入pET-22b(+)载体,构建保守区的重组克隆。DNA自动分析仪进行序列测定,生物信息学软件对其生物学特性进行分析。结果构建了4种黏附素共同保守区的重组质粒,测序显示CB基因长588 bp,该基因编码195个氨基酸,与4种黏附素保守区的同源性均达50%以上,ANTHEPROT V4.3c软件预测其蛋白质相对分子质量约为22 500,并显示出了良好的抗原性和疏水性。BLAST分析了836 767个序列,与其同源性达40%的均为Hp序列。结论Hp4种黏附素存在同源性接近的保守区,表明其黏附作用可能有相似的分子基础,生物信息学分析表明其具有优良的免疫原性和严格的种属特异性。     

幽门螺杆菌适应性定植相关基因HP0318的克隆及序列分析

目的 测定幽门螺杆菌(HP)适应性定植蒙古沙鼠前后HP0318基因序列并分析其序列差异, 以了解该基因在HP适应性定植过程中在基因水平是否发生了改变,为进一步研究HP的适应性变异机制提供实验依据.方法 对幽门螺杆菌临床分离株M0、沙鼠适应株M13及标准株NCTC11637基因组中的HP0318全长基因进行扩增,然后连接到PMD18-T载体进行测序,最后通过DNAsis软件对不同菌株来源的HP0318基因进行多重序列比对,并与Genbank公布的2个标准株(HP26695株和J99株)的HP0318序列进行对比分析.结果 PCR法成功扩增出了3个菌株的HP0318基因片段,克隆到PMD18-T载体上酶切鉴定正确.测序结果表明3株幽门螺杆菌(M0、 M13、11637)的HP0318序列大小均为756bp.序列分析显示在不同来源的HP菌株中表现出较高的保守性,最低相似性达到94%.结论 HP0318基因属于HP特异性基因,HP在沙鼠中适应性定植可能并不是由HP0318基因水平的变异引起,有必要进一步实验验证其功能和阐明其所具有的调控机制.     

幽门螺杆菌γ-谷氨酰转肽酶基因的克隆及序列分析

目的:克隆不同疾病来源的幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, Hp)γ-谷氨酰转肽酶(Gamma-glutamyltranspeptidase,GGT)基因,并进行序列分析.方法:从人胃黏膜组织中分离培养获得Hp,提取其基因组DNA,对GGT基因进行 PCR扩增,克隆进 pMD18-T 载体,进行测序和生物信息学分析,并与基因库中公布的标准株26695和J99的GGT氨基酸序列进行比对分析.结果:成功克隆了分别来源于慢性胃炎,胃溃疡,十二指肠溃疡和胃癌的4种Hp菌株GGT片段,并进行了序列分析.4种病源的Hp GGT序列大小均为1 704 bp,编码 567 个氨基酸,理论分子质量是61 kDa,等电点是9.3,在N端具有信号肽,含有ATP蛋白激酶结合结构域和γ-谷氨酰转肽酶保守结构域.序列比对分析显示,不同来源的Hp菌株GGT具有很高的保守性.结论:GGT在Hp中高度保守,具有分泌作用,可能对宿主细胞产生影响.该基因的成功克隆为进一步研究其功能打下了基础.     

幽门螺杆菌儿童分离株中性粒细胞激活蛋白克隆及表达序列

目的：从幽门螺杆菌临床儿童分离株GZCH1基因组扩增中性粒细胞激活蛋白（NAP）基因,克隆入T载体,并亚克隆入表达载体pGEX-4T-1,进行测序及基因比对分析,为幽门螺杆菌疫苗研制奠定基础.方法：根据GenBank中幽门螺杆菌NAP序列,设计一对特异性引物扩增幽门螺杆菌临床儿童分离株NAP全长基因,与T载体连接,转化大肠杆菌DH5α,提取质粒进行酶切、测序鉴定,经EcoR Ⅰ、Not Ⅰ双酶切后与做相应酶切的pGEX-4T-1连接,转化大肠杆菌BL21,提取质粒进行双酶切鉴定,IPTG诱导重组蛋白表达,并对基因进行测序及比对分析.结果：以幽门螺杆菌儿童分离株GZCH1为模板,成功扩增了NAP基因,基因大小为435 bp,重组pGEX-4T-1-NAP双酶切鉴定可见目的片段,测序结果显示NAP在正确读框中,序列比对分析显示其与幽门螺杆菌J99株氨基酸一致性达99.2％,IPTG诱导后,pGEX4T-1-NAP/BL21在相应分子量（42.8 kD）可见融合蛋白的表达.幽门螺杆菌儿童分离株GZCH1 NAP序列已登录GenBank（登录号：GU301881）.结论：从幽门螺杆菌临床儿童分离株GZCH1中成功克隆了NAP基因,并获得重组蛋白的表达,为NAP幽门螺杆菌疫苗研制奠定了良好的基础.     

幽门螺杆菌基因hp0231和hp0410的克隆表达及生物信息学分析

目的获取幽门螺杆菌hp0231和hp0410基因的序列,预测其编码蛋白HP0231和HP0410作为候选疫苗的可行性,在大肠杆菌表达系统中表达hp0231和hp0410。方法提取幽门螺杆菌标准株NCTC11639的基因组DNA,按照GenBank中幽门螺杆菌标准株22695的序列设计引物PCR,扩增hp0231和hp0410基因,克隆入pMD18-T载体中测序,进行生物信息学分析。将hp0231和hp0410克隆入表达载体pGEX-4T-1中,诱导表达,SDS-PAGE电泳鉴定。结果生物信息学分析表明HP0231和HP0410均为外膜蛋白,具良好的抗原性,并且与其他生物的同源性较低,其作为Hp疫苗不易产生交叉反应以及自身免疫性反应,构建的重组菌可高水平表达可溶性重组蛋白。结论HP0231和HP0410是有良好应用前景的Hp候选疫苗。     

幽门螺杆菌4种黏附素基因保守区的克隆、序列及其生物信息学分析

目的：克隆幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，Hp）4种黏附素（BabA、AlpA、AlpB和HopZ）的保守区，并对其进行序列及生物信息学分析，为研究Hp黏附素的分子机制和免疫原性提供实验基础。方法：利用ANTHEPROTV4.3c软件分析已证实的Hp4种黏附素蛋白序列，发现共同保守区（命名为CB），推导出其DNA序列，设计CB特异引物，将PCR产物定向插入pET-22b（ ）载体，构建保守区的重组克隆。DNA自动分析仪进行序列测定，生物信息学软件对其生物学特性进行分析。结果：构建了4种黏附素共同保守区的重组质粒，测序显示CB基因长588bp，该基因编码195个氨基酸，与4种黏附素保守区的同源性均达50％以上，ANTHEPROTV4.3软件预测其蛋白质相对分子质量约为22500，并显示出了良好的抗原性和疏水性。BLAST分析了836767个序列，与其同源性达40％的均为Hp序列。结论：Hp4种黏附素存在同源怀接近的保守区，表明其黏附作用可能有相似的分子基础，生物信息学分析表明其具有优良的免疫原性和严格的种属特异性。     

幽门螺杆菌Ⅳ型分泌系统cagX基因的克隆及生物信息学特征预测

目的:构建表达幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H. pylori)NCTC 11637 IV型分泌系统cagX(HP0528)全长编码基因的原核表达载体。方法:用PCR方法从H.pylori基因组DNA中扩增cagX编码基因片段,将cagX克隆至pGEM-T载体,转化大肠杆菌DH5α,再将其定向插入pET32a( )载体中,经IPTG诱导表达。SDS-PAGE分析表达结果,并进行序列测定和生物信息学预测。结果:克隆幽门螺杆菌NCTC 11637cagX基因全长1569 bp(基因库登录号为EF608160),编码522个氨基酸,融合蛋白的相对分子质量约为80.5 kD。与基因库公布的其他H. pylori菌株基因序列的核苷酸同源性为96%~99%。预测结果显示H. pylori11637,26695,J99间二级结构有一定差异,但抗原性相同。结论:成功克隆并表达了H. pyloriNCTC 11637cagX基因,并对其生物学特征进行了预测,为进一步研究其生物学功能奠定了基础。     

乳糖酶基因的克隆及生物信息学分析

目的：克隆并分析保加利亚德氏乳杆菌中的乳糖酶基因。方法：利用PCR技术从保加利亚德氏乳杆菌中克隆出乳糖酶基因、测序并生物信息学分析。结果：成功的从保加利亚德氏乳杆菌中克隆出全长为3024bp的乳糖酶基因,利用生物软件分析,推测乳糖酶基因共编码1008个氨基酸,蛋白分子量为114KDa,等电点为4．9,氨基酸序列中共有9处潜在的糖基化位点。并将此基因与不同来源的乳糖酶基因进行同源性比较。结论：成功的克隆出乳糖酶基因,并利用生物分析软件对其进行生物信息学分析。了解该酶的性质特征,为进一步研究及低成本表达该酶奠定基础。     

布鲁氏菌猪种标准株外膜蛋白OMP25的原核表达

目的克隆布鲁氏菌外膜蛋白Omp25基因并构建基因的原核表达系统。方法用聚合酶链反应技术扩增得到布鲁氏菌基因组，得Omp25基因片段，T—A克隆后测定核苷酸序列，将目的基因定向插入原核表达载体pGEX-4T-1，经双酶切和DNA测序测定，将构建的重组质粒转化大肠杆菌（E．coli HB101，TOP10），经IPTG诱导后，用SDS—PAGE检测重组蛋白rOrap25表达情况。结果经DNA测序显示Omp25DNA序列和插入位点正确，成功构建了重组质粒DGEX-4T-1-Omp25，经IPTG诱导，特异性表达出以包涵体形式存在48kDa的Omp25融合蛋白。结论制备、克隆了布鲁氏菌外膜蛋白Omp25基因片段，并在大肠杆菌中表达出Omp25融合蛋白。     

幽门螺杆菌外膜蛋白的基因克隆及表达

目的：克隆及表达幽门螺杆菌（Hp)相对分子质量为18000的外膜蛋白基因,为Hp的疫苗开发,快速诊断试剂盒的研究奠定基础。方法：用PCR从Hp染色体DNA扩增该外膜蛋白的基因片段,将目的基因,pQE30质粒同时分别经限制性内切酶BamHⅠ,HindⅢ酶切,纯化,连接,转染,筛选以及表达含插入片段的重组载体。结果;经酶切,测序分析插入的基因片段为表达Hp相对分子质量为18000外膜蛋白基因,与文献相比：有2％碱基发生变异,以1．68％氨基酸残基改变,同源性可达到98％以上,SDS－PAGE显示;表达产物相对分子质量为18000,可溶性表达占全菌的18％以上;ELISA法显示：该蛋白可被Hp全菌抗血清识别。结论：Hp外膜蛋白基因克隆表达产物具有良好的抗原性,将有可能成为一种有效蛋白质疫苗以及快速诊断试剂盒用于Hp感染的防治和检测。     

羊布鲁氏菌omp25基因原核表达载体的构建与鉴定

目的:利用PCR反应从羊布鲁氏菌基因组DNA中克隆omp25基因,并将其构建到原核表达载体pET-32a中。方法:试剂盒法提取羊布鲁氏菌基因组DNA,设计合适的引物,通过PCR反应从基因组中扩增外膜蛋白OMP25的编码基因(omp25)。将得到的基因片段连接到克隆载体pMD19-T的多克隆位点(MCS)中,将连接体pMD19-T-omp25转化感受态大肠杆菌DH5(并进行筛选和克隆扩增,提取质粒并进行酶切分析与序列测定。利用酶切与连接反应将目的基因(omp25)插入载体pET-32a的多克隆位点中,将连接体pET-32a-omp25转化感受态大肠杆菌DH5(并进行筛选和克隆扩增,提取质粒并进行酶切分析。结果:PCR扩增得到的基因片段与GenBank中已公布的羊布鲁氏菌omp25基因同源性为99%。酶切分析结果表明,omp25基因成功地插入载体pET-32a中。结论:成功地扩增得到了羊布鲁氏菌omp25基因并构建了携带该基因的重组原核表达载体pET-32a-omp25,为后续的研究提供了可靠的基础。     

肠出血性大肠杆菌O157:H7的紧密黏附素基因eae的测序及生物信息学分析

目的 克隆编码肠出血型大肠杆菌O157:H7的紧密黏附素eae基因,并对其进行测序及生物信息学分析,为研究EHEC与宿主细胞相互作用奠定基础.方法 利用PCR技术扩增eae基因,经过纯化,将其定向插入克隆载体PMD19-T simple vector并进行测序,应用生物信息学软件分析其生物学特性.结果 用PCR方法扩增eae基因,大小为2802 bp,编码934个氨基酸,用DNAstar5.0软件分析紧密黏附素(Intimin)蛋白的生物活性,在202～210、510～520、716～735个氨基酸残基的肽链上,显示该蛋白具有良好的亲水性,在175～220、300～315、550～610、710～780、825～880个氨基酸残基的肽链上具有良好的柔韧性,在220～300、615～710个氨基酸残基的肽链上,显示该蛋白具有良好的抗原性.结论 本研究用PCR法扩增出了O157:H7的eae基因,成功构建了肠出血性大肠杆菌O157:H7紧密黏附素eae基因的重组质粒,并分析了黏附素蛋白的亲水性、柔韧性、抗原性,为进一步研究大肠杆菌O157:H7黏附素的致病机制奠定了基础,为下一步表达出Intimin蛋白,进一步研究该蛋白与宿主细胞的粘附、免疫原性、抗原抗体反应提供了理论依据.     

结核分枝杆菌宁夏分离株MPT64基因的生物信息学分析

目的对结核分枝杆菌H37Rv(宁夏分离株NXT1024)MPT64基因进行生物信息学预测和分析,通过与结核杆菌标准株序列的比对,观察其变异情况。方法提取结核分枝杆菌H37Rv(宁夏分离株NXT1024)基因组,以该基因组为模板,采用聚合酶链反应(PCR),从中扩增出MPT64基因,并测序,测序结果利用DNA star软件初步预测出该蛋白的分子特征、抗原性和二级结构等生物信息学信息。结果 MPT64基因全长为687bp,BLAST结果显示基因序列与GeneBank公布的标准株的基因序列的核苷酸同源性为93.6%,对该序列编码蛋白质的构象测试发现,该MPT64编码蛋白含有多个β转角结构,及多个明显的具有抗原活性的结构域和免疫优势辅助性T淋巴细胞抗原位点。结论以结核分枝杆菌宁夏分离株为模板成功扩增MPT64基因,该株与标准株的核苷酸同源性为93.6%。通过生物信息学分析获得了该蛋白的蛋白构象、抗原活性的结构域及T细胞表位等相关的生物学信息特征。     

人幽门螺杆菌26 000外膜蛋白与热休克蛋白双价疫苗的构建和表达及抗原性研究

目的构建含人幽门螺杆菌(Hp)热休克蛋白A(HspA)和26 000外膜蛋白(OMP)编码基因的重组载体,进行核苷酸序列分析,并在大肠杆菌BL21中表达,研究其抗原性,为疫苗的开发奠定基础.方法利用分子克隆技术从Hp DNA染色体中,扩增HspA编码基因片段,将目的基因HspA与载体pET32a(+)经kpnⅠ、BamH I 双酶切后,进行连接、测序;同时将重组载体pET32a(+)/HspA和pET32a(+)/Omp26分别经Hind Ⅲ、BamH I 双酶切, 通过凝胶电泳回收pET32a(+)/HspA和26 000 OMP DNA片段,经T4连接酶将HspA和26 000 OMP编码基因通过酶切粘端进行连接,而后转化并筛选含有两种目的基因的重组载体,并在大肠杆菌BL21(DE30)中表达,表达产物经纯化后,以western 印迹法检测其抗原性.结果经酶切、测序分析表明,插入的基因片段为Hp HspA和26 000外膜蛋白编码基因,由951bp组成,与GenBank报道的相比较,有1.15%的bp发生变异,1.26%的氨基酸残基改变;经SDS-PAGE分析发现,融合基因表达的蛋白相对分子质量(Mr)为59×103 ,其中pET32a(+)表达的蛋白Mr约为20×103,可溶性表达产物占全菌总蛋白的19.96 %;重组蛋白经含Ni2+琼脂糖树脂纯化后,其纯度达95%以上;western 印迹法检测显示,该重组蛋白可被Hp阳性患者的血清及抗26 000 OMP单克隆抗体所识别,具有良好的抗原性.结论成功地克隆并融合表达了Hp HspA和26 000 OMP,为Hp蛋白质疫苗和核酸疫苗的研制和快速诊断试剂盒的研究奠定了良好的基础.     

幽门螺杆菌26kDa外膜蛋白的基因克隆

目的:构建幽门螺杆菌外膜蛋白的基因重组载体,为的疫苗开发、快速诊断试剂盒的研究奠定基础。26kDaHp方法:用从染色体基因组扩增外膜蛋白的基因片段,将目的基因、载体同时经PCRHpDNA 26kDa26kDapET32a( )Bam、HIHindⅢ双酶切、纯化;T4连接酶连接;转染大肠菌以及筛选含插入片段的重组载体。Top10结果:经酶切、测序分析插入的基因 片段为表达外膜蛋白基因,有发生变异,以及氨基酸残基改变。与文献相比:有高度的同源性。Hp26kDa1.1%bp1.51%结论:外膜蛋白的基因克隆、重组载体的构建将有可能为一种有效蛋白质疫苗的制备打下基础。 Hp     

人幽门螺杆菌UreB与Omp11双价疫苗载体的构建与鉴定

目的:构建含人幽门螺杆菌(H.pylori,Hp)郑州分离株MEL HP27 ureB-omp11融合基因的重组表达载体.方法:利用分子克隆技术,扩增Hp UreB、Omp11编码基因及融合基因ureB-omp11,将融合基因ureB-omp11与载体pET30a( )进行酶切、连接,然后转化并筛选含有目的基因的重组载体.结果:酶切、测序分析表明,插入的基因片段为Hp ureB-omp11融合基因,由2 280 bp组成.与GenBank报道的相比,核苷酸序列同源性为99.39%,氨基酸序列同源性为99.47%.结论:成功构建了MEL Hp27融合蛋白UreB-Omp11的双价疫苗重组载体,为Hp蛋白质疫苗和核酸疫苗的研制奠定了良好的基础.     

广州地区无偿献血人群HHV-8 DNA检测及部分基因的序列分析

目的了解广州地区无偿献血人群人类疱疹病毒8型(HHV-8)的感染情况。方法从全血标本中提取基因组DNA,用巢式聚合酶链反应检测HHV-8DNA开放读码框26基因(ORF26),对其中一阳性PCR产物用双脱氧链终止法进行核苷酸序列测定,测序结果用DNAstar软件分析。结果239例献血者标本中有2例(0.84%)扩增出一条约233bpDNA电泳带。经序列分析证实为HHV-8DNA片段。结论广州地区无偿献血者存在HHV-8感染,但感染率较低。     

人pcDNA3.1-TPX2真核表达载体的构建与表达

目的:构建TPX2的真核表达载体pcDNA3.1-TPX2,并观察其在食管癌EC9706细胞中的表达。方法:在pQE-70-TPX2原核表达载体基础上,根据GenBank上提供的TPX2基因序列及测序结果,采用Primer Premier 5.0软件设计扩增TPX2基因编码区的引物序列,经HindⅢ和BamHⅠ双酶切,与真核表达载体pcDNA3.1连接后转化感受态大肠杆菌JM109,并进行酶切分析和序列测定。将构建的质粒pcDNA3.1-TPX2体外转染EC9706细胞,进行稳定筛选。用Western blot鉴定基因的表达。结果:DNA测序和BLAST比对表明克隆的人TPX2基因序列正确,进一步酶切分析显示,成功构建了真核表达载体pcDNA3.1-TPX2,并在EC9706细胞中获得稳定表达。结论:TPX2基因真核表达载体的成功构建为后续研究TPX2基因在肿瘤细胞中的功能奠定了基础。