脂肪干细胞促进人表皮角质形成细胞创面模型愈合的研究

目的 探讨脂肪干细胞(ADSCs)促进人表皮角质形成细胞(HEKa)创面模型愈合的可能性.方法 体外培养大鼠ADSCs(rADSCs)(n=10).实验组为rADSCs与HEKa直接共培养组(n=10),对照组为在transwell培养板建立的rADSCs与HEKa间接共培养(间接组,n=8)和单纯HEKa培养组(单纯组,n=8).刮擦生长融合成片的HEKa细胞制备创面.培养24、48、72 h后,计数迁移到创面的HEKa细胞数量并计算创面愈合率,检测HEKa细胞吸收脱氧胸腺嘧啶核苷的放射活性以判定HEKa细胞的增殖活性.结果 实验组、间接组、单纯组在伤后24 h分别有(9.2±0.2)、(5.0±0.3)、(4.2±0.3)个细胞/高倍视野;48 h分别有(58.5±0.4)、(26.5±0.3)、(20.7±0.5)个细胞/高倍视野;72 h分别有(125.8±0.4)、(43.0±0.5)、(35.6±0.5)个细胞/高倍视野越过创缘进入创面,实验组均明显优于两对照组(P<0.05).三组创面愈合率在伤后72 h分别为61.0% ±3.0% 、35.0% ±2.5% 、32.0% ±2.1% ,实验组均明显优于两对照组(P<0.05).脱氧胸腺嘧啶核苷掺入培养基法表明三组HEKa细胞的放射性强度为(1440±210)、(1050±280)、(1130±390)cpm/105细胞,实验组与两对照组之间差异有统计学意义(P<0.05).结论 rADSCs通过直接接触促进HEKa细胞的分裂增殖和迁移.     

骨髓间充质干细胞对自然衰老小鼠T细胞的调节作用研究

目的：研究探讨小鼠骨髓间充质干细胞对自然衰老小鼠T细胞的节作用影响情况。方法：通过流式细胞术研究对比衰老小鼠和年轻小鼠T细胞培养48h后CD8＋CD28＋的共表达率差异,根据以上研究结果分别对比隔离共培养组、混合共培养组和对照组之间T细胞上CD8＋CD28＋的共表达率差异。结果：实验一中衰老组培养48h后CD8＋CD28＋共表达率为（4.08±0.3493）%,年轻组培养48h后CD8＋CD28＋共表达率为（5.04±0.5741）%。两者相比有统计学差异（P〈0.05）。实验二隔离共培养组中骨髓间充质干细胞与淋巴细胞以1：1在Transwell系统中共培养,48h后其对应的CD8＋CD28＋共表达率为（10.26±1.0784）%,混合共培养组中骨髓间充质干细胞与淋巴细胞以1：1比例在六孔板中共培养,48h后CD8＋CD28＋共表达率为（6.42±1.5680）%。对照组中淋巴细胞以106数量进行培养,48h后CD8＋CD28＋共表达率为（4.08±0.3493）%。两两对比有统计学差异（P〈0.05）。结论：衰老小鼠和年轻小鼠的T细胞在CD8＋CD28＋的共表达比例上存在差异。骨髓间充质干细胞能够通过分泌的某些细胞因子使这种衰老的T细胞变得趋向于＂年轻态＂。     

汗腺细胞与骨髓间充质干细胞共培养过程中基因表达变化及意义

目的建立人骨髓间充质干细胞（hMSCs）与人汗腺细胞（hSGCs）共同培养模式，检测融合细胞的基因表达变化，探讨hMSCs的可塑性分化机制。方法分离纯化并体外扩增hSGCs和hMSCs；采用在47℃环境下热休克hSGCs 40min建立hMSCs与hSGCs共培养模式并观测细胞形态学变化；免疫细胞化学双染和RT-PCR等方法检测融合细胞的基因和蛋白表达特征。结果共培养后镜下可见产生融合细胞，细胞形态发生渐变，表现为细胞体积增大，形状不规则，多核和异型核，胞核相互靠近，约占细胞总数的约10％左右。采用抗癌胚抗原（CEA）和抗BrdU免疫细胞化学双染法，检测BrdU标记的hMSCs与hSGCs共培养后的融合细胞，证实该类细胞具有两种细胞的独特的免疫特性；与汗腺发生形成密切的基因EGF和EGFR出现高丰度的表达（P〈0．05）。结论热休克共培养后hMSCs具有在形态学和分子水平上向hSGCs分化的潜能，细胞融合现象丰富了皮肤创面修复和汗腺再生理论。     

人骨髓基质细胞表面标志的研究

目的 研究人骨髓基质干细胞经体外培养后细胞的表型.方法 8例成年志愿者(无系统性疾病,20-40岁)髂前上嵴骨穿法得人骨髓,密度梯度法分离骨髓基质干细胞(human bone marrow mesenchymal stem cell,hMSC),单纯DMEM培养液,分别培养至第2代细胞,免疫荧光和流式细胞仪鉴定hMSCs细胞表型,CD105,CD166,CD29的表达.结果 第二代细胞可见明显CD105,CD166,CD29表达,第二代细胞CD105阳性率78±6%,CD166阳性率43±7%,CD29阳性率69±12%.结论 人MSC体外经传代培养后可表达干细胞特征表型.     

乙型肝炎肝硬化并发细菌感染患者外周血调节性T细胞动态变化及临床意义

目的探讨乙型肝炎肝硬化失代偿期并发细菌感染患者调节性T（Treg）细胞比例及活性的变化情况。方法选取2009年1月-2011年12月武汉大学人民医院30例乙型肝炎肝硬化失代偿期并发细菌感染患者,20例乙型肝炎肝硬化失代偿期无细菌感染患者及10名健康对照者,应用密度梯度离心法分离外周血单个核细胞（PBMC）。应用流式细胞术检测各组患者PBMC中CD4^＋CD25^＋ CD127^low Treg细胞占CD4^＋细胞的比例。通过单向混合淋巴细胞反应（MLR）,观察从各组患者PBMC中分离的CD4^＋CD25^＋CD127^low Treg细胞抑制淋巴细胞增殖的能力变化。采用One—way ANOVA及t检验进行统计学分析。结果乙型肝炎肝硬化失代偿期并发细菌感染患者PBMC中Treg细胞占CD4^＋细胞的比例明显低于乙型肝炎肝硬化失代偿期无细菌感染患者[（4．07±1．18）％w．（9．74±3．00）％,t=9．35,P〈0．01]。加入乙型肝炎肝硬化失代偿期并发细菌感染患者分离得到的Treg细胞的MLR,Treg细胞抑制同源性PBMC增殖能力被明显削弱,cpm=（22．79±4．94）×10^3,与乙型肝炎肝硬化失代偿期无细菌感染患者以及健康对照者比较差异均有统计学意义[cpm=（6．43±1．19）×10^3和（5．96±1．25）×10^3,t=16．09和16．51,P均〈0．01]。结论乙型肝炎肝硬化失代偿期并发细菌感染患者存在Treg细胞数量及活性下降。     

滤泡液中自然杀伤细胞活化与卵胞浆内单精子注射结局的探讨

目的探讨滤泡液中CD56^＋自然杀伤（NK）细胞及活化的CD56^＋NK（CD56^＋CD69^＋NK）细胞的比例与不育患者卵胞浆内单精子注射（ICSI）结局的关系。方法应用流式细胞仪分析成熟滤泡液中CD56^＋NK细胞及活化的CD56^＋NK细胞的比例,与ICSI治疗结果的相关性。结果妊娠患者的滤泡液中平均CD56^＋NK细胞及活化的CD56^＋NK细胞分别为（18．8±2．8）％和（1．6±0．8）％,而未妊娠患者的滤泡液中其分别为（37．4±5．8）％和（4．7±1．9）%,均显著高于妊娠组（P〈0．05）。结论接受ICSI助孕治疗患者的成熟滤泡液中CD56^＋NK细胞及活化的CD56^＋NK细胞的比例较低者易获临床妊娠。     

胃癌患者外周血调节性T细胞的多种细胞因子水平的检测及其意义

目的探讨细胞因子在CD4^＋CD25^＋调节性T细胞免疫抑制机制中的作用，观察胃癌患者外周血中的CD4^＋CD25^＋调节性T细胞及其效应性T细胞CD4^＋CD25^-T细胞产生具有不同生物活性的细胞因子的水平。方法采用免疫磁珠分选方法分离胃癌患者外周血中的CD4^＋CD25^＋T细胞与CD4^＋CD25^-T细胞后，将CD4^＋CD25^＋T细胞与效应性T细胞CD4^＋CD25^-T细胞在体外分别单独培养及按不同比例共同培养后，再用酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测单独及混合培养时细胞因子干扰素（IFN）-γ、白细胞介素（IL）-10及转化生长因子（TGF）-β分泌的水平。结果健康对照及胃癌患者CD4^＋CD25^＋T细胞分泌抑制性细胞因子IL-10、TGF-β均显著高于CD4^＋CD25^-T细胞，而分泌细胞因子IFN-γ均显著低于CD4^＋CD25^-T细胞（P〈0．01）。CD4^＋CD25^＋T细胞在体外可明显抑制CD4^＋CD25^-T细胞产生IFN-γ的能力，且这种抑制能力呈效靶比关系（P〈0．01）；但CD4^＋CD25^＋T细胞与效应性T细胞CD4^＋CD25^-T细胞在体外共培养对IL-10及TGF-β的分泌无显著影响（P〉0．01）。结论CD4^＋CD25^＋调节性T在体外可能通过细胞因子的调节发挥对效应性T细胞的抑制作用。     

CD4+ CD25+ Treg细胞延长大鼠肾移植术后存活时间的量效关系分析

目的观察肾移植受者（Wistar大鼠）应用供者（SD大鼠）抗原特异性CD4^＋CD25^＋免疫调节性T细胞（CD4^＋CD25^＋Treg细胞）对移植肾存活时间的影响，为CD4^＋CD25^＋Treg细胞在体内应用提供定量分析依据。方法SD大鼠为供者，Wistar大鼠为受者，建立同种肾移植动物模型；免疫磁珠（MACS）法分选Wistar大鼠脾脏CD4^＋CD25^＋T细胞，检测CD4^＋CD25^＋Foxp3^＋T细胞的纯度，并诱导其对SD大鼠供者抗原的特异性表型；根据在肾移植术中经受者尾静脉注射不同数量（2×10^5、5×10^5、1×10^6、2×10^6）的供者抗原特异性CD4^＋CD25^＋T细胞分为：实验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组，并以未注射组作为对照。术后观察移植肾的存活时间；监测血肌酐（cr）的水平；按照BanffSchema标准进行移植肾病理诊断，并根据Watanabe的方法进行半定量评分。结果肾移植术后实验Ⅲ组平均存活时间最长，为（31．4±4．6）d，对照组平均存活时间最短，为（11．7±6．2）d；各实验组与对照组间血Cr检测结果比较，差异均有统计学意义（P〈0．05）；实验Ⅲ组和Ⅳ组不同时段的移植肾病理检查半定量评分结果与对照组比较，差异均有统计学意义（P〈0．05）。结论初步证实在受者体内应用适当数量的供者抗原特异性CD4^＋CD25^＋Treg细胞，能够改善移植肾的功能，有效延长大鼠肾移植术后的存活时间。     

微载体立体培养腰椎间盘细胞蛋白多糖表达的研究

目的研究腰椎间盘细胞在微载体培养与单层培养中细胞表达蛋白多糖含量的差别。方法椎间盘疾病手术病例的术中切除组织采用酶消化法分别进行微载体三维细胞培养和单层细胞培养；取胎儿椎间盘组织，显微镜下区分髓核细胞和纤维环细胞，分别进行培养，同成入组对照。利用^35S放射标记渗入放免定量测定的方法进行蛋白多糖含量的检测。结果①椎间盘细胞胞内的蛋白多糖含量（cpm），细胞单层培养组为101．909±11．439，微载体立体培养组为136．607±10．792，P〈0．05；②椎间盘细胞表达的蛋白多糖含量（cpm），细胞单层培养组为105．119±13．040，微载体立体培养组为174．231±17．676，P〈0．05；③各组椎间盘细胞表达的蛋白多糖含量均高于细胞内的含量；④胎儿腰椎间盘细胞蛋白多糖的含量及表达量均高于成人退变椎间盘细胞，胎儿髓核细胞蛋白多糖的表达量高于纤维环细胞的表达量。结论椎间盘细胞的微载体三维立体培养相对单层培养具有较高细胞蛋白多糖的表达量，是一种较好的细胞培养方式。     

骨髓间充质干细胞移植联合透壁心肌打孔复合缓释支架在急性心肌梗死血运重建中的作用

目的探讨骨髓间充质干细胞（MSCs）移植联合透壁心肌打孔复合缓释支架对急性心肌梗死后血运重建的作用,为临床外科治疗心肌梗死提供依据。方法建立猪急性心肌梗死模型后,将24只猪采用随机数字表法分为4组,每组6只,对照组：单纯建立心肌梗死模型;MSCs组：心肌梗死后移植MSCs;透壁打孔再生血管术（TMDR）加支架组：心肌梗死后打孔加复合碱性生长因子（bFGF）肝素化缓释抗凝支架置入;MSCs联合TMDR加支架组：心肌梗死后打孔加复合bFGF的肝素化缓释抗凝支架置入联合MSCs移植。实验后3个月检测、分析4组的梗死区域心肌梗死面积和血管密度。结果术后3个月,病理组织学检测显示,MSCs组、TMDR加支架组和MSCs联合TMDR加支架组梗死面积均较对照组明显减少（27.9%±3.1%vs.48.9%±2.7%,P=0.000;20.3%±1.7%vs.48.9%±2.7%,P=0.000;12.5%±1.9%vs.48.9%±2.7%,P=0.000）,血管密度均有不同程度的增加（8.4±1.2个/高倍视野vs.4.5±1.4个/高倍视野,P=0.001;11.5±2.6个/高倍视野vs.4.5±1.4个/高倍视野,P=0.001;15.6±1.4个/高倍视野vs.4.5±1.4个/高倍视野,P=0.000）;其中MSCs联合TMDR加支架组梗死面积的减少和血管密度增加的程度较MSCs组和TMDR加支架组更明显（P=0.010,0.020）。结论MSCs移植联合TMDR加复合bFGF的肝素化缓释抗凝支架置入能减少心肌梗死面积,增加心肌梗死区域血管密度,从而提高MSCs移植在急性心肌梗死中的治疗作用,为临床外科治疗心肌梗死提供了新的治疗思路。     

不同传代次数大鼠骨髓间充质干细胞移植促进糖尿病大鼠创面愈合的研究

目的：探讨骨髓间充质干细胞（BMSCs）在体外培养扩增过程中引起的老化对其修复糖尿病慢性创面功能的影响。方法：从大鼠股骨骨髓中分离培养BMSCs,流式细胞分析仪鉴定细胞表型,成骨、成脂诱导鉴定其分化能力。取第5、15、25、35和45代（P5、P15、P25、P35和P45）BMSCs,0.25%的胰酶消化后制备1×10^6/m1单细胞悬液。腹腔注射65 mg/kg链脲佐菌素建立糖尿病SD大鼠模型,8周后,在SD大鼠背部左右两侧用打孔器制备直径1.2 cm的圆形创面。将70只糖尿病慢性创面模型大鼠随机分为7组,分别经尾静脉注射1 ml的P5、P15、P25、P35和P45 BMSCs单细胞悬液（1×10^6/m1）,1 ml成纤维细胞（Fb）悬液（1×10^6/m1）和1 ml生理盐水。分别于伤后3、7、14、21 d计算创面愈合率,并取创面组织制备切片,苏木精-伊红（HE）染色,光学显微镜下观察组织病理学变化及血管生成情况。结果：糖尿病SD大鼠创面较正常大鼠创面愈合延迟（P〈0.05）。伤后14 d,各BMSCs移植组与Fb组和生理盐水组比较,创面收缩与再上皮化明显,镜下可见成纤维细胞生长活跃、数量多,各BMSCs移植组间无明显差异。伤后14 d,各BMSCs移植组创面愈合率较Fb组和生理盐水组增加,以P5 BMSCs移植组变化最显著（P〈0.05）。伤后7 d,各BMSCs移植组微血管密度均显著高于Fb组和生理盐水组（P〈0.01）,以P5 BMSCs移植组效果最为显著。结论：全身注射异体BMSCs可促进糖尿病创面愈合。BMSCs在体外长期扩增传代可减少其创面修复能力,其对糖尿病创面的修复作用以P5以内干细胞较好。     

反复自然流产患者外周血CD4~+CD25~+调节性T细胞的检测

目的:探讨CD4+CD25+调节性T细胞(Tr)在反复自然流产发病机制中的作用。方法:应用流式细胞术检测29例原因不明的反复自然流产妇女(URSA组)和20例正常妊娠妇女(正常对照组)外周血中CD4+CD25+Tr的比例。结果:URSA组外周血中CD4+CD25brightTr百分率[(1.98±0.96)%]显著低于正常对照组[(3.21±1.25)%,P<0.05],而2组间CD4+CD25+总百分率、CD4+CD25dim细胞百分率以及CD4+CD25bright/CD4+比值均无显著性差异(P均>0.05)。结论:URSA的发生可能与患者CD4+CD25brightTr比例下降有关,CD4+CD25brightTr在母胎免疫耐受中发挥重要作用。     

NOD小鼠未成熟树突状细胞体外诱导淋巴细胞生成并扩增调节性T细胞的研究

目的 探索非肥胖糖尿病(non-obese diabetic,NOD)小鼠未成熟树突状细胞(immature dendritic cell,imDC)诱导并扩增调节性T细胞(regulatory T cells,Treg)的优化方案.方法 分离、培养NOD小鼠骨髓来源的imDC和淋巴细胞,并进行混合淋巴细胞培养,分别加...     

宫颈上皮内瘤变患者淋巴细胞亚群的分析

目的了解宫颈上皮内瘤变(CIN)患者全身细胞免疫功能的变化。方法用特异性荧光标记素,通过流式细胞术对38例CIN患者及20例健康对照组的外周血中T淋巴细胞亚群进行检测。结果随着病变级别加重,CIN患者的CD4+T细胞比例逐渐下降,而CD8+T细胞比例逐渐增加,但差异无统计学意义。与健康对照相比,CIN2患者和CIN3患者的CD4+T细胞/CD8+T细胞的比值下降,分别是(1.46±0.43)、(1.05±0.52)和(0.99±0.58),差异有统计学意义。CD8+T细胞的激活亚群,CD4+T细胞和CD8+T细胞的纯真亚群、记忆亚群在各组之间没有明显的统计学差异。CIN3患者的CD4+T细胞中的激活亚群[(17.8±6.1)%]与健康对照组[(11.5±5.4)%]有显著性差异。结论 CIN患者的全身细胞免疫功能出现异常,为免疫治疗干预癌前病变发展提供了理论基础。     

改良负压封闭引流技术治疗糖尿病足的疗效观察

目的:观察应用改良负压封闭引流(VSD)技术治疗糖尿病足的效果.方法:将糖尿病足40例患者随机分为对照组和治疗组.对照组应用传统VSD技术治疗,治疗组应用改良VSD技术治疗,即在VSD敷料中增加一根冲洗管,经冲洗管每日1次注入呋喃西林500 ml和表皮生长因子30 ml,30 min后关闭冲洗管,开启负压.于治疗10 ...     

血清微环境对小鼠T细胞衰老的调节作用

目的：探讨血清微环境对小鼠T细胞衰老的调节作用。方法：分别取年老（12～14月龄）及年轻（1.5～2月龄）小鼠各10只,提取其脾脏淋巴细胞及血清,实验分4组。组I为年老鼠T淋巴细胞＋10%年轻鼠血清;组II为年老鼠T淋巴细胞＋10%年老鼠血清;组III为年轻鼠T淋巴细胞＋10%年轻鼠血清;组IV为年轻鼠T淋巴细胞＋10%年老鼠血清。培养48h后,经流式细胞术研究CD8＋CD28＋共表达率差异。结果：组I和组II T细胞表面的CD8＋CD28＋共表达率分别是（10.84±0.6841）%和（3.18±0.1789）%,组III和组IV T细胞表面的CD8＋CD28＋共表达分别是（12.5±0.9445）%和（8.36±0.2074）%。各组间对比有统计学差异（P〈0.05）结论：血清微环境具有调节小鼠T细胞衰老的作用,年轻鼠血清能使年老鼠的T细胞表面的CD8＋CD28＋共表达率提高,年老鼠的血清能使年轻鼠的T细胞表面的CD8＋CD28＋共表达率降低。     

应用一次性包皮环切缝合器与袖套式包皮环切术的临床疗效对比研究

目的:比较分析应用一次性包皮环切缝合器与袖套包皮环切术的临床疗效和手术并发症。方法:106例包皮过长(或包茎)患者按手术日期单双号分为一次性包皮环切缝合器组(50例)与袖套式包皮环切术组(56例)。比较两组患者的手术时间、术中出血量、术中疼痛程度、术后疼痛程度、切口愈合情况及术后并发症。结果:一次性包皮环切缝合器组与袖套式包皮环切术组手术时间分别为(31.38±2.93)min和(11.82±1.96)min;术中出血量分别为(1.14±0.94)ml和(7.89±2.31)ml;术中疼痛评分分别为(0.80±0.70)分和(3.02±1.22)分;术后24小时疼痛评分分别为(1.90±0.80)分和(4.45±1.03)分;术后并发症发生率分别为4.0%(2/50)和17.87%(10/56);切口愈合时间分别为(14.06±1.15)d和(14.39±1.57)d;外观满意率分别为98%(49/50)和83.93%(47/56)。与袖套式包皮环切组相比,一次性包皮环切缝合器组手术时间短、失血量少、术中及术后患者痛苦小、外观满意率高且并发症发生率低(P0.05),术后伤口愈合时间差异无统计学意义(P0.05)。结论:应用一次性包皮环切缝合器是对袖套式包皮环切术的改进及创新,具有患者手术效果好、并发症发生率低、患者满意度高及易于接受等优势。     

海藻酸钙敷料对大鼠创面愈合影响的组织学研究

目的：探讨海藻酸钙敷料对大鼠创面愈合的影响。方法：48只雄性SD大鼠随机分为实验组和对照组,每组24只。制作大鼠背部全层皮肤缺损模型,在创面局部以海藻酸钙敷料（实验组）或干棉纱布（对照组）包扎,观察伤后3、7、14 d创面愈合率的变化;于伤后3、7、14 d取创面组织,石蜡包埋、切片、分别行HE和Masson染色,计算血管横断面面积与肉芽组织面积的比值、肉芽组织厚度和胶原蛋白含量（胶原面积与创面面积比值）。结果：术后第3天时实验组大鼠较对照组创面愈合率明显增加（P〈0.05）。术后第3天实验组与对照组肉芽组织厚度[分别为（1 540.0±118.5）μm和（1 504.6±131.8）μm,P〉0.05]和新生肉芽组织血管面积与肉芽组织面积之比[分别为0.118±0.007和0.113±0.007,P〉0.05）差异均无显著性,但术后3 d实验组胶原蛋白面积较对照组明显增多[分别为（45.7±5.3）%和（11.6±2.5）%,P〈0.05];术后第7天实验组以上指标均高于对照组（P〈0.05）,第14天时这种趋势依然存在（P〈0.05）。结论：海藻酸钙能提高伤口皮肤组织内的胶原蛋白含量,加速创面肉芽组织形成,促进伤口的愈合。     

大鼠CD4^＋CD25^＋调节性T细胞的分离及功能鉴定

目的：研究利用免疫磁珠分选法稳定分离正常大鼠脾脏CD4^＋CD25^＋调节性T细胞的方法。方法：采用免疫磁珠两步法分离大鼠脾组织CD4^＋CD25^＋T细胞。首先采用藻红蛋白（PE）标记的抗CD25抗体和抗PE多功能磁珠试剂盒阳性分选CD25^＋T细胞,再用抗异硫氰酸荧光素（FITC）标记抗体和抗IgG磁珠阳性分选获得CD4^＋CD25^＋T细胞。分离后的细胞经流式细胞仪检测分离纯度,台盼蓝染色检测细胞存活率,体外增殖实验检测其对CD4^＋CD25^-T细胞的免疫抑制作用。结果：两次阳性分选后获得的CD4^＋CD25^＋T细胞纯度为（90.4±1.6）%,细胞存活率为（92.6±2.4）%。体外增殖实验表明,CD4^＋CD25^＋T细胞能明显抑制CD4^＋CD25^-T细胞的增殖（P〈0.01）。结论：采用免疫磁珠法两次阳性分选,可稳定地获得纯度理想并有免疫抑制功能的大鼠CD4^＋CD25^＋T细胞。