肾癌G250/MN/CAIX 抗原基因在酿酒酵母中的 诱导表达及意义

 【目的】 观察G250 抗原基因编码区cDNA 全长基因片段在酿酒酵母中诱导表达情况,并初步探讨其作为肿瘤治疗中的意义。【方法】 应用基因重组技术将人G250 cDNA序列克隆入酿酒酵母穿梭诱导表达载体pYES2/NT C,构建重组酵母真核表达质粒pYES2/NT C-G250并转化酿酒酵母菌株INVSc1,筛选阳性克隆转化子,经半乳糖诱导表达后进行菌体全蛋白的Western blot检测。【结果】 成功构建pYES2/NT C-G250 重组酿酒酵母诱导表达质粒,证实其能够在酿酒酵母中诱导表达,表达量随诱导时间而变化,8 ~ 12 h 达高峰。【结论】 人G250基因片段能够在酿酒酵母中表达,为进一步探讨基因重组酿酒酵母G250 疫苗抗肿瘤效应及其安全性打下基础.     

肾癌G250/MN/CAIX抗原基因在酿酒酵母中的诱导表达及意义

【目的】观察G250抗原基因编码区cDNA全长基因片段在酿酒酵母中诱导表达情况,并初步探讨其作为肿瘤治疗中的意义。【方法】应用基因重组技术将人G250cDNA序列克隆入酿酒酵母穿梭诱导表达载体pYES2/NTC,构建重组酵母真核表达质粒pYES2/NTC-G250并转化酿酒酵母菌株INVSc1,筛选阳性克隆转化子,经半乳糖诱导表达后进行菌体全蛋白的Westernblot检测。【结果】成功构建pYES2/NTC-G250重组酿酒酵母诱导表达质粒,证实其能够在酿酒酵母中诱导表达,表达量随诱导时间而变化,8～12h达高峰。【结论】人G250基因片段能够在酿酒酵母中表达,为进一步探讨基因重组酿酒酵母G250疫苗抗肿瘤效应及其安全性打下基础。     

融合基因Tat-HPV16L1的克隆及其在酿酒酵母中的表达

目的 构建人乳头瘤病毒16型L1基因和蛋白转导肽的Tat基因的融合表达载体,导人酿酒酵母表达系统进行诱导表达,为口服基因疫苗的制备打下基础.方法 以pBR322-HPV16质粒为模板扩增L1基因,与酿酒酵母表达载体pYES2连接.重组质粒再与自行设计的蛋白转导功能片段Tat连接,经测序鉴定后转入酿酒酵母表达菌株INVSc1诱导表达Tat-HPV16L1融合蛋白.结果 融合基因Tat-HPV16L1测序结果与预期完全符合,经过半乳糖诱导表达后进行SDS-PAGE电泳和Western blotting分析.结果 表明诱导表达成功.结论 成功构建和表达了融合表达载体pYES2-Tat-HPV16L1,为制备以酿酒酵母为运送载体的口服人乳头瘤病毒疫苗打下基础.     

重组全酿酒酵母HPV16-E7疫苗的构建及免疫原性初步研究

目的 构建人乳头状瘤病毒16型(HPV16)E7重组全酿酒酵母疫苗.初步评价疫苗的免疫应答效应.方法 将HPV16 E7 cDNA亚克隆入酵母表达载体pYES2/NT,重组质粒转化酿酒酵母,经诱导表达、热灭活制备全酵母HPV16-E7疫苗.疫苗免疫C57BL/6小鼠,ELISA检测其诱导的抗体和细胞因子表达水平.结果 重组全酵母疫苗能够有效地表达HPV16-E7蛋白;疫苗小鼠免疫,能够诱导出特异性抗HPV16-E7抗体,并促进Th1型细胞因子的表达.结论 研究结果 为进一步进行疫苗抗肿瘤免疫研究,提供了实验基础.     

前列腺特异膜抗原基因的克隆和真核表达

[目的]克隆前列腺特异膜抗原(PSMA)基因的编码区序列,并进行真核表达.[方法]用RT-PCR方法扩增前列腺癌组织标本中的PSMA cDNA序列,并将其克隆至真核表达载体pcDNA3.0.用脂质体转染法,把pcDNA3.0-PSMA转染哺乳动物细胞,鉴定PSMA蛋白的表达.[结果]序列测定结果表明,两条引物之间的片段长度为2 279 bp,与预期长度一致.将克隆的编码区序列与GenBank的PSMA序列进行Blast对比分析,同源性为99.7%;间接免疫荧光法显示表达的蛋白质为膜蛋白,免疫印迹表明表达蛋白质的相对分子质量为100 ku.[结论]成功扩增了PSMA编码区序列,构建了PSMA真核表达载体,建立了PSMA稳定表达的细胞株.经免疫分析,证实了真核细胞内表达的PSMA为分子质量正确的膜蛋白,且具有良好的抗原性.所获得的PSMA真核表达系统为进一步研究PSMA基因修饰的DCs疫苗对前列腺癌的治疗提供了物质基础.     

Nar1基因酵母表达载体的构建及表达鉴定

目的:构建Nar1基因的酵母表达载体,并纯化His-Nar1融合蛋白,为进一步研究Nar1的相互作用蛋白及其功能奠定基础。方法:通过PCR扩增Nar1全长基因;通过定向克隆的方法将Nar1片段与载体pYES2/NTC连接;通过乙酸锂转化法把重组质粒转化入野生型酵母菌株INVSc1;再通过免疫沉淀的方法纯化His-Nar1融合蛋白;通过Western blot检测靶蛋白。结果:DNA测序验证穿梭表达质粒pYES2/NTC-Nar1构建成功,Western blot检测到融合蛋白His-Nar1的表达。结论:成功构建Nar1酵母过表达载体,并且可以有效表达融合蛋白His-Nar1。     

中国人前列腺特异性膜抗原基因的克隆及鉴定

[目的]克隆中国人前列腺特异性膜抗原(prostate specific membrane antigen,PSMA)的cDNA全长,并将其连接到原核表达载体pET-30(a),构建PSMA的原核表达重组子.[方法]从前列腺癌患者活检组织中提取RNA,利用PSMA的cDNA中的EcoR Ⅰ位点,将PSMA分成两段分别做RT-PCR,然后再将其分别连接到pET-30(a)中,从而得到完整PSMA的cDNA的原核表达重组子pET-30(a)-PSMA,并对其进行鉴定.[结果]首次成功克隆到全序列的中国人PSMA的cDNA,并构建了PSMA的原核表达重组子pET-30(a)-PSMA,为以后的PSMA表达、纯化及其抗体库的筛选奠定了基础.[结论]分段克隆基因,然后将基因分别连接到同一载体,是有效地对一些长片段基因进行克隆的方法之一.     

大鼠DAF蛋白真核表达载体的构建及生物活性鉴定

目的 构建大鼠促衰变因子(DAF)的酵母真核表达载体,诱导其表达并对生物学特性进行鉴定.方法 采用RT-PCR技术从大鼠肝脏组织中扩增出DAF基因并克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K质粒中.经酶切鉴定后,将pPIC9K-DAF转化至毕赤酵母菌GS115,通过G418-YPD平板筛选高拷贝转化子.转化子经甲醇诱导表达后,对表达的DAF蛋白进行SDS-PAGE及Western blot鉴定并检测重组蛋白的生物活性.结果 成功克隆大鼠DAF基因,并筛选出pPIC9K载体中的DAF阳性克隆,证实所获得相对分子质量约为70×103大小的重组蛋白具有大鼠DAF蛋白的抗原性和生物学活性.结论 采用分子克隆的方法成功构建大鼠DAF蛋白的毕赤酵母真核表达载体,能为补体及免疫研究提供高效的大鼠DAF蛋白来源.     

TAT-HBsAg融合基因在酿酒酵母中的同源重组与表达

[目的]克隆HBsAg和TAT-HBsAg融合基因,在酿酒酵母中同源重组表达.[方法]以HBV基因组为模板PCR扩增HBsAg和TAT-HBsAg融合基因;从酿酒酵母文库质粒pHSS6-mTn-3xHA/LacZ中筛选出可在酿酒酵母中进行同源重组且具有强启动子的质粒pHL;将质粒pHL与TAT-HBsAg融合基因酶切后连接,转化酵母进行同源重组表达;ELISA鉴定蛋白的表达.[结果]酵母中表达了HBsAg蛋白和TAT-HBsAg融合蛋白.[结论]TAT-HBsAg融合基因可以通过同源重组,在酵母细胞中进行产物表达.     

MAGE-3基因的表达、纯化及其抗血清的制备

[目的]构建MAGE-3的原核表达质粒,表达、纯化蛋白并制备多克隆抗体.[方法]利用RTPCR方法扩增MAGE-3基因片段,连接入原核表达载体pGEX-4T-1,构建MAGE-3的原核表达质粒pGEXMAGEE-3并测序.将该质粒转化大肠杆菌BL21进行诱导表达,并通过谷胱甘肽巯基转移酶纯化系统进行分离纯化.用纯化的融合蛋白GST-MAGE-3免疫新西兰大白兔,ELISA法测定抗体效价,饱和硫酸铵沉淀法纯化抗体,Western-blot检测抗体活性.[结果]构建了pGEX-MAGE-3原核表达质粒,含有该质粒的大肠杆菌经IPTG诱导后表达一相对分子质量约为72×103的蛋白,经GST融合蛋白纯化系统纯化,得到了MAGE-3的重组蛋白GST-MAGE-3.制备了兔抗GST-MAGE-3抗体.Western blot证实该抗体可与GST-MAGE-3蛋白特异性结合.[结论]获得了肿瘤抗原MAGE-3的纯化重组蛋白及其特异的多克隆抗体、为进一步研究MAGE-3抗原在肿瘤免疫治疗中的作用提供了一件检测工具.