hRNF6基因重组质粒的构建及蛋白表达和定位

目的 构建环指蛋白6(RNF6)真核表达栽体,并证实融合蛋白在细胞内的表达及定位.方法 提取工具细胞HEK-293的mRNA,反转录为cDNA.PCR扩增hRNF6全长编码基因,并将其克隆至pCDNA3.1-myc-his A及pEGFP-C1表达栽体中.将构建的重组质粒测序并转染到工具细胞HEK-293中,提取细胞蛋白进行Western blot检测.利用共聚焦激光扫描显微镜观察DEGFP-RNF6在工具细胞CV-1和胃癌SGC-7901细胞内的定位.结果 hRNF6全长基因序列克隆到了真核表达载体pCDNA3.1-myc-his A和pEGFP-C1中,酶切鉴定片段为2 058 bp.Western blot检测到了融合蛋白表达,分子量约为78 kDa.pEGFP-RNF6在CV-1细胞和胃癌SGC-7901细胞内定位以细胞核为主,在细胞质内少量表达.结论 成功的构建了hRNF6全长基因真核表达载体,pEGFP-RNF6蛋白主要定位于胃癌细胞核内.     

hPlk2基因真核表达载体的构建及蛋白的表达和定位

目的:构建人Polo样激酶2(hPlk2)真核表达载体并证实该融合蛋白在细胞内的表达及定位。方法:提取工具细胞Hela的mRNA,反转录为cDNA。PCR扩增hPlk2基因cDNA全长,并将其亚克隆至pEGFP-C1表达载体中。然后将构建的重组质粒进行酶切和测序鉴定,并转染到工具细胞COS-7中,提取细胞蛋白进行Western blot检测。最后利用激光扫描共聚焦显微镜观察pEGFP-hPlk2在COS-7细胞内的定位。结果:hPlk2基因cDNA全长克隆到了真核表达载体pEGFP-C1中,酶切鉴定片段大小为2 058 bp,并测序成功。Western blot检测到了pEGFP-hPlk2融合蛋白表达,分子量约为105 kDa。pEGFP-hPlk2在COS-7细胞中主要定位于细胞质和核周。结论:成功构建了hPlk2基因cDNA全长的真核表达载体,pEGFP-hPlk2蛋白在COS-7细胞中主要定位于细胞质和核周。     

miRNA765高表达对胃癌耐药细胞株BGC-823/CDDP耐药性的影响

目的 观察miRNA765高表达对胃癌顺铂(CDDP)耐药细胞株BGC-823/CDDP耐药性的影响.方法 将PCR扩增的包含miRNA765前体的基因序列克隆至真核表达载体,构建miRNA重组表达载体;阳离子脂质体转染重组质粒到BGC-823/CDDP细胞.转染后48 h,Real-Time PCR和Western blotting法分别检测细胞中miRNA765和细胞因子诱导的凋亡抑制因子1(CIAPIN1)蛋白的相对表达量;采用不同浓度CDDP处理转染后48 h的BGC-823/CDDP细胞,24和48 h后MTT法检测细胞活性并计算细胞对于CDDP的半抑制浓度(IC50).采用终质量浓度为1μg/mL的CDDP处理基因干预后的BGC-823/CDDP细胞,双染法检测细胞凋亡率.结果 BGC-823/CDDP细胞内miRNA765的相对表达量明显低于其亲本细胞BGC-823,CIAPIN1蛋白相对表达量则明显高于其亲本细胞株(均P＜0.01).在BGC-823/CDDP细胞内高表达miRNA765可明显抑制CIAPIN1蛋白的表达,转染后48 h的CIAPIN1蛋白表达量明显低于未转染组(P＜0.01);miRNA765高表达可明显降低BGC-823/CDDP细胞的耐药能力,48 h后IC50值从(18.27 ±3.92) μg/mL降至(1.50 ±0.43) μg/mL(P ＜0.05).转染48 h后,BGC-823/CDDP细胞的凋亡率从(10.1±1.7)％上升至(53.4±7.9)％(P＜0.01).结论 miRNA765高表达可以明显降低胃癌耐药细胞株BGC-823/CDDP的耐药能力.     

hSesn1基因真核表达载体构建及蛋白的表达和定位

目的 构建人源的Sesn1真核表达载体同时检测融合蛋白在COS-7细胞系内的表达和定位。方法 提取工具细胞系HeLa的mRNA,进而反转录成为cDNA。聚合酶链反应方法扩增人源Sesn1基因的cDNA全长片段,将其克隆于pEGFP-C1真核表达载体中。进一步将已构建好的重组表达载体进行双酶切以及测序鉴定,继而转染到工具细胞系COS-7中,进行Western blot方法检测。最后应用激光共聚焦扫描显微镜方法来观察pEGFP-hSesn1在COS-7细胞中的定位情况。结果 hSesn1基因cDNA全长片段克隆至pEGFP-C1真核表达载体中,酶切鉴定片段大小为1479bp,测序证实成功。Western blot方法检测出GFP-hSesn1融合蛋白的成功表达,分子质量（Mr）约为80kDa。pEGFP-hSesn1在COS-7于细胞中主要定位在细胞质及核周。结论 成功构建了pEGFP-hSesn1真核表达载体,进而检测到融合蛋白的表达,并且在COS-7细胞中主要定位于核周及细胞质。     

人G蛋白偶联受体107表达载体构建及细胞定位的研究

目的 克隆人G蛋白偶联受体107(GPR107)基因以构建真核表达载体,并探讨GPR107在真核细胞中的亚细胞定位.方法 通过分子克隆技术克隆人GPR107基因的cD-NA;利用真核细胞表达载体pCMV-Tag2B构建重组载体pC-MV-Tag2B-GPR107,瞬时转染至293T 细胞,Western blot 检测GPR107的表达变化;采用免疫荧光标记,激光共聚焦显微镜观察GPR107在细胞中的定位.结果 经过基因测序证实获得人GPR107的cDNA;成功构建真核表达载体pCMV-Tag2B-GPR107;Western blot结果显示,与未转染组比较,转染组GPR107表达量明显上调.激光共聚焦显微镜观察显示GPR107主要表达于细胞质.结论 GPR107在293T细胞中过表达,并定位于细胞质.     

ARRB1融合蛋白表达载体ARRB1-EGFP的构建及其在神经胶质瘤细胞中的表达

目的 构建重组表达载体ARRB1-EGFP,在细胞中表达与鉴定,为进一步研究其功能奠定基础.方法 RT-PCR获得编码人ARRB1的全基因序列,克隆到真核表达载体pEGFPN1,构建重组表达载体ARRB1-EGFP,并转化于E.coli DH5 α中筛选阳性重组子,通过限制性内切酶酶切电泳鉴定和DNA序列测定正确后,转染人HEK293细胞中表达,表达产物经Western blot检测蛋白的特异性,应用免疫荧光方法比较融合蛋白与内源性ARRB1在SNB19细胞的定位.结果 成功构建了ARRB1融合蛋白的真核表达载体,并经Western blot鉴定正确.免疫荧光提示融合蛋白与内源性ARRB1定位相似.结论 ARRB1-EGFP融合蛋白可以安全、高效地转导入HEK293以及SNB19细胞中.     

COL1A1-shRNA表达载体的构建及对胃癌细胞增殖迁移的影响

目的:构建COL1A1特异小干扰RNA(siRNA)表达载体,体外评价其对胃癌细胞BGC-823增殖迁移的影响.方法:根据文献获得3个COL1A1的siRNA靶序列,设计能转录短发夹状RNA(short hairpin RNAs,shRNA)的DNA序列,并与pSilencerTM 4.1- CMV neo线性质粒载体连接,连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α,筛选获得重组质粒;经DNA测序鉴定重组体DNA序列正确后转染胃癌BGC-823细胞,利用G418筛选稳定表达COL1A1-shRNA的BGC-823细胞株.通过实时荧光定量RT-PCR及Western blot检测转染后细胞COL1A1在mRNA及蛋白质水平的表达;MTT法及Transwell法检测COL1A1干扰后胃癌细胞增殖及迁移能力的变化.结果:序列测定表明成功构建3个COL1A1-shRNA表达载体.实时荧光定量RT-PCR及Western blot检测显示,COL1A1-shRNA转染胃癌BGC-823细胞的COL1A1 mRNA及蛋白表达水平明显降低(P<0.05);MTT试验及Transwell迁移试验显示,转染后细胞增殖及迁移能力明显降低(P<0.05).结论:COL1A1-shRNA转染胃癌BGC-823细胞能有效抑制细胞COL1A1的表达及癌细胞的增殖迁移.     

Effect of overexpressed Golgi α-mannosidase Ⅱ on proliferation in human gastric cancer cell line BGC-823

目的 探讨过表达高尔基体α-甘露糖苷酶Ⅱ(Golgiα-mannosidaseⅡ,GMⅡ)对人胃癌细胞株BGC-823增殖活性的影响.方法 构建真核表达载体EX-E2372-M03,通过脂质体Lipofectamine2000转染至人胃癌细胞株BGC-823,筛选稳定细胞株,用免疫荧光观察转染效率.用RT-PCR法检测转染细胞GMⅡ、c-myc、bcl-2 mRNA的表达,用Westem blot 法检测转染细胞GMⅡ、c-myc、bcl-2蛋白表达的变化,用MTT法及流式细胞仪检测过表达GMⅡ后对细胞增殖活性的影响.结果 GMⅡ真核表达质粒构建成功并成功转染,MTT结果示过表达GMⅡ后胃癌细胞增殖活性明显高于对照组(P＜0.05).流式细胞仪检测结果显示,与对照组相比较,GMⅡ过表达组胃癌细胞G1期细胞明显减少,S期细胞比例明显增加.转染后胃癌细胞GMⅡmRNA和蛋白表达水平明显高于对照组(P＜0.05),且可明显上调胃癌细胞BGC-823中c-myc的mRNA和蛋白表达水平(P＜0.05),但对bcl-2的调节作用不明显.结论 过表达GMⅡ能促进胃癌细胞增殖,可能与上调c-myc的表达有关.     

过表达高尔基体α-甘露糖苷酶Ⅱ对胃癌细胞株BGC-823增殖的影响

目的探讨过表达高尔基体α-甘露糖苷酶Ⅱ(Golgiα-mannosidaseⅡ,GMⅡ)对人胃癌细胞株BGC-823增殖活性的影响。方法构建真核表达载体EX-E2372-M03,通过脂质体Lipofectamine2000转染至人胃癌细胞株BGC-823,筛选稳定细胞株,用免疫荧光观察转染效率。用RT-PCR法检测转染细胞GMⅡ、c-myc、bcl-2 mRNA的表达,用Western blot法检测转染细胞GMⅡ、c-myc、bcl-2蛋白表达的变化,用MTT法及流式细胞仪检测过表达GMⅡ后对细胞增殖活性的影响。结果 GMⅡ真核表达质粒构建成功并成功转染,MTT结果示过表达GMⅡ后胃癌细胞增殖活性明显高于对照组(P<0.05)。流式细胞仪检测结果显示,与对照组相比较,GMⅡ过表达组胃癌细胞G1期细胞明显减少,S期细胞比例明显增加。转染后胃癌细胞GMⅡmRNA和蛋白表达水平明显高于对照组(P<0.05),且可明显上调胃癌细胞BGC-823中c-myc的mRNA和蛋白表达水平(P<0.05),但对bcl-2的调节作用不明显。结论过表达GMⅡ能促进胃癌细胞增殖,可能与上调c-myc的表达有关。     

miR-449a/b负反馈调节E2F1抑制胃癌细胞增殖

摘要：目的 探讨miR-449a/b在胃癌发生中的可能作用机制。方法 采用qRT-PCR方法检测了miR-449a/b和E2F1基因在胃癌细胞BGC-823和胃粘膜细胞GES-1表达情况;采用瞬时转染技术将miR-449a/b模拟物(mimic)以及mimic阴性对照分别转入胃癌细胞BGC-823中,qRT-PCR验证转染成功后,通过CCK-8法检测胃癌细胞的增殖能力,流式细胞术检测胃癌细胞凋亡的变化,细胞划痕实验检测胃癌细胞的迁移能力,Western blot方法检测miR-449a/b上调后其靶基因蛋白的表达水平;并通过转染E2F1过表达质粒和空质粒对照入胃癌细胞BGC-823,Western blot确定转染效率后,分别用qRT-PCR和数字PCR检测miR-449a/b的表达水平。结果 相比于正常胃粘膜细胞株GES-1,miR-449a/b在胃癌细胞株BGC-823中表达均下调（P<0.01）;过表达miR-449a/b可抑制胃癌细胞BGC-823增殖和迁移,并促进其凋亡（P<0.05）;过表达的E2F1可上调miR-449a/b的表达（P<0.001）,而上调miR-449a/b的表达,其直接靶基因CDK4、CDK6表达下调,并可通过CDKs-pRb-E2F1信号通路,间接下调E2F1蛋白的表达（P<0.01）。结论 miR-449a/b的低表达和E2F1的高表达均参与了胃癌的发生、发展,并且miR-449a/b能负反馈调节E2F1抑制胃癌细胞增殖。