STAT3短发夹RNA表达载体的构建及对SiHa细胞增殖和凋亡的作用

目的:探讨信号转导子与转录激活子3短发夹RNA(shRNA)真核表达载体对宫颈癌SiHa细胞增殖和凋亡的作用.方法:根据siRNA设计原则, 结合pSilencer2.1-U6-neo质粒特点, 针对STAT3基因设计并合成两条寡聚DNA片段, 退火后克隆入pSilencer2.1-U6-neo质粒, 脂质体法将重组质粒转染人宫颈癌SiHa细胞.RT-PCR和Western blot检测SiHa细胞STAT3基因mRNA和蛋白表达水平;MTT法和流式细胞术(FCM)检测细胞的增殖和凋亡.结果:成功构建了STAT3基因shRNA真核表达载体, 转染人宫颈癌SiHa细胞.细胞STAT3蛋白及mRNA表达下降;同时SiHa细胞增殖能力下降, 细胞凋亡增加.结论:构建的STAT3基因shRNA真核表达载体能够通过下调STAT3基因表达, 抑制宫颈癌SiHa细胞的增殖能力, 诱导细胞凋亡.     

WT1异构体比例转变对人白血病细胞株HL-60增殖和凋亡的影响

 目的： 探讨WT1异构体比例改变对人白血病细胞株HL-60增殖和凋亡的影响。方法： 逆转录获得人WT1(17AA－/KTS－)异构体全长cDNA序列,连接到PCDH1-MCS1-EF1-copGFP慢病毒质粒载体上, 酶切和测序证实正确构建重组质粒,建立WT1异构体表达比例改变的单克隆细胞株。MTT法检测细胞增殖活性,形态学观察及Annexin V 检测细胞凋亡。结果： 成功构建了真核表达载体PCDH1-MCS1-EF1-copGFP-WT1(17AA－/KTS－),转染HL-60细胞后,实时荧光定量RT-PCR和Western blotting 显示重组质粒转染细胞中WT1(17AA－/KTS－) mRNA和蛋白水平明显高于空质粒转染组和正常对照组。重组质粒转染细胞的生长抑制率高于空质粒转染组和正常对照组, 差异显著(P<0.05)。加2 μmol/L 三氧化二砷（As2O3）培养48 h后, 形态学观察发现3组细胞都出现了凋亡形态, 但重组质粒转染细胞更为明显。流式细胞术结果显示,As2O3作用24 h后,重组质粒转染细胞凋亡率较空质粒转染组和正常对照组细胞升高,差异显著(P<0.05)。结论： 增加外源性WT1(17AA－/KTS－)异构体的表达能抑制HL-60细胞增殖,促进As2O3 诱导的细胞凋亡。     

Maspin在前列腺癌PC-3细胞生物学行为中的作用

目的: 探讨maspin影响前列腺癌细胞生物学行为的作用机制。方法: 设计并合成靶向maspin 基因的特异性shRNA, 构建靶向maspin 的shRNA慢病毒表达质粒并进行细胞转染。采用qRT-PCR和Western blotting法检测PC-3细胞转染重组质粒后maspin mRNA和蛋白质水平的变化以建立稳定转染maspin-shRNA的细胞系。采用qRT-PCR检测转染重组质粒对PC-3细胞中凋亡相关基因的影响。采用xCELLigence系统实时动态观察转染重组质粒前后细胞的生长并计算倍增时间,结合流式细胞术检测蛋白酶体抑制剂细胞毒性作用在细胞转染前后的变化。采用Western blotting法检测蛋白酶体抑制剂对核因子κB家族成员RelA和RelB表达的影响。结果: 成功构建靶向maspin的shRNA慢病毒表达质粒pLL3.7-siMaspin。利用慢病毒表达系统转染并通过极限稀释法得到单克隆转染细胞PC-3-siMaspin。PC-3-siMaspin细胞的倍增时间为26.83 h,而PC-3-control细胞为37.95 h。PC-3-siMaspin细胞中bcl-2和A20 mRNA表达水平上调;而bax和bim的表达水平下调。蛋白酶体抑制剂MG-132作用PC-3-control和PC-3-siMaspin细胞8 h后细胞死亡率分别为27.1%±5.6%和7.5%±2.3%,24 h为24.2%±3.7%和8.2%±2.5%,36 h为28.7%±3.7%和7.6%±2.5%。PC-3-control细胞在MG-132作用下RelA的表达逐渐下调,而PC-3-siMaspin细胞中RelA的表达无明显变化。结论: 在雄激素非依赖型前列腺癌细胞株PC-3中maspin呈高表达。Maspin表达沉默显著缩短了前列腺癌细胞的倍增时间,加快了细胞的生长与增殖。Maspin表达沉默显著下调了PC-3细胞对MG-132的敏感性,并与RelA降解的缺失相关。     

转染survivin反义mRNA对Jurkat淋巴瘤细胞生长和化疗敏感性的影响

目的 研究转染survivin反义mRNA对Jurkat淋巴瘤细胞生长的影响以及转染后淋巴瘤细胞对化疗药物的敏感性。方法 构建survivin反义mRNA真核表达质粒pcDNA3．1-反义（As）survivin;利用脂质体转染法将其转入高表达survivin mRNA T淋巴母细胞淋巴瘤Jurkat细胞系,用逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）、免疫组织化学SP法、Western印迹法检测细胞中survivin表达;用细胞计数、流式细胞术（FCM）检测其细胞生长曲线、细胞凋亡指数,并进行光镜、电镜形态学观察;并对转染pcDNA3．1-Assurvivin前后Jurkat细胞分别加入4-羟基-环磷酰胺（CTX）、甲氨蝶呤（MTX）72h后,常规MTT检测细胞存活率。结果 RT—PCR检测转染pcDNA3．1-Assurvivin后48h、5和6周Jurkat细胞survivin mRNA表达,发现survivin mRNA表达皆低于对照组;转染后survivin蛋白表达也明显降低。转染pcDNA3．1-Assurvivin后Jurkat细胞生长倍增时间（52h）明显延长;用FCM检测细胞凋亡发现,转染pcDNA3．1-Assurvivin后Jurkat细胞凋亡指数[20．2％（48h）]明显高于对照组（转染空质粒和未转染组,2．1％和1．3％）;5和6周为6．2％和6．8％,明显高于未转染细胞（1．3％和1．0％）。光镜、电镜观察见转染细胞出现较多凋亡细胞及一些变性肿胀细胞;MTT检测结果显示Jurkat细胞转染前后,经化疗药物4-羟基-环磷酰胺和甲氨蝶呤作用,转染细胞的抑制率明显大于未转染组,差异有统计学意义（P〈0．05）。结论 survivin基因对Jurkat细胞系的生长起着重要的作用,抑制survivin基因表达在T淋巴母细胞淋巴瘤治疗中可能有重要的意义,该基因似可能作为治疗的靶点。     

阳离子脂质体介导TIMP-3基因对兔血管平滑肌细胞增殖和凋亡的影响

目的：通过阳离子脂质体介导含有TIMP-3基因的质粒转染体外兔平滑肌细胞，观察瞬时表达的TIMP-3对细胞增殖及凋亡的影响。方法：构建兔TIMP-3基因质粒表达载体。按照正常对照组、空质粒组、重组质粒载体组将72孔兔血管平滑肌细胞分为3组，每组又分为24、48、72h 3个亚组。阳离子脂质体介导质粒分别转染相应组细胞，正常对照组无质粒加入。转染后进行细胞计数，描绘生长曲线；将24孔细胞分为3组进行基因转染，转染后48h检测细胞凋亡率。结果：正常对照组细胞数、细胞凋亡率与空质粒组相比均无明显差别；重组质粒组细胞数与前二者相比明显减少（P〈0．05），重组质粒组细胞凋亡率均明显高于前二者（P〈0．05）。结论：TIMP-3对体外血管平滑肌细胞具有明显抑制增值及促进细胞凋亡的作用；阳离子脂质体作为新型、高效转染介质对细胞生长无明显不良反应，使用安全，应用于TIMP-3基因治疗支架后再狭窄前景广阔。     

DPC4基因转染对结肠癌细胞生长的抑制作用及其作用机制

目的 研究DPCA基因转染对结肠癌细胞生长及p21^WAFI mRNA表达的影响。方法 构建pcDNA3．1-DPCA真核表达质粒．利用脂质体转染技术将pcDNA3．1质粒和pcDNA3．1-DPCA质粒分别导入结肠癌细胞系SW620;采用免疫细胞化学和Western蛋白印迹检测细胞中DPCA基因的表达;通过检测细胞生长曲线、克隆形成实验研究DPCA基因转染对SW620细胞生长的抑制作用。通过逆转录．聚合酶链反应(RT-PCR)检测各组细胞内p21^WAFI mRNA的表达。结果 转染DPC4基因后,在SW620细胞中可检测到高表达的DPCA蛋白;细胞生长倍增时间(74h)明显延长;细胞克隆形成率(21％)明显降低。DPCA基因转染后SW620细胞p21^WAFI mRNA含量增加。结论 DPC4基因的高表达能够抑制结肠癌细胞的生长,DPCA基因可能通过诱导p21^WAFI基因的表达而抑制结肠癌细胞的生长。     

骨形态发生蛋白2基因转染犬牙髓细胞

背景：研究发现骨形态发生蛋白2具有诱导间充质细胞向成骨细胞表型分化以及诱导新骨及修复性牙本质形成的能力。 目的：通过对细胞超微结构的分析,探讨骨形态发生蛋白2基因转染的犬牙髓细胞,向成牙本质细胞转化的过程。 方法：将培养的性状稳定的第4代犬牙髓细胞分为3组：基因转染组转染pEGFP-N1-BMP-2基因,空白载体转染组转染EGFP-N1空白荧光载体,未转染组不转染。 结果与结论：成功构建pEGFP-N1-BMP-2真核表达质粒,并成功将其转染犬牙髓细胞, pEGFP-N1-BMP-2质粒转染促进犬牙髓细胞分泌骨形态发生蛋白2。pEGFP-N1-BMP-2质粒转染有促进牙髓细胞碱性磷酸酶活性的作用。透射电镜观察结果显示：转染后的犬牙髓细胞具有成牙本质细胞的形态特点。说明pEGFP-N1-BMP-2 真核表达质粒转染后的牙髓细胞,具有成牙本质细胞的特征。     

转染IκBα显性失活突变体对膀胱癌细胞系IL-6和IL-8表达的影响

转染绿色荧光蛋白突变体融合的p6 5质粒和显性失活IκBα质粒入膀胱癌细胞T2 4 ,荧光显微镜和Western印迹检测质粒在细胞中表达情况 ,RT PCR检测IL 6和IL 8的mRNA表达变化。结果表明 :转染 2 4h后 ,两质粒在细胞中稳定表达 ,4 8h后表达持续于高水平 ,转染GFP p6 5质粒 2 4h后IL 6、IL 8的mRNA表达明显增加 ,4 8h后继续高水平表达。转染突变体IκBα质粒 2 4h后 ,IL 6、IL 8的mRNA的表达明显减弱 ,4 8h后IL 6看不到明显的表达 ,IL 8的mRNA的表达进一步减少 ;半定量值比较提示GFP p6 5质粒处理组与未处理组之间、显性失活IκBα质粒转染与不处理组之间、GFP p6 5质粒处理组与显性失活IκBα质粒处理组之间差异均有显著性。这些结果提示转录因子NF κB对膀胱癌中IL 6、IL 8表达水平起调控作用     

pEGFP-C3 -insig2融合基因真核表达质粒的构建、表达及其对下游基因的影响

目的：构建insig 2基因的真核表达质粒, 转染3T3-L1细胞并观察对下游脂肪酸结合蛋白（AP2）mRNA、脂联素mRNA表达的影响.方法：采用RT-PCR法获取小鼠全长insig 2基因, 并克隆入真核表达载体pEGFP-C3中.酶切、测序鉴定后, 经脂质体转染入3T3-L1细胞, 通过荧光显微镜观察及RT-PCR检测其在3T3-L1细胞中的表达及下游基因的变化.结果：成功地构建了pEGFP-C3-insig 2融合基因的真核表达载体, 荧光显微镜观察到pEGFP-C3-insig 2融合蛋白在转染的3T3-L1细胞胞质中的表达, insig 2基因的转录明显上调.转染后24 h、 72 h较0 h AP 2 mRNA和脂联素mRNA的转录水平明显下调.结论：构建了insig 2基因的真核表达质粒, 在转染的3T3-L1细胞中insig 2的过表达可能影响该细胞的脂肪代谢.     

Beclin1和HLAⅠ、Ⅱ在人卵巢癌SKOV3细胞中的表达

目的探讨转染Beclin1质粒的自噬基因Beclin1和免疫应答效应分子HLAⅠ、Ⅱ在人卵巢癌SKOV3细胞中的表达,分析Beclin1在卵巢癌免疫应答中的作用。方法应用基因转染技术、RT-PCR、Western blot法检测Beclin1质粒转染SKOV3细胞前后Beclin1和HLAⅠ、Ⅱ的mRNA和蛋白表达水平的变化。应用免疫荧光显微镜观察Beclin1质粒转染SKOV3细胞后,其自噬小体的变化。用MTT法检测Beclin1质粒转染SKOV3前后细胞的增殖活性。结果 SKOV3细胞转染Beclin1质粒后,Beclin1的转录和翻译水平分别是空载体组的5、2倍。荧光显微镜观察,转染Beclin1质粒组卵巢癌细胞MDC标记的自噬小体数量显著增多。RT-PCR和Western blot结果显示,转染Beclin1可诱导HLAⅠ、Ⅱ等位基因的转录和翻译。Beclin1质粒组的HLAⅠ-A、B、C和HLAⅡ-DP、DQ、DR的mRNA分别是空载体组的2、1.6、3倍和2、6、3倍;其HLAⅠ、Ⅱ的蛋白表达分别是空载体组的2、1.6倍。MTT结果显示,Beclin1质粒组与空载体组、空白对照组相比,在转染24、48、72、96 h后,其细胞生长抑制率分别为42.6%、37.8%、24.35%、14.81%。结论在人卵巢癌SKOV3细胞中,转染外源性Beclin1可诱导细胞自噬并使免疫应答效应分子HLAⅠ、Ⅱ的表达增加。HLAⅠ、Ⅱ表达的增加可能使卵巢癌细胞免疫应答增强。转染外源性Beclin1可抑制卵巢癌SKOV3的细胞增殖。     

Establishment of transformed swine fibroblast cell lines using SV40 large T antigen

Summary Swine testicle cell lines were established by transformation of primary swine testicle (PST) cells with an SV40 plasmid (pSV3-neo), which contains genes conferring resistance to neomycin and expressing SV40 large T antigen. Plasmid DNA was transfected into PST cells using a lipofection system. Two related plasmids, pSV2-neo and pSV5-neo, failed to induce transformed cells. Cells transformed with pSV3-neo formed single colonies that were resistant to the antibiotic, G418, and expressed large T antigen. Upon two cycles of cloning by endpoint dilution method, three transformed clones, designated transformed swine testicle (tST)-3, tST-14 and tST-18, were selected and characterized in regards to cell replication and susceptibility to swine viruses. The resultant clones were compared with a counterpart non-transformed ST cell line (ATCC-ST). The three tST cell lines showed longer or the same doubling times and higher saturation densities compared to ATCC-ST cells. These cells were free from a range of adventitious agents and supported the replication of porcine parvovirus (PPV), pseudorabies virus (PRV) and transmissible gastroenteritis virus (TGEV), comparable to ATCC-ST cells. All three cell lines have been maintained in continuous cultures for over 60 passages with no changes in growth characteristics. These findings indicate that lipofection with pSV3-neo is an efficient means for the introduction of exogenous DNA into porcine cells and for establishment of transformed immortalized cell lines.     

The in vivo clearance of Ha-ras transformants by natural killer cells

The experiments in this study were designed to test the hypothesis that natural killer (NK) cells play a role in host surveillance against early neoplastic changes in the malignant process. C3H 10T1/2 mouse fibroblasts were transfected with a pSV2-neo plasmid vector which contains EJ, the mutated c-Ha-ras, regulated by its own promoter. Control cells were transfected with pSV2-neo alone and did not contain the ras gene. Oncogene-transfected cells were compared with control cells for lung colony formation following tail vein injection into C3H mice. Intravenous injection of ras-transfected 10T1/2 cells induced marked lung colony formation in vivo, whereas C3H 10T1/2 parental lines or 10T1/2 cells transfected with pSV2-neo alone induced no lung colonies in C3H mice. The colonising potential of ras transfectants could be decreased by augmentation of NK activity by injection of polyinosinic cytidylic acid and increased by depletion of NK effectors with anti-asialo GM₁. Experiments with beige mice demonstrated that the mortality of syngeneic, NK-deficient C3H-bg/bg mice injected with ras tranfectants was significantly greater than similarly treated NK-normal C3H-+/bg littermate controls. The results support the view that NK cells are capable in vivo of recognizing early defined stages in the neoplastic process initiated by oncogenes.     

大鼠全脑缺血再灌注后内耳细胞凋亡与NGF、p75的动态表达

采用大鼠全脑缺血再灌注模型,用原位缺口末端标记法(TUNEL)检测缺血再灌注不同时间内耳的细胞凋亡情况,通过免疫荧光染色观察内耳细胞神经生长因子(NGF)与其低亲和力受体p75的表达和变化,并用透射电镜观察各组大鼠内耳细胞超微结构的改变,探讨NGF与p75在缺血再灌注诱导内耳细胞凋亡过程中的作用。结果显示:再灌注3d时内耳Corti器出现毛细胞凋亡,同时伴有p75与NGF的过表达;随着缺血再灌注时间延长,P75和NGF表达逐渐增强又逐渐减弱。结果提示:p75和NGF参与了脑缺血再灌注诱导的内耳延迟性毛细胞凋亡的过程,p75与NGF的过表达可能起了促进内耳感觉细胞凋亡的作用。     

体外培养的嵌合体丙型肝炎病毒感染Huh7.5细胞的透射电镜观察

目的 通过透射电子显微镜技术观察体外培养的嵌合体丙型肝炎病毒(HCV)感染Huh7.5细胞后胞内病毒颗粒的形态学特征及细胞内部超微结构的变化.方法 将含有全长HCV嵌合基因组的质粒pFL-J6/JFH体外转录为HCV RNA,电穿孔转染至Huh7.5细胞,实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)测定培养上清中病毒数量;间接免疫荧光检测病毒蛋白的表达;收取转染后细胞培养上清感染原始Huh7.5细胞,制作超薄细胞切片,透射电子显微镜技术观察被感染细胞中病毒颗粒的形态学特征及细胞超微结构的变化.结果 qRT-PCR显示不同时间点收取的转染后细胞培养上清中含有高水平的病毒量;间接免疫荧光显示病毒NSSA非结构蛋白高表达;透射电子显微镜观察到被感染的Huh7.5细胞内含有大量有包膜或无包膜的病毒样颗粒,细胞质内部分膜性细胞器增生,出现黄病毒科病毒感染后特征性结构及某种未知结构等.结论 体外培养的嵌合体HCV具有HCV颗粒的形态学特征,并能够有效感染人源性肝细胞Huh7.5.     

体外培养的嵌合体丙型肝炎病毒感染Huh7.5细胞的透射电镜观察

目的 通过透射电子显微镜技术观察体外培养的嵌合体丙型肝炎病毒(HCV)感染Huh7.5细胞后胞内病毒颗粒的形态学特征及细胞内部超微结构的变化.方法 将含有全长HCV嵌合基因组的质粒pFL-J6/JFH体外转录为HCV RNA,电穿孔转染至Huh7.5细胞,实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)测定培养上清中病毒数量;间接免疫荧光检测病毒蛋白的表达;收取转染后细胞培养上清感染原始Huh7.5细胞,制作超薄细胞切片,透射电子显微镜技术观察被感染细胞中病毒颗粒的形态学特征及细胞超微结构的变化.结果 qRT-PCR显示不同时间点收取的转染后细胞培养上清中含有高水平的病毒量;间接免疫荧光显示病毒NSSA非结构蛋白高表达;透射电子显微镜观察到被感染的Huh7.5细胞内含有大量有包膜或无包膜的病毒样颗粒,细胞质内部分膜性细胞器增生,出现黄病毒科病毒感染后特征性结构及某种未知结构等.结论 体外培养的嵌合体HCV具有HCV颗粒的形态学特征,并能够有效感染人源性肝细胞Huh7.5.     

体外培养的嵌合体丙型肝炎病毒感染Huh7.5细胞的透射电镜观察

目的 通过透射电子显微镜技术观察体外培养的嵌合体丙型肝炎病毒(HCV)感染Huh7.5细胞后胞内病毒颗粒的形态学特征及细胞内部超微结构的变化.方法 将含有全长HCV嵌合基因组的质粒pFL-J6/JFH体外转录为HCV RNA,电穿孔转染至Huh7.5细胞,实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)测定培养上清中病毒数量;间接免疫荧光检测病毒蛋白的表达;收取转染后细胞培养上清感染原始Huh7.5细胞,制作超薄细胞切片,透射电子显微镜技术观察被感染细胞中病毒颗粒的形态学特征及细胞超微结构的变化.结果 qRT-PCR显示不同时间点收取的转染后细胞培养上清中含有高水平的病毒量;间接免疫荧光显示病毒NSSA非结构蛋白高表达;透射电子显微镜观察到被感染的Huh7.5细胞内含有大量有包膜或无包膜的病毒样颗粒,细胞质内部分膜性细胞器增生,出现黄病毒科病毒感染后特征性结构及某种未知结构等.结论 体外培养的嵌合体HCV具有HCV颗粒的形态学特征,并能够有效感染人源性肝细胞Huh7.5.     

体外培养的嵌合体丙型肝炎病毒感染Huh7.5细胞的透射电镜观察

目的 通过透射电子显微镜技术观察体外培养的嵌合体丙型肝炎病毒(HCV)感染Huh7.5细胞后胞内病毒颗粒的形态学特征及细胞内部超微结构的变化.方法 将含有全长HCV嵌合基因组的质粒pFL-J6/JFH体外转录为HCV RNA,电穿孔转染至Huh7.5细胞,实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)测定培养上清中病毒数量;间接免疫荧光检测病毒蛋白的表达;收取转染后细胞培养上清感染原始Huh7.5细胞,制作超薄细胞切片,透射电子显微镜技术观察被感染细胞中病毒颗粒的形态学特征及细胞超微结构的变化.结果 qRT-PCR显示不同时间点收取的转染后细胞培养上清中含有高水平的病毒量;间接免疫荧光显示病毒NSSA非结构蛋白高表达;透射电子显微镜观察到被感染的Huh7.5细胞内含有大量有包膜或无包膜的病毒样颗粒,细胞质内部分膜性细胞器增生,出现黄病毒科病毒感染后特征性结构及某种未知结构等.结论 体外培养的嵌合体HCV具有HCV颗粒的形态学特征,并能够有效感染人源性肝细胞Huh7.5.     

体外培养的嵌合体丙型肝炎病毒感染Huh7.5细胞的透射电镜观察

目的 通过透射电子显微镜技术观察体外培养的嵌合体丙型肝炎病毒(HCV)感染Huh7.5细胞后胞内病毒颗粒的形态学特征及细胞内部超微结构的变化.方法 将含有全长HCV嵌合基因组的质粒pFL-J6/JFH体外转录为HCV RNA,电穿孔转染至Huh7.5细胞,实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)测定培养上清中病毒数量;间接免疫荧光检测病毒蛋白的表达;收取转染后细胞培养上清感染原始Huh7.5细胞,制作超薄细胞切片,透射电子显微镜技术观察被感染细胞中病毒颗粒的形态学特征及细胞超微结构的变化.结果 qRT-PCR显示不同时间点收取的转染后细胞培养上清中含有高水平的病毒量;间接免疫荧光显示病毒NSSA非结构蛋白高表达;透射电子显微镜观察到被感染的Huh7.5细胞内含有大量有包膜或无包膜的病毒样颗粒,细胞质内部分膜性细胞器增生,出现黄病毒科病毒感染后特征性结构及某种未知结构等.结论 体外培养的嵌合体HCV具有HCV颗粒的形态学特征,并能够有效感染人源性肝细胞Huh7.5.     

体外培养的嵌合体丙型肝炎病毒感染Huh7.5细胞的透射电镜观察

目的 通过透射电子显微镜技术观察体外培养的嵌合体丙型肝炎病毒(HCV)感染Huh7.5细胞后胞内病毒颗粒的形态学特征及细胞内部超微结构的变化.方法 将含有全长HCV嵌合基因组的质粒pFL-J6/JFH体外转录为HCV RNA,电穿孔转染至Huh7.5细胞,实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)测定培养上清中病毒数量;间接免疫荧光检测病毒蛋白的表达;收取转染后细胞培养上清感染原始Huh7.5细胞,制作超薄细胞切片,透射电子显微镜技术观察被感染细胞中病毒颗粒的形态学特征及细胞超微结构的变化.结果 qRT-PCR显示不同时间点收取的转染后细胞培养上清中含有高水平的病毒量;间接免疫荧光显示病毒NSSA非结构蛋白高表达;透射电子显微镜观察到被感染的Huh7.5细胞内含有大量有包膜或无包膜的病毒样颗粒,细胞质内部分膜性细胞器增生,出现黄病毒科病毒感染后特征性结构及某种未知结构等.结论 体外培养的嵌合体HCV具有HCV颗粒的形态学特征,并能够有效感染人源性肝细胞Huh7.5.     

体外培养的嵌合体丙型肝炎病毒感染Huh7.5细胞的透射电镜观察

目的 通过透射电子显微镜技术观察体外培养的嵌合体丙型肝炎病毒(HCV)感染Huh7.5细胞后胞内病毒颗粒的形态学特征及细胞内部超微结构的变化.方法 将含有全长HCV嵌合基因组的质粒pFL-J6/JFH体外转录为HCV RNA,电穿孔转染至Huh7.5细胞,实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)测定培养上清中病毒数量;间接免疫荧光检测病毒蛋白的表达;收取转染后细胞培养上清感染原始Huh7.5细胞,制作超薄细胞切片,透射电子显微镜技术观察被感染细胞中病毒颗粒的形态学特征及细胞超微结构的变化.结果 qRT-PCR显示不同时间点收取的转染后细胞培养上清中含有高水平的病毒量;间接免疫荧光显示病毒NSSA非结构蛋白高表达;透射电子显微镜观察到被感染的Huh7.5细胞内含有大量有包膜或无包膜的病毒样颗粒,细胞质内部分膜性细胞器增生,出现黄病毒科病毒感染后特征性结构及某种未知结构等.结论 体外培养的嵌合体HCV具有HCV颗粒的形态学特征,并能够有效感染人源性肝细胞Huh7.5.