JAK2/STAT3途径在IL-6抑制LPS诱导的树突状细胞分化成熟中的作用

目的 观察JAK2/STAT3信号途径在IL-6抑制LPS诱导的小鼠髓源性树突状细胞(bone marrow-derived dendritic cells,BMDCs)分化成熟中的作用.方法 分离小鼠骨髓细胞,采用黏附法结合GM-CSF和IL-4刺激法在体外培养BMDCs;用相差倒置显微镜观察BMDCs的形态特点;用LPS诱导DCs成熟;采用流式细胞术观察IL-6处理与否,LPS诱导的BMDCs在表型上的变化;Western blot检测BMDCs细胞质p-JAK2、总STAT3和P-STAT3的表达水平.结果 形态观察和FCM分析的结果表明:体外成功培养了纯度较高的高表达CD11c的BMDCs,LPS能明显诱导BMDCs表面MHC-Ⅱ类分子和共刺激分子CD80、CD86、CD40的表达上调;而经过IL-6处理后,LPS诱导BMDCs表面MHC-Ⅱ类分子、CD80、CD86、CD40表达上调的能力被显著削弱(P＜0.01).Western blot结果显示,与单独用LPS处理的BMDCs相比,经IL-6处理后的BMDC中p-JAK2、P-STAT3表达随作用时间增加而明显上调,提示IL-6促进JAK2/STAT3信号途径活化.结论 JAK2/STAT3信号途径参与了IL-6抑制LPS诱导的BMDCs成熟过程.     

小鼠骨髓树突状细胞体外扩增方法的建立

目的建立小鼠骨髓树突状细胞(DC)体外大量扩增方法。方法应用粒细胞一巨噬细胞集落刺激因子联合白细胞介素-4诱导培养小鼠骨髓细胞，应用相差显微镜观察形态学变化，’H-TdR掺入法检测细胞增殖能力，FACS检测细胞表面分了，ELISA检测细胞因子。结果体外诱导培养8天后可获得大量形态学典型的DC，具有强烈的激活同种异体或自体T细胞增殖反应能力。FACS检测表明，扩增的DC表达IaK^b、CDllc、CD80、CD86、ICAM-1分子。DC接受LPS刺激后，可以促使DC成熟，分泌IL-12(p70)、IL-6、TNF-a和IL-1β水平增强。结论小鼠骨髓细胞体外诱导培养，可生成大量功能成熟的DC，为进一步开展DC基础和临床研究打下基础。     

IL-6通过SOCS3诱导小鼠髓源性DCs分化成熟障碍的分子机制研究

目的 观察IL-6诱导小鼠髓源性DCs分化成熟障碍过程中SOCS3的表达变化并探讨其分子机制.方法分离小鼠骨髓细胞,采用黏附法结合GM -CSF和IL-4刺激法在体外培养髓源性DCs (BMDCs).用LPS诱导iDCs成熟,采用Real-Time RT-PCR和Western blot方法,观察IL-6处理前后LPS诱导的BMDCs中SOCS3表达的变化,并用甲基化特异性PCR观察SOCS3启动子CpG岛的甲基化状态.结果 Real-Time RT-PCR和Western blot结果显示,LPS能显著诱导BMDCs SOCS3 mRNA和蛋白的表达上调;而经过IL-6处理后,LPS诱导BMDCs SOCS3 mRNA和蛋白表达上调的能力被显著抑制(P＜0.05).甲基化特异性PCR与单独用LPS处理的BMDCs相比,经IL-6处理后的BMDCs SOCS13启动子区CpG岛被甲基化.结论 IL-6通过诱导SOCS3基因启动子区CpG岛的甲基化来抑制SOCS3表达,进而阻遏iDCs分化成熟,促进胃癌等肿瘤细胞侵袭转移.     

SOCS1 受抑的新型肝癌树突状细胞疫苗制备及功效的初步研究

目的探讨抑制SOCS1表达对LIGHT激活的肝癌树突状细胞疫苗效应的作用。方法用重组小鼠粒-巨噬细胞集落刺激因子(rmGM-CSF)、重组小鼠白细胞介素4(rmIL-4)体外诱导培养小鼠骨髓单核细胞产生骨髓来源树突状细胞(BMDC),体外负载肝癌细胞HepA可溶性抗原,并用LIGHT和SOCS1反义寡核苷酸(AS1)处理DC,制备负载肝癌抗原DC疫苗;流式细胞仪检测疫苗细胞CD40及CD86表达和ELISA测定其IL-12、IL-1分泌水平以确定DC疫苗细胞的成熟度;通过体外细胞毒T淋巴细胞(CTL)活性、淋巴细胞增殖反应和IL-6、TNF-β分泌水平测定分析疫苗细胞的抗肿瘤免疫应答。结果负载肝癌抗原DC疫苗在LIGHT和AS1的双重作用下,疫苗细胞的成熟标志CD40、CD86、IL-1和IL-12增高(P<0.01),能增强诱导CTL活性、刺激淋巴细胞增殖和分泌IL-6、TNF-β能力(P<0.01)。结论抑制SOCS1能提高肝癌DC疫苗的成熟度,并增强疫苗细胞诱导抗肿瘤免疫应答。     

小鼠脾脏来源树突状细胞的体外扩增培养

目的建立简便的体外扩增小鼠脾脏树突状细胞(DC)的方法。方法联合应用粒细胞—巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白细胞介素-4(IL-4)诱导培养小鼠脾脏单个核细胞分化为DC,并从形态学、表型及功能方面对其加以检测。结果体外诱导培养8 d后获得大量成熟的DC,细胞表面具有典型的树枝状突起,高表达DC相对特异性表面分子CD11c(78.5%)、MHC-Ⅱ(92.7%)及CD86(87.2%),同时具有较强的刺激同种异基因混合淋巴细胞增殖能力。结论小鼠脾脏细胞体外诱导培养可生成大量功能成熟的DC,为进一步抗肿瘤疫苗的研究奠定了基础。     

小鼠骨髓来源树突状细胞培养鉴定和诱导T淋巴细胞增殖

目的:建立一种体外诱导培养小鼠树突状细胞(DCs)的方法,并观察其不同生长阶段生物学形态及刺激淋巴细胞增殖的能力。方法:联合应用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白细胞介素-4(IL-4)诱导培养小鼠骨髓单个核细胞向DCs分化,并从形态学、表型及功能方面对其加以检测。结果:用GM-CSF和IL-4诱导培养小鼠骨髓来源的单核细胞,3 d后可见细胞形态改变,并呈集簇生长,培养至5 d可见典型的树突状突起,体外诱导培养8 d后获得大量成熟的DCs,扫描电镜可见典型的树突状细胞形态,高表达骨髓来源DCs特异性标记CD11c和共刺激分子CD40、CD80、CD86和MHC-Ⅱ,成熟DC具有很强的刺激同基因型和同种异基因型T淋巴细胞增殖的能力。结论:小鼠骨髓来源的单个核细胞体外诱导培养可生成大量成熟的DCs,为进一步抗肿瘤疫苗的实验研究奠定了基础。     

健康人外周血树突状细胞诱导培养及鉴定

[目的]从健康人外周血中分离出单个核细胞(PBMC),经体外诱导培养获取树突状细胞(DC)并鉴定其表型.[方法]应用GM-CSF、IL-4、TNF-α等细胞因子自外周血单个核细胞诱导扩增,培养出DC,动态观察细胞形态,流式细胞仪检测其表面标志,采用混合淋巴细胞培养法检测其刺激同种异体淋巴细胞增殖能力.[结果]经诱导培养出具有典型特征的DC,高表达CD86、CD80,DC特征性标志CD1a平均为49.28%,在体外能诱导强烈的同种异体混合淋巴细胞增殖反应.[结论]该方法能可靠地诱导培养出DC,为DC的进一步研究提供实验依据.     

重组人热休克蛋白70D的免疫佐剂样效应研究

目的：研究重组人热休克蛋白70D(rhHSP70D)蛋白的免疫佐剂样效应。方法：用rhHSP70D诱导体外培养的树突状细胞（DC），观察DC分泌前炎性细胞因子的水平、DC成熟及刺激同种异体淋巴细胞增殖的能力；用rhHSP70D与OVA257-264体外交联的蛋白免疫C57BL/6小鼠，观察能否诱导产生抗原特异性免疫保护作用。结果：rhHSP70D可以明显刺激DC分泌IL-1β、IL-12p70、TNF-α等细胞因子，可以促进DC表达HLA-DR、CD86、CD40等膜分子，增强DC诱导同种异体T淋巴细胞增殖的能力；rhHSP70D-OVA257-264交联蛋白可诱导小鼠产生具有明显抗原特异性的免疫保护作用，而rhHSP70D或OVA257-264单独免疫小鼠均不能产生这种保护作用。结论：rhHSP70D能通过促进DC成熟、刺激前炎性细胞因子的分泌增强DC的免疫激发功能，rhHSP70D-抗原肽复合物免疫能够诱导产生抗原特异性的免疫保护作用，提示rhHSP70D有望作为一种新的佐剂应用于抗肿瘤及抗感染免疫治疗。     

细菌脂多糖对人外周血单核细胞来源的树突状细胞发育和功能的影响

目的 :探讨细菌脂多糖 (LPS)对正常成人外周血单核细胞来源的树突状细胞 (Dendritic cell,DC)表面分子表达及免疫功能的影响。方法 :分离正常人 (n=5 )外周血单个核细胞 (PBMC)以 GM-CSF、IL-4联合诱生 DC,实验组在培养的第 2天加入LPS,正常对照组不加。于第 4、8天 FACS检测 DC表面分子 CD1a、CD14、CD83、CD80、HL A-DR的表达。同期检测 DC的增殖和刺激同种异体 T淋巴细胞的增殖情况。结果 :经 LPS刺激后 ,正常人 DC早期、晚期表面分子 CD1a、CD83、CD80表达增高 ,CD14表达降低 (P<0 .0 5 )。DC数量的增加及刺激同种异体 T细胞能力明显增强。结论 :GM-SF、IL-4和 L PS联合刺激能促进正常人 DC的成熟和免疫功能的提高     

SOCS1受抑的新型肝癌树突状细胞疫苗制备及功效的初步研究

目的探讨抑制SOCS1表达对LIGHT激活的肝癌树突状细胞疫苗效应的作用。方法用重组小鼠粒-巨噬细胞集落刺激因子（rmGM-CSF）、重组小鼠白细胞介素4（rmIL-4）体外诱导培养小鼠骨髓单核细胞产生骨髓来源树突状细胞（BMDC），体外负载肝癌细胞HepA可溶性抗原，并用LIGHT和SOCS1反义寡核苷酸（AS1）处理DC，制备负载肝癌抗原DC疫苗；流式细胞仪检测疫苗细胞CD40及CD86表达和ELISA测定其IL-12、IL-1分泌水平以确定DC疫苗细胞的成熟度；通过体外细胞毒T淋巴细胞（CTL）活性、淋巴细胞增殖反应和IL-6、TNF-β分泌水平测定分析疫苗细胞的抗肿瘤免疫应答。结果负载肝癌抗原DC疫苗在LIGHT和AS1的双重作用下，疫苗细胞的成熟标志CD40、CD86、IL-1和IL-12增高（P〈0．01），能增强诱导CTL活性、刺激淋巴细胞增殖和分泌IL-6、TNF-β能力（P〈0．01）。结论抑制SOCS1能提高肝癌DC疫苗的成熟度，并增强疫苗细胞诱导抗肿瘤免疫应答。     

枸杞多糖对小鼠骨髓树突状细胞成熟的影响

目的：研究枸杞多糖对小鼠骨髓树突状细胞（DC）表型及功能成熟的影响。方法：小鼠骨髓细胞用GM-CSF和IL-4培养5d，然后用免疫磁珠法纯化DC细胞，实验组加入枸杞多糖（100μg／ml），空白对照组加等量RPMI1640，阳性对照组加LPS（100ng／ml），3组分别同时作用48h。流式细胞仪检测细胞表型和细胞摄取抗原的能力，ELISA检测产生的细胞因子IL-12，混合淋巴细胞反应检测细胞提呈抗原的能力。结果：用枸杞多糖刺激的小鼠骨髓DC表达I-A／I-E、CD11c和分泌IL-12能力比空白对照组增加，吞噬FITC-dextran的能力下降，并可促进同种异基因T细胞的增殖。结论：枸杞多糖可以促进体外培养的小鼠骨髓DC的成熟，促进DC诱导的免疫应答启动。     

Rapamycin Modulates the Maturation of Rat Bone Marrow-derived Dendritic Cells

The purpose of the study was to observe the effect of rapamycin （RAPA） on the differentiation and maturation of rat bone marrow-derived dendritic cells （BMDCs） in vitro. BMDCs from Wistar rats were cultured with granulocyte-macrophage colony-stimulating factor plus interleukin-4 in the presence or absence of RAPA （20 ng/mL）, and stimulated with lipopolysaccharide （LPS） for 24 h before cells and supernatants were collected. Surface phenotype of BMDCs was flow-cytometrically detected to determine the expression of maturation markers, MHC class Ⅱ and CD86. Supernatants were analyzed for the production of IL-12 and IFN-γ cytokines by using ELISA. BMDCs were co-cultured with T cells from Lewis rats and mixed lymphocyte reaction was assessed by MTT method. The morphology of BMDCs stimulated with LPS remained immature after RAPA pretreatment. RAPA significantly decreased the CD86 expression, impaired the IL-12 and IFN-γ production of BMDCs stimulated with LPS, and inhibited the proliferation of allogeneic T cells. In conclusion, RAPA can inhibit the maturation of BMDCs stimulated with LPS in terms of the morphology, surface phenotype, cytokine production, and ability of BMDCs to stimulate the proliferation of allogeneic T cells in vitro.     

丹参多酚酸盐负性调节小鼠骨髓来源树突状细胞成熟及其部分免疫功能

目的:观察丹参多酚酸盐对小鼠骨髓来源树突状细胞(bone marrow-derived dendritic cells,BMDC)成熟及其部分免疫学功能的影响。方法:小鼠BMDC体外培养时加入促成熟剂脂多糖(DCLPS)或同时加入脂多糖及丹参多酚酸盐(DCSV),其中丹参多酚酸盐设3个浓度:低浓度50μg/ml(SVL)、中浓度100μg/ml(SVM)、高浓度200μg/ml(SVH)。流式细胞仪分析各组细胞表面MHC-Ⅱ分子及共刺激分子CD40、CD80、CD86的表达;FITC-Dextran内吞实验分析各组DC抗原吞噬功能;酶联免疫吸附实验(enzyme linked i mmunosorbent assay,ELISA)检测各组DC培养液上清白细胞介素(interleukin,IL)-12 p40水平。[3H]-TdR掺入法检测各组DC体外混合淋巴细胞反应(mixed lymphocyte reactions,MLR)刺激同种反应性T细胞的增殖能力;ELISA法测定MLR上清IL-10、IL-2、干扰素(interferon,IFN)-γ水平。结果:与DCLPS相比,SVL、SVM、SVH细胞表面M...     

OXIDIZED HIGH-DENSITY LIPOPROTEIN PROMOTES MATURATION AND MIGRATION OF BONE MARROW DERIVED DENDRITIC CELLS FROM C57BL/6J MICE

Objective To explore the influence of oxidized high-density lipoprotein （oxHDL） on the maturation and migration of bone marrow-derived dendritic cells （BMDCs） from C57BL/6J mice.
Methods The C57BL/6J mice bone marrow cell suspension was prepared and purified. Recombinant granulocyte-macrophage colony-stimulating factor （rmGM-CSF） and recombinant interleukin-4 （rmlL-4） were used to promote monocytes to differentiate and suppress lymphocytes. Then 50μg/mL oxHDL was added to stimulate BMDCs, using 50μg/mL high-density lipoprotein （HDL） as homologous protein control, PBS as negative control, and 1 μg/mL lipopolysaccharide （LPS） as positive control. The CD86 and MHCII expression rates were detected with fluorescence-activated cell sorting （FACS）. Liquid scintillation counting （LSC） was used in mixed lymphocyte reactions （MLRs） to reflect the ability of BMDCs in stimulating the proliferation of homologous T cells, Levels of cytokines IL-12 and IL-10 were detected by ELISA. The cell migration was evaluated with the transwell system.
Results Compared with PBS group, the expressions of CD86 and MHCII, counts per minute of MLRs, secretion of IL-12 and IL-10, and number of migrated cells in oxHDL group and LPS group significantly increased （all P 〈 0.05）, while the increment was less in oxHDL group than LPS group. The number of migrated cells in oxHDL group was about twice of that in HDL group.
Conclusion OxHDL may promote the maturation and migration of BMDCs in vitro.     

细粒棘球绦虫重组抗原铁蛋白诱导小鼠骨髓树突状细胞免疫应答的机制研究

目的 探索细粒棘球绦虫重组抗原铁蛋白(rEg.ferritin)免疫小鼠产生抵抗原头蚴感染的保护机制。方法 利用rEg.ferritin和囊液（HF）两种细粒棘球绦虫抗原与小鼠骨髓树突状细胞(BMDC)进行体外培养,共分6组:HF组（加入HF 30 μg/mL）、rEg.ferritin组（加入抗原rEg.ferritin 1 μg/mL）均为单独刺激组,rEg.ferritin+LPS 组（加入抗原rEg.ferritin 1 μg/mL和LPS 100 ng/mL）和HF+LPS组（加入HF 30 μg/mL和 LPS 100 ng/mL）为联合刺激组,LPS阳性对照组（加入LPS 100 ng/mL）,空白对照组（不加任何抗原）。通过电镜检测各组BMDC形态学的变化;流式细胞技术检测各组DC的表面分子表达、吞噬能力及诱导T细胞增殖能力的变化;酶联免疫吸附试验(ELISA) 检测各组BMDC培养上清液中所含Th1型〔白介素（IL）-12p70,肿瘤坏死因子-α（TNF-α）〕和Th2型（IL-6和IL-10）细胞因子含量。结果 rEg.ferritin 组和rEg.ferritin+LPS组BMDC具有成熟的形态,表面突起数目高于空白对照组、HF组和HF+LPS组（P<0.05）;高表达MHCⅡ、CD80、CD86及CD40分子,与空白对照组比较,差异有统计学意义（ P<0.05);诱导T细胞增殖能力强于空白对照组、HF组和HF+LPS组（P<0.05）,吞噬能力弱于HF组;高表达IL-6、IL-12p70、TNF-α及IL-10,与空白对照组比较,差异有统计学意义（ P<0.05)。结论 rEg.ferritin可以刺激BMDC细胞成熟,促进T增殖,释放高含量的Th1型及Th2型细胞因子,激活Th1型或Th2型细胞,引发免疫应答。     

Antigen-specific tolerance induced by IL-10 gene modified immature dendritic cells in experimental autoimmune myocarditis in rats

Idiopathic dilated cardiomyopathy (IDC) is the most common cause of heart failure mainly in the young and middle-aged patients, and as a result, is responsible for severe disability in otherwise healthy and productive individuals. Evidence suggests that autoimmune responses to cardiac antigens exposed after heart damage may play an important role in prolonged damage of myocardium in the pathogenesis of IDC.1 Nevertheless, little progress has been made in treating myocarditis or IDC by immun…     

小鼠骨髓来源未成熟树突状细胞蛋白表达的分析

目的 利用双向电泳和质谱技术对小鼠骨髓来源未成熟树突状细胞(dendritic cells,DC)表达的蛋白质进行分析.方法 IL-4和GM-CSF诱导未成熟DC的分化,提取细胞总蛋白,定量.双向凝胶电泳分离蛋白质组分,胶体银染显色,PDQuest进行图像分析后选取蛋白点,胶内酶解后MALDI-TOF MS进行肽指纹图...     

氧化修饰性脂蛋白对C57BL/6J小鼠骨髓源性树突状细胞迁移的影响

目的:探讨氧化修饰性脂蛋白对C57BL/6J小鼠骨髓源性树突状细胞(bone marrow derived dendritic cells,BM-DCs)迁移的影响。方法:制备C57BL/6J小鼠骨髓细胞悬液,利用树突状细胞专用分离液和细胞粘附性差异去除杂细胞,用rmGM-CSF和rmIL-4使其分化为BMDCs。采用流式细胞术检测BMDCs CD86和MHCⅡ的表达率、免疫荧光技术检测BMDCs CD11c的表达率,以此来鉴定获得细胞为实验所需要的BMDCs。实验分为PBS阴性对照组、LDL组、ox-LDL组、HDL组、oxHDL组和LPS阳性对照组,采用动物实验和Transwell迁移系统分别观察各实验组中BMDCs在体内外的迁移能力。结果:获得的BMDCs CD86、MHCⅡ和CD11c的表达率明显升高,是实验所需的细胞;与相应的脂蛋白组相比,其氧化脂蛋白处理的BMDCs组有更多的细胞发生迁移。结论:氧化脂蛋白可促进C57BL/6J小鼠BMDCs发生迁移。     

GSK-3β对小鼠骨髓树突状细胞成熟和功能的调控作用

目的探讨GSK-3β对小鼠骨髓树突状细胞（BMDC）成熟和功能的调控作用。方法脂多糖催熟BMDC,Western blotting
检测刺激前后糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）的磷酸化水平的改变;利用GSK-3β的选择性抑制剂SB216763处理BMDC,检测表
型、细胞因子表达和混合淋巴反应（MLR）的变化情况;构建过表达小鼠GSK-3β的慢病毒载体并转染DC2.4 细胞,Western
blotting检测过表达GSK-3β对调控树突状细胞（DC）成熟的关键调控因子鸟的网状内皮组织增生病毒癌基因相关B（RelB）蛋
白水平的影响。结果经脂多糖处理后,GSK-3βY216磷酸化水平下调,Ser9磷酸化水平显著上调,表明GSK-3β的活性显著下
降。抑制GSK-3β的活性能上调DC表面共刺激分子CD40和CD86的表达,削弱脂多糖诱导的促炎细胞因子IL-6和IL-12表达
上调,而对抗炎细胞因子IL-10的表达有促进作用,同时降低脂多糖诱导成熟的DC刺激同种异基因T细胞增殖的能力。在未成
熟的DC2.4细胞中,过表达GSK-3β能够下调RelB的水平。结论GSK-3β参与调控DC的成熟和功能,高活性的GSK-3β抑制未
成熟树突状细胞（iDC）的自发性成熟,GSK-3β失活后促进DC表型的成熟,而在脂多糖诱导DC分化的过程中GSK-3β发挥促炎
作用。GSK-3β能够下调RelB的蛋白水平,有望成为构建新型耐受性DC的新靶点。