药物实验湿疹离体模型的初步应用

目的利用干扰素-γ(IFN-γ)与抗Fas单克隆抗体(AntiFasmab)诱导角质形成细胞凋亡,模拟湿疹样皮炎的部分发病机制作为离体实验模型,研究中药单体人参皂甙化合物Ⅰ、Ⅱ的可能治疗作用.方法将IFN-γ、AntiFasmab作用于体外培养角质形成细胞colo-16,用流式细胞仪、倒置显微镜、荧光显微镜观察colo-16细胞凋亡情况及单体人参皂甙化合物Ⅰ、Ⅱ对colo-16凋亡的抑制作用.结果①流式细胞仪检测IFN-γ对colo-16细胞Fas抗原的表达有明显的上调作用.②colo-16表面Fas抗原的表达与其凋亡呈正相关.③IFN-γ、AntiFasmab二者联合作用于colo-16可诱导细胞凋亡,镜下可见典型的细胞凋亡形态学特征.④单体人参皂甙化合物Ⅰ、Ⅱ对colo-16的凋亡有部分阻断作用.结论①IFN-γ对角质形成细胞Fas抗原的表达有上调作用.②IFN-γ、AntiFasmab共同作用可诱导角质形成细胞凋亡.③单体人参皂甙化合物Ⅰ、Ⅱ可抑制角质形成细胞凋亡.     

γ—干扰素诱导角质形成细胞凋亡及其Fas抗原表达研究

目的：探讨γ－干扰素在银屑病发病中的作用。方法 通过流式细胞仪测定角持形成细胞中亚二倍体细胞含量、片段化DNA分析及AnnexinV法检测经γ－干扰素诱导的角质形成细胞凋亡;采用组织化学、流式细胞仪测定经γ－干扰素作用后的角质形成细胞Fas抗原表达。结果 γ－干扰素上调角质形成细胞Fas抗原表达（P＜0．01）,诱导角质形成细胞凋亡（P＜0．01）。结论 γ－干扰素可能通过上调角质形成细胞Fas抗原表达,进而诱导角质形成细胞凋亡而参与银屑病发病。     

γ—干扰素诱导角质形成细胞凋亡及其Fas抗原表达研究

目的：探讨γ－干扰素在银屑病发病中的作用。方法：流式细胞仪测定亚二倍体含量、片段化DNA分析、Annexin V凋亡检测法、免疫组织化学、间接免疫荧光流式细胞仪测定Fas抗原表达。结果：γ－干扰素上调角质形成细胞Fas抗原表达（P＜0．01）,诱导角质形成细胞凋亡（P＜0．01）,结论：γ－干扰素可能通过上调角质形成细胞Fas抗原表达,进而诱导角质形成细胞凋亡而参与银屑病发病。     

TNF-α、IFN-γ诱导人角质形成细胞β防御素的表达

目的:检测TNF-α、IFN-γ诱导HaCaT细胞β-防御素的表达。方法:用TNF-α、IFN-γ、TNF-α加IFN-γ干预HaCaT细胞后,RT-RCR方法检测hBD-2 mRNA、hBD-3 mRNA的表达。结果:TNF-α干预组HaCaT细胞中hBD-2 mRNA、hBD-3 mRNA,IFN-γ干预组HaCaT细胞中hBD-3 mRNA表达增高(P0.05),干预12 h时的表达量高于干预24 h时的表达量;TNF-α与IFN-γ联合干预HaCaT细胞12 h时,hBD-2 mRNA、hBD-3 mRNA表达量最高。结论:TNF-α能刺激人角质形成细胞产生hBD-2和hRD-3,而IFN-γ仅能诱导产生hBD-3。     

皮肤科学基础

20 0 12 834　 ︽-干扰素诱导角质形成细胞凋亡及其 Fas抗原表达研究 /张峻岭 (天津市长征医院皮肤科 )…∥中国皮肤性病学杂志 .- 2 0 0 1,15 (3) .- 16 3～ 16 4应用流式细胞仪测定角质形成细胞中亚二倍体细胞含量 ,片段化 DNA分析及 Annexin V法检测经 γ-干扰素诱导的角质形成细胞凋亡 ,并采用组化法、流式细胞仪测定经 γ-干扰素作用后角质形成细胞中 Fas抗原表达情况。结果表明 ,γ-干扰素可诱导角质形成细胞凋亡 ,并上调角质形成细胞中 Fas抗原的表达。提示 γ-干扰素可能通过上调角质形成细胞中 Fas抗原的表达 ,从而诱导角质形…     

磷酸二酯酶4抑制剂Hemay005对角质形成细胞炎性因子产生的影响

目的 为了探讨磷酸二酯酶4抑制剂Hemay005对体外培养的角质形成细胞株HaCaT细胞炎性因子产生的影响.方法 分别用重组人肿瘤坏死因子-α（rhTNF-α）、重组人干扰素-γ（rhIFN-γ）和312 nm窄波UVB诱导,采用MTT法检测Hemay005对HaCaT细胞增殖的影响,用ELISA法检测其对HaCaT细胞白细胞介素（IL）-8、sICAM-1和肿瘤坏死因子（TNF）-α产生的影响.结果 Hemay005对HaCaT细胞增殖及25 μg/L rhTNF-α诱导的IL-8产生无明显影响,但能剂量依赖性地抑制1 000 U/mL rhIFN-γ诱导的HaCaT细胞产生sICAM-1和124.2 mJ/cm2窄波UVB照射引起的HaCaT细胞产生TNF-α.结论 Hemay005可通过抑制角质形成细胞炎症因子的表达发挥抗炎作用.     

雷公藤内酯醇对HaCaT细胞IFN-γ信号转导途径的影响

目的 研究雷公藤内酯醇对人角质形成细胞永生化株HaCaT细胞中IFN-γ信号转导途径的影响。方法 不同浓度雷公藤内酯醇（10-10 ～ 10-7 mol/L）预处理HaCaT细胞2 h后,用重组人IFN-γ（rhIFN-γ,500 U/mL）刺激诱导细胞,在不同的时间收集细胞,提取细胞总蛋白,免疫印迹法检测IFN-γ信号途径中IFN-γ受体α（IFN-γRα）、磷酸化Janus激酶2（pJAK2）、细胞因子信号转导抑制因子1（SOCS1）表达情况。结果 10-8 mol/L及10-7 mol/L雷公藤内酯醇可明显抑制HaCaT细胞中IFN-γ诱导的IFN-γRα蛋白表达（P < 0.05,P < 0.05）;10-9 mol/L及10-8 mol/L雷公藤内酯醇可明显抑制IFN-γ诱导的pJAK2蛋白表达（P < 0.05,P < 0.05）。雷公藤内酯醇对IFN-γRα表达及JAK2磷酸化的抑制作用呈剂量依赖性,其半数抑制浓度（IC50值）分别为1.37 × 10-8 mol/L和2.83 × 10-9 mol/L。10-10,10-9,10-8 mol/L的雷公藤内酯醇作用HaCaT细胞2 h后可明显上调IFN-γ诱导的SOCS1蛋白表达（P < 0.05,P < 0.01,P < 0.01）,其半数有效剂量（ED50值）为3.32 × 10-11 mol/L。结论 雷公藤内酯醇可分别通过抑制HaCaT细胞中IFN-γRα表达、JAK2磷酸化以及上调SOCS1表达,从不同时相的3个环节,共同抑制HaCaT细胞中STAT-1磷酸化,从而抑制IFN-γ信号所诱导的多种炎症相关基因转录。这种抑制作用可能是雷公藤治疗银屑病等IFN-γ依赖性炎症性皮肤病有效的重要机制之一。     

凉血消沱汤对角质形成细胞凋亡的影响

目的研究自拟方剂凉血消疕汤对角质形成细胞株HaCaT的增殖凋亡及细胞周期的影响作用。方法用MTT法和Annexin-V/PI双标流式细胞术分别检测自拟方剂凉血消疕汤的水提取液对HaCaT细胞株增殖、凋亡的影响;PI单标流式细胞术测该方的水提取液对HaCaT细胞株细胞DNA分布的影响。结果自拟方剂凉血消疕汤对角质形成细胞株HaCaT具有明显的增殖抑制作用,其抑制增殖作用呈量效关系。凉血消疕汤作用48h可诱导HaCaT细胞凋亡,10mg/mL作用48h时HaCaT细胞凋亡率达(31.77±5.88)%。凉血消疕汤处理组HaCaT细胞株细胞周期发生变化,细胞周期G_1期增加,S期缩短。结论自拟方剂凉血消疕汤可通过调控细胞周期进程、诱导细胞凋亡而有效抑制HaCaT细胞株细胞增殖。     

抗角蛋白自身抗体对角质形成细胞凋亡的影响

目的 探讨抗角蛋白自身抗体(AK auto Ab)对角质形成细胞凋亡的影响。方法 以不同浓度AK auto Ab作用体外培养人角质形成细胞后,用光镜及透射电镜观察细胞形态变化、用流式细胞仪分析细胞周期变化以及提取角质形成细胞DNA作电泳特征分析。结果 AK auto Ab作用后培养的角质形成细胞光镜、电镜下形态发生凋亡特有的改变,出现核固缩、染色质凝聚,并形成凋亡小体;细胞周期分析图中出现凋亡峰;DNA电泳呈有一定间隔的梯状条带。结论 AK auto Ab对角质形成细胞的凋亡具有诱导作用。     

中波紫外线诱导皮肤角质形成细胞凋亡机制的研究进展

紫外线照射表皮后引起DNA损伤的表皮细胞通过日晒伤细胞(凋亡的角质形成细胞)的形成来清除。p53、Fas、Trp53等基因的表达促进角质形成细胞凋亡,而survivin的表达则抑制角质形成细胞凋亡。紫外线照射后皮肤可产生环丁烷嘧啶二聚体和6-4光产物,这两种光产物可以作为UVB诱导凋亡的起始信号。凋亡在清除DNA损伤的皮肤起着重要作用。在皮肤中通过凋亡清除DNA损伤的细胞,防止日光诱导癌变,而不是依赖于DNA损伤的校正修复。silibinin对中波紫外线引起人HaCaT永生化角质形成细胞凋亡具有双向调控作用。对UVB引起角质形成细胞凋亡的调控药物,值得进一步研究。     

紫外线照射对HaCaT细胞IL-12和IFN-γ受体表达的影响

目的：观察紫外线（UV）照射对HaCaT细胞起源的IL-12、IFN-γ的影响，为进一步阐述光敏性皮炎的发病机制提供依据。方法：以UVA和UVB照射人永生化表皮细胞（HaCaT打细胞），应用免疫组化SP法观察UV照射后HaCaT细胞表面IL-12、IFN-γ受体的表达情况，并以阳性细胞百分比半定量IL-12、IFN-γ在HaCaT细胞中的表达；同时应用ELISA方法检测细胞培养液中IL-12、IFN-γ的含量。结果：静息状态下，HaCaT细胞低水平表达IL-12R、IFN-γR，上清液中IL-12、IFN-γ呈低水平表达或检测不出；UV照射HaCaT细胞后12h，细胞表面IL-12R、IFN-γR及上清液中的IL-12、IFN-γ与照射前无明显差异。结论：紫外线照射后角质形成细胞产生细胞因子致T细胞亚群失衡与光敏性皮炎的相关性，有待进一步探讨。     

葡萄球菌性超抗原对银屑病患者外周血淋巴细胞产生白介素-2、γ-干扰素的影响

银屑病患者外周血淋巴细胞对葡萄球菌性超抗原（葡萄球菌肠毒素B，SEB)和链球菌超抗原刺激反应增强，且经SEB刺激的银屑病患者外周血淋巴细胞(PBLC)培养上清液可促进角质形成细胞增殖，表达HLA-DR和Fas抗原，继而诱导细胞凋亡。为了进一步探讨培养上清液对角质形成细胞的作用机制，笔者检测了SEB刺激前后的银屑病患者淋巴细胞培养上清液中白介素(IL）-2、γ-干扰素（IFN-γ)的水平变化，现将结果报告如下。     

小檗碱衍生物HB-13对角质形成细胞分泌IFN-γ的影响

目的研究小檗碱衍生物HB一13对人永生化角质形成细胞（HaCaT细胞）分泌γ干扰素（IFN叫）的影响,探讨HB-13的抗炎机制。方法采用四甲基偶氮唑蓝法确定HB-13作用于HaCaT细胞的安全浓度;细胞经P物质刺激后,加入不同浓度的HB-13分别孵育12、24、48h,应用酶联免疫吸附法（ELISA）检测培养上清液中IFN-γ的含量,应用实时荧光定量PCR法检测细胞内IFN-γmRNA表达情况。结果HB-13浓度为2．5、5、10μg／ml对HaCaT细胞毒性作用不显著,并可促进P物质诱导的IFN-γ的分泌。结论促进表皮细胞分泌IFN-γ可能是HB-13在皮肤局部发挥抗炎作用的机制之一。     

进行性斑状色素减少症发病机制初步探讨

目的探讨进行性斑状色素减少症(progressive macular hypomelanosis,PMH)患者皮损中分离出的痤疮丙酸杆菌对人角质形成细胞(human keratinocytes,HaCaT)细胞分泌干扰素(interferon,IFN)-γ、白细胞介素(interleukin,IL)-6、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α的影响。方法体外培养HaCaT细胞株,分别加入分离自PMH的痤疮丙酸杆菌、痤疮丙酸杆菌标准菌株(NCTC737),酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)方法测定细胞上清液中IFN-γ、IL-6、TNF-α的分泌量。结果 PMH患者中分离的痤疮丙酸杆菌与角质形成细胞HaCaT细胞株共培养后,能促进角质形成细胞分泌IFN-γ和IL-6,与空白组比较,有明显升高,差异有统计学意义(P0.05);与痤疮丙酸杆菌标准菌株NCTC737相比也升高,差异有统计学意义(P0.05)。结论进行性斑状色素减少症皮损中分离出的痤疮丙酸杆菌可刺激HaCaT细胞分泌IFN-γ、IL-6、TNF-α,提示可能是皮损色素减退的原因之一。     

IFN-γ体外诱导沙眼衣原体持续性感染细胞模型的建立

目的：建立γ－干扰素（ IFN-γ）体外诱导沙眼衣原体持续性感染的细胞模型。方法：衣原体感染McCoy细胞,实验组加入0.5 ng／mL IFN-γ诱导沙眼衣原体,对照组无IFN-γ诱导,空白组为正常培养的McCoy细胞,培养72 h后通过光学显微镜、荧光显微镜、电子显微镜分别观察诱导后衣原体的细胞形态。实验组72 h解除IFN-γ诱导,继续培养48 h,观察衣原体细胞形态学变化。结果：实验组在0.5 ng／mL IFN-γ作用72 h后,碘液染色发现衣原体包涵体的数量比对照组减少,包涵体变小;荧光抗体染色显示衣原体包涵体质地疏松,染色不均匀;透射电子显微镜可见包涵体变小和网状体体积增大等特征的典型异形包涵体。去除IFN-γ作用后,包涵体内致密的EB颗粒数量增加。对照组培养72 h后碘液染色和荧光染色可见典型包涵体,透射电子显微镜可见典型的网状体和原体,充满整个包涵体。结论：成功建立了IFN-γ体外沙眼衣原体持续性感染的细胞模型,为进一步进行沙眼衣原体持续性感染形成机制的研究奠定了基础。     

大麻素2型受体激动剂JWH133对人永生化角质形成细胞体外增殖以及细胞因子表达影响的研究

目的探讨JWH133对人永生化角质形成细胞(HaCaT细胞)体外增殖以及经肿瘤坏死因子(TNF)-α诱导后细胞因子表达的影响。方法首先用不同浓度JWH133(15、30、60μmol/L)分别作用于Ha Ca T细胞。采用CCK-8法检测JWH133作用12、24、36 h后对HaCaT细胞体外增殖的影响,流式细胞仪检测JWH133对HaCaT细胞凋亡率的影响。其次采用抗体芯片检测技术分别检测20 ng/ml TNF-α组、20 ng/ml TNF-α+30μmol/L JWH133组中细胞因子表达的变化,并采用双抗体夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)法进行定量分析,以验证抗体芯片检测结果的可靠性。结果 15、30、60μmol/L JWH133作用12、24、36 h后对HaCaT细胞体外增殖均有不同程度的抑制作用。随着时间延长和JWH133浓度的增加,JWH133对HaCaT细胞体外增殖的抑制作用均逐渐增强(F=187.1、2678.9,P 0.05)。60μmol/L JWH133作用24 h后,凋亡率由(4.34±0.07)%(阴性组)增加至(21.77±0.40)%(JWH133组)(P 0.05)。20 ng/ml TNF-α能够诱导HaCaT细胞不同程度增加白细胞介素19(IL-19)、IL-22、IL-23等细胞因子的高表达,而30μmol/L JWH133处理后可降低上述细胞因子的表达。结论大麻素2型受体激动剂JWH133可抑制HaCaT细胞体外增殖、促进凋亡,且能够抑制TNF-α诱导的HaCaT细胞中一些重要免疫分子的表达。     

维胺酯对HaCaT细胞增殖和分化的影响

目的 探讨维胺酯对体外培养角质形成细胞(HaCaT细胞)增殖和分化的影响.方法 将浓度为2,5,10,15,20,25,30 μg/mL的维胺酯作用于培养的HaCaT细胞,采用MTT法检测维胺酯对HaCaT细胞体外增殖的影响,流式细胞仪测定细胞周期及凋亡率变化,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)半定量检测分化标记物角蛋白10及内披蛋白mRNA的表达水平.结果 2 μg/mL维胺酯处理的HaCaT细胞,48 h时表现出对细胞增殖的抑制作用,随着时间延长和药物剂量加大,抗增殖作用愈明显;当药物质量浓度达到30 μg/mL时,48 h和72 h时的抑制率分别为57.67%和82.00%.与对照组相比,经维胺酯作用48 h后,细胞G₁期比例显著增加,S期与G₂期比例则显著下降,并可抑制G₁/G₂期转换,但对细胞凋亡无影响.细胞内披蛋白mRNA表达水平随维胺酯处理浓度增高而上升,药物浓度达30μg/mL时,表达水平由对照组的40.80%增高至156.12%;而角蛋白10 mRNA表达水平则下降,由96.46%降至14.60%.结论 维胺酯具有抑制角质形成细胞增殖及诱导其分化的作用.     

凉血活血复方对体外培养HaCaT细胞增殖和凋亡的影响

目的观察中药凉血活血复方水醇粗提液对人永生化表皮细胞(HaCaT)的增殖抑制效应和诱导细胞凋亡作用的影响,探讨该复方治疗银屑病的可能机制。方法将不同浓度的凉血活血复方水醇粗提液分别作用于体外培养的HaCaT细胞,采用MTT法检测凉血活血复方水醇粗提液对细胞的增殖抑制作用以及药物的有效浓度;采用倒置显微镜、透射电子显微镜观察细胞处理前后的形态学改变:流式细胞术检测细胞周期的变化及凋亡比率。结果凉血活血复方以时间和浓度依赖性方式抑制HaCaT细胞增殖,作用24、48、72h其IC50分别为155.83 mg/mL、71.57mg/mL,41.27 mg/mL。细胞形态学和流式细胞仪检测发现药物以浓度依赖性的方式干扰细胞周期、诱导细胞凋亡,细胞分裂周期阻皆滞于G2/M期。结论凉血活血复方可能通过抑制角质形成细胞的增殖、诱导其凋亡而治疗银屑病。     

喜树碱抑制HaCaT细胞增殖、诱导凋亡及对端粒酶活性的影响

目的探讨喜树碱对HaCaT细胞抑制增殖、诱导凋亡的作用及对端粒酶活性的影响。方法将不同浓度的喜树碱作用于HaCaT细胞24,48和72 h,用MTT法、光镜、电镜和流式细胞仪检测其对细胞的增殖抑制和凋亡诱导作用;TRAP-ELISA法检测其对细胞端粒酶活性的影响。结果喜树碱能以时间和浓度依赖性的方式抑制HaCaT细胞增殖,作用24,48,72 h的最大抑制率分别为85.1%,94.3%,98.6%;且能以浓度依赖性的方式诱导HaCaT细胞凋亡,将细胞阻止于S期,并使细胞表现出典型的凋亡形态学特征,在诱导凋亡和低于诱导凋亡的浓度下均可抑制细胞端粒酶活性。结论喜树碱抗银屑病的机制与抑制角质形成细胞增殖、诱导凋亡有关,其作用可能是通过抑制端粒酶活性来实现的。     

龙胆泻肝汤激活Bax/Caspase-3通路并诱导人角质形成细胞凋亡

目的：明确龙胆泻肝汤对人角质形成细胞株HaCaT细胞凋亡的影响。方法：Tunel法检测龙胆泻肝汤对HaCaT细胞凋亡的影响; DAPI染色后荧光显微镜观察HaCaT细胞凋亡形态变化; Western blot检测分析HaCaT细胞凋亡相关蛋白表达。结果：龙胆泻肝汤处理组HaCaT细胞形态发生了明显变化，凋亡比例明显高于未处理细胞组。龙胆泻肝汤作用于HaCaT细胞后活化的caspase-3和Bax的表达明显上调， Bcl-2蛋白表达下降。caspase-3特异性抑制剂Z-DEVD-FMK预处理后可降低龙胆泻肝汤诱导的细胞凋亡。结论：龙胆泻肝汤能明显诱导人角质形成细胞的凋亡，其机制可能与下调Bcl-2的表达，增高Bax和caspase-3的表达有关。