耐拉米夫定乙肝病毒变异株的人工构建及其限制性片段长度多态性分析

目的 建立复合易行的筛检常见的耐拉米夫定乙肝病毒变异株的方法。方法 通过PCR定向点突变,构建最常见的耐拉米定乙肝病毒变异株（YMDD变异株）,并建立相应的错配PCR结合限制性片段多态性分析（RFLP）检测此变异株。结果 PCR成功引入点突变,构建了YMDDY为异株的克隆,同时错配PCR结合限制性片段长度多态性分析可有效区分YMDDY为异株和HBV野毒株。结论 采用PCR的方法可诱导定向点突变,错配PCR结合限制性片段长度多态性分析可用于筛检临床常见的耐拉米夫定乙肝病毒变异株（YMDD变异株）,为临床监测提供了一种很好的模式。     

耐拉米夫定乙型肝炎病毒变异株全基因组克隆及鉴定

目的:扩增并克隆耐拉米夫定乙型肝炎病毒(HBV)变异株全基因组DNA,为构建含双体HBV YMDDDNA质粒和HBV YMDD变异株细胞模型及研究药物筛选奠定基础。方法:从一名耐拉米夫定的慢性乙型肝炎病人血清中提取HBV病毒DNA,用错配PCR结合限制性片段长度多态性(RFLP)进行变异分析,然后采用PCR方法在HBV负链开环缺口处及基因组中单一酶切点(SpeⅠ)处,设计两对引物从两个方向分别扩增1.15 kb和2.05 kb的单链及双链DNA区,利用基因重组技术,将两片连接后克隆至质粒pcDNA3.1-中,再进行DNA序列测定。结果:错配PCR结合RFLP分析证实该病毒存在YVDD变异,通过两段法克隆出HBV全基因组,经序列分析所得为HBV YMDD变异株全基因组。结论:成功克隆出HBV YMDD变异株全基因组。     

应用错配PCR和限制性片段长度多态性分析技术检测HBV YMDD变异株

目的：建立简便易行的检测乙型肝炎病毒（HBV）多聚酶基因（P基因）上YMDD变异株的方法，评价运用拉米夫定治疗慢性乙型肝炎患对此变异的影响，方法：采用套式／错配聚合酶链反应（PCR）结合限制性片段长度多态性（RFLP）分析技术对108例治疗前HBV DNA（PCR）阳性正在拉米夫定治疗中的慢性乙型肝炎患者的HBV YMDD变异情况进行检测。结果：运用上述技术能有效区分HBV YMDD野生株和变异株，上述108例患者经拉米夫定治疗后，HBV DNA阴转者63例（58．3％），HBV YMDD野生株和变异株分别为23例（21．3％）和22例（20．4％），结论：建立的套式／错配PCR－RFLP分析技术可用于HBV YMDD变异株的临床监测，拉米夫定治疗慢性乙型肝炎患者可导致部分患者的HBV多聚酶基因上YMDD发生变异。     

HBV YMDD变异检测及其临床意义

应用错配引物聚合酶链反应 -限制性片段长度多态性 (mpPCR -RFLP)检测HBVYMDD变异株的方法。对3 5例用拉米夫定进行抗乙肝病毒治疗 ,观察治疗后可能出现YMDD变异的病人进行mpPCR -RFLP检测分析 ;其中 3 4例服药后HBVDNA反跳病人中 ,用mpPCR -RFLP检测HBVDNAYMDD变异 14例 ,其中YIDD 4例 ,YVDD 5例 ,YI/VDD3例 ,YI/MDD 1例 ,YV/MDD 1例 ,YMDD野生株 2 0例。 1例HBVDNA始终阳性的病例为YMDD野生株     

HBV YMDD变异与HBV-DNA水平的关系

目的 观察拉米夫定治疗慢性乙型肝炎病毒YMDD变异的产生与血清HBV-DVA水平的关系.方法 拉米夫定治疗慢性乙型肝炎患者106例,平均疗程32月(12～48月),治疗前及治疗中每4～6月采血,用荧光实时PCR定量检测HBV-DNA,采用错配聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析的方法检测HBVYMDD变异.分析出现YMDD变异组与非变异组治疗前HBV DNA水平差异.结果 YMDD变异组治疗前血清HBV DNA定量水平显著高于未产生YMDD变异(P＜0.01).结论 慢性乙型肝炎患者治疗前血清病毒载量水平越高,应用拉米夫定治疗越容易产生YMDD变异,且产生时间越早.血清病毒载量可作为应用拉米夫定治疗YMDD变异产生的早期预测指标.     

HBV耐拉米夫定多聚酶基因变异检测方法的建立

目的：建立一种简便，准确，实用的乙型肝炎病毒（HBV）耐拉米夫定多聚酶基因变异检测方法。方法：根据已公布的HBV DNA序列，在HBV多聚酶基因区设计合成了两对寡核苷酸引物，其中一只为错配引物；应用巢式错配聚合酶链反应（PCR）特异性扩增含有HBV多聚酶基因YMDD基序的片段，扩增产物用限制性内切酶（NdeI)酶切，琼脂糖凝胶电泳，观察酶切后目的片段的限制性片段长度多态性（RFLP）图谱，部分标本进行DNA测序。结果：（1）所建立的巢式错配PCR－RFLP法，从DNA提取到酶切后电泳分析仅需要11小时，灵敏度高，可以检测到10^3copies/ml的HBV DNA；特异性强，结果准确，经DNA测序证实。（2）检测20例长期服用拉米夫定的慢性乙型肝炎患者的系列血清，发现YMDD变异者（45％）9例，YMDD野毒株者（55％）11例 ，表明该法可有效地鉴别HBV YMDD野毒株与变异株。结论：本实验所建立的用于检测HBV耐拉米夫定多聚酶基因变异的巢式错配PCRRFLP方法简单，敏感，特异，适用于一般实验室及大规模的人群调查。     

HBV耐拉米夫定多聚酶基因变异检测方法的建立

目的建立一种简便、准确、实用的乙型肝炎病毒(HBV)耐拉米夫定多聚酶基因变异检测方法.方法根据已公布的HBV DNA序列,在HBV多聚酶基因区设计并合成了两对寡核苷酸引物,其中一只为错配引物;应用巢式错配聚合酶链反应特异性扩增含有HBV多聚酶基因YMDD基序的片段,扩增产物用限制性内切酶(Nde Ⅰ)酶切,琼脂糖凝胶电泳,观察酶切后的目的片段限制性片段长度多态性(RFLP)图谱.部分标本进行DNA测序.结果 (1)所建立的巢式错配PCR-RFLP方法操作简便,快速,从DNA提取到酶切后电泳分析仅需要11小时;灵敏度高,可以检测到103copies/ml的HBV DNA;特异性强,结果准确,经DNA测序证实.(2)应用该方法对20例长期服用拉米夫定的慢性乙型肝炎患者的系列血清进行了检测,发现YMDD变异者(45%)9例,YMDD野毒株者(55%)11例,表明该方法可有效地鉴别HBV YMDD野毒株与变异株.结论本实验所建立的巢式错配PCR-RFLP方法简单、敏感、特异,适合于一般实验室应用及大规模的人群调查.     

168例耐拉米夫定慢乙肝病毒的分布及临床研究

目的：观察耐拉米夫定乙肝病毒耐药株的分布、慢性乙型病毒性肝炎的临床表型。方法：用PCR产物直接测序检测拉米夫定治疗慢乙肝前后的YMDD变异，分析耐拉米夫定耐药株的分布及临床表型。结果：168例耐拉米夫定慢乙肝病例中4例为预存在突变株；164例为拉米夫定应用期间产生的耐药株，对其中病毒载量≥104拷贝／ml的128例耐药株作YMDD变异检测，YVDD变异42株、YIDD变异20株、其它变异66株。分属“指导意见”中临床情况良好，较轻与恶化的例数为8：108：12。在非YMDD变异组中的病毒载量中、高等级的例数分别是56，10，而YMDD变异组中、高等级的例数是45，4，临床表型重的病例数非YMDD变异组为10例，而YMDD变异组为2例。结论：慢性乙型肝炎的YMDD变异株可以是预存在的，部分YMDD变异株可能是由于因耐拉米夫定而选择性保留并成为优势株。非YMDD变异组的临床表型重于YMDD变异组。     

拉米夫定耐药毒株的P基因序列特点

目的探讨拉米夫定耐药毒株P基因序列特点。方法分析247例慢性乙型肝炎患者血清标本,利用PCR-RFLP筛检YMDD变异株,对YMDD变异阳性的部分患者标本进行P基因测序。结果应用PCR-RFLP筛检发现了42例感染YMDD变异株的患者,对其中的19例患者进行测序分析有10例除发生YMDD变异外还有P基因A-E区其他部位氨基酸的突变,有4种点突变同时在2个以上的患者中发生,包括rtL80I,rtG172E,rtG174C和rtG172E/rtG174C联合突变。结论拉米夫定耐药毒株除了常见的C区YMDD变异和B区rtL180M变异之外,还可以发生其他位点的突变,但这些位点的突变是否与拉米夫定耐药有直接关系还有待进一步证实。     

反向斑点杂交技术检测HBV YMDD基序变异 的应用和评价

 【目的】 采用反向斑点杂交技术对拉米夫定治疗后的慢性乙型肝炎患者血清中HBV YMDD基序变异进行检测,并对其临床应用进行方法学评价｡【方法】 提取242例慢性乙型肝炎患者血清中HBV DNA,经聚合酶链反应后进行膜条杂交并同测序比较分析检测结果的一致性,随后对该方法进行灵敏度和混合感染检测能力的评价｡【结果】 242例样本检测结果有236例与测序结果相符,反向斑点杂交检测结果同测序结果的符合率达97.5%;混合型感染58例,占样品总数的24%｡反向斑点杂交技术检测HBV YMDD基序变异的灵敏度达103 IU/mL,在病毒混合感染群体中能检测出约占10%的突变型病毒株｡【结论】 反向斑点杂交技术检测HBV YMDD基序变异具有简单､准确､经济实用的特点,具有很好的临床应用前景｡     

Prophylaxis of hepatitis B recurrence in post-liver transplantation patients with lamivudine-resistant YMDD mutant

Background The most frequently used therapy for post-transplantation recurrence of hepatitis B virus （HBV） infection is lamivudine, but this drug is associated with a high resistance rate due to YMDD mutant. In preliminary reports, adefovir dipivoxil （ADV） has been shown to have activity against lamivudine-resistant strains of HBV. However, clinical experience in treatment of HBV infection after liver transplantation （LT） is still not entirely clear. This study was aimed to evaluate the prophylactic efficacy of ADV plus hepatitis B immunoglobulin （HBIG） in patients with YMDD mutant before LT. Methods From March 2004 to March 2006, 16 patients with chronic hepatitis B had lamivudine-resistant YMDD mutants detected prior to liver transplantation and received treatment with ADV plus additional intramuscular HBIG after LT as prophylaxis against graft reinfection. Tests for liver function, serum HBsAg, anti-HBs （HBIG）, HBeAg, anti-HBc, anti-HBe, HBV-DNA, and creatinine were assessed pre- or post-liver transplantation. Results The median follow-up of these patients post-liver transplantation was 19.4 months. Fifteen patients survived and one patient died of recurrence of hepatocellular carcinoma （HCC）. There was significant difference （10.98% vs. 2.26%, P〈0.05） in YMDD mutant rate between the patients with HBV-DNA over 106 copies/ml and those with HBV-DNA less than 106 copies/mi. Fifteen patients （93.8%） had undetectable HBV-DNA at 4 weeks and 1 （6.3%） at 6 months after LT. No hepatitis B recurrence was detected by persistent testing of HBsAg, HBeAg, and HBV-DNA and no increase of serum creatinine level associated with ADV was observed in any of the patients. Conclusion ADV combined with intramuscular HBIG can effectively prevent patients with pre-transplantation YMDD mutant from HBV recurrence after LT.     

HBV拉米呋啶耐药相关基因及HBV基因分型的初步研究

目的：利用基因测序技术，根据HBV S基因序列和HBV P基因区YMDD基因序列的特征，建立一种既可以诊断HBV基因型，又能检测拉米呋啶耐药突变的简便、可靠的方法。方法：采用特异的引物对待检标本进行PCR扩增后作基因序列检测，利用Chromas2．23软件对测序结果进行分析有无突变产生，测序结果用软件DNASIS进行基因分型分析。结果：61例经拉米呋啶治疗的慢性乙肝患者B型11例（18％），C型50例（82％）。发生YMDD变异47例，变异检出率为77．0％。结论：该方法能同时检测HBV基因型和YMDD变异，可以通过准确的P基因序列测定区分YMDD变异的类型，并可根据需要监测其他的伴随突变，进一步进行核苷酸多态性分析，对临床治疗和病情监控均有指导意义。     

海南地区乙型肝炎基因型与YMDD自然突变的相关性

目的：了解海南地区未经抗病毒治疗的慢性乙型肝炎患者YMDD突变和乙型肝炎病毒基因型情况及两者之间的关系。方法：收集49例未使用抗病毒治疗的慢性乙型肝炎患者血清,采用酶联免疫吸附测定（ELISA）法检测乙肝病毒表面标志物,PCR-反向点杂交方法测定HBV突变及基因型。结果：49例患者中,检出B型8例（16．33％）,其中发生YMDD自然突变1例（12．5％）;C型34例（69．39％）,其中发生YMDD自然突变6例（17．65％）,YMDD自然突变的发生率C基因型与B基因型相比差异无统计学意义（P〉0．05）;同时两基因型之间乙肝标志物的比较差异无统计学意义（Jp〉0．05）。结论：海南地区慢性乙型肝炎患者中,优势基因型为C型。在未经抗病毒治疗的慢性乙型肝炎患者中存在YMDD变异株。     

HBV P基因YMDD变异的检测及临床应用的初步研究

目的采用错配PCR扩增方法进行HBVP基因YMDD变异的检测，对其临床意义进行初步的研究。方法应用分子克隆方法，构建YMDD、YVDD和YIDD变异的阳性质粒，并对该方法进行敏感性及特异性试验。对65例未经抗病毒治疗的乙型肝炎患者检测YMDD变异情况。结果经PCR方法、酶切鉴定及直接测序鉴定出YMDD、YVDD和YIDD质粒构建成功，且该方法具有较好的敏感性和特异性。65例未经拉米夫定治疗的乙型肝炎患者存在YMDD变异，出现变异6例，阳性率为9．07％；其中YIDD和YI／YMDD各1例，YVDD3例，YV／YMDD1例。结论本检测方法简便、实用，在未经抗病毒治疗的患者中可存在YMDD变异，其与野生株一样是自然存在的，抗病毒药物压力不是导致HBV YMDD变异的唯一因素。     

拉米夫定治疗慢性乙型肝炎的病原学研究

目的观察拉米夫定治疗对慢性乙肝患者体内HBVDNA的影响.方法对拉米夫定治疗组31例(po,100mg/d,25周)和对照20例组进行HBV DNA的斑点杂交和PCR半定量检测;未阴转者扩增含YMDD编码区的基因片段测序.结果拉米夫定治疗组4周、8周、24周、52周HBVDNA阴转率分别为55%、68%、80%、73%,远高于对照组(P＜0.05);治疗组的YMDD变异株检出率亦高于对照组.结论拉米夫定对HBV有较强的抑制作用,但同时诱发较多的YMDD变异.     

锁核酸探针多重荧光定量PCR检测HBV基因变异

[摘要] 目的 描述并评价锁核酸（locked nucleic acid,LNA）探针实时荧光定量聚合酶链反应（Real-Time PCR）检测乙型肝炎病毒（HBV）204位基因突变的方法及特点。方法 分别用直接测序法、锁核酸（LNA）探针实时荧光定量PCR检测109例接受拉米夫定（LAM）治疗6个月以上的慢性乙型肝炎患者的血清样本。结果 LNA探针实时荧光定量PCR能检测HBV野生型YMDD和其突变型YVDD,YIDD。而且,这种方法还可以检测HBV野生型和变异型的混合。LNA探针相比普通探针在检测野生型和突变型混合样本方面,更敏感,区分度更好。结论 LNA探针实时荧光定量PCR检测YMDD变异具有快速,灵敏,等特点,可以用于大量临床样本的快速筛查,在监测拉米夫定治疗疗效及发现新耐药突变型等方面具有广泛的应用前景。