WWOX基因干扰对卵巢上皮性癌细胞顺铂耐药的影响

目的 研究应用RNA干扰(RNAi)技术逆转卵巢上皮性癌(卵巢癌)耐药细胞中WWOX基因的表达,并探讨WWOX基因与卵巢癌细胞顺铂耐药的关系.方法 将设计合成的针对WWOX基因的特异性小分子干扰RNA(siRNA),用脂质体瞬时转染法将其转染进WWOX基因高表达的卵巢癌顺铂耐药细胞株SKOV3/SB细胞中,用RT-PCR技术和蛋白印迹法分别测定转染前后SKOV3/SB细胞中WWOX Mrna及蛋白表达的变化;采用四甲基偶氮唑蓝比色法检测转染前后SKOV3/SB细胞对顺铂的耐药指数;应用流式细胞仪检测转染前后SKOV3/SB细胞的生长周期,高效液相色谱仪测定转染前后SKOV3/SB细胞中顺铂的药物浓度.实验分为5组:(1)SKOV3组:接种SKOV3细胞;(2)SKOV3/SB组:接种SKOV3/SB细胞;(3)SKOV3/SB阴性对照转染组:接种转染阴性对照序列的SKOV3/SB细胞;(4)SKOV3/SB脂质体转染组:接种转染脂质体的SKOV3/SB细胞;(5)SKOV3/SB siRNA转染组:接种转染siRNA的SKOV3/SB细胞.结果 转染48 h后,SKOV3、SKOV3/SB、SKOV3/SB阴性对照转染、SKOV3/SB脂质体转染、SKOV3/SB siRNA转染组细胞中WWOX Mrna的表达水平分别为0.647±0.025、2.239±0.030、2.392±0.041、2.379±0.047、1.219±0.032,WWOX蛋白的表达水平分别为1.368±0.028、1.639±0.031、1.580±0.025、1.552±0.034、0.653±0.017,SKOV3/SB siRNA转染组与其他各组比较,差异均有统计学意义(P<0.05).转染siRNA前、后,SKOV3/SB细胞对顺铂的耐药指数由5.04降至3.89;细胞周期中G1期由39.2%增至45.6%,S期由50.4%降至37.5%;耐药细胞内顺铂浓度由9.43 ns/L升至23.45 w/L,分别比较,差异均有统计学意义(P<0.05).结论 针对WWOX基因合成的特异性siRNA能明显抑制SKOV3/SB细胞中WWOX Mrna和蛋白的表达,并能在一定程度上恢复其对顺铂的敏感性,推测WWOX基因可能参与了卵巢癌细胞的顺铂耐药过程.     

ERCC1基因与卵巢上皮癌细胞铂类耐药相关性探讨

目的 检测切除修复交叉互补1（ERCC1）基因在人卵巢上皮癌顺铂(DDP)耐药细胞株SKOV3／DDP及其亲本细胞株SKOV3中的表达,探讨ERCC1基因在卵巢上皮癌顺铂耐药中的意义以及有效沉默ERCC1基因能否有效逆转SKOV3／DDP细胞对DDP耐药。方法 于2013-2014年在南方医科大学采用实时荧光定量PCR(RT-PCR)和Western印迹法检测 ERCC1 mRNA和蛋白在SKOV3／DDP及SKOV3细胞中的表达。人工构建3个靶向沉默ERCC1基因的短发夹状RNA(shRNA)质粒表达载体,慢病毒载体法转染至SKOV3／DDP细胞,RT-PCR和Western印迹法检测ERCC1基因水平并挑选沉默效果最佳的表达载体。RT-PCR和Western印迹法检测稳定转染后SKOV3／DDP细胞中ERCC1基因的表达,CCK-8法检测转染细胞对DDP的耐药性。结果 SKOV3／DDP细胞中ERCC1 mRNA和蛋白的表达量明显高于SKOV3,差异有统计学意义(P<0.01)。稳定转染ERCC1 shRNA后的SKOV3／DDP细胞,ERCC1的mRNA及蛋白的表达量明显下降,差异有统计学意义(P<0.01)。细胞活性检测提示特异性沉默ERCC1基因能增加SKOV3/DDP 细胞对顺铂的敏感性(P<0.05)。结论 ERCC1基因在SKOV3／DDP细胞中的表达明显升高,有效沉默ERCC1 基因能有效逆转SKOV3/DDP细胞对DDP耐药,增加卵巢上皮癌DDP耐药细胞对DDP的敏感性,为卵巢上皮癌耐药的治疗提供新靶点。     

微小RNA-16逆转上皮性卵巢癌顺铂耐药的研究

目的:研究微小RNA-16(miR-16)在人上皮性卵巢癌顺铂耐药细胞中的表达及其与顺铂耐药的关系。方法:脂质体lipofectamine2000介导miR-16成熟体模拟物(mimics)及阴性对照片段(NC)分别转染人卵巢癌顺铂耐药细胞株SKOV3/DDP。实时荧光定量PCR检测各组细胞中miR-16的表达;蛋白印迹法检测细胞中Bcl-2蛋白、c-myc蛋白的表达;四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测细胞的顺铂半数抑制浓度(IC50);caspase-3活性检测试剂盒检测细胞内caspase-3酶的活性;流式细胞仪检测细胞的凋亡率。结果:(1)SKOV3/DDP细胞顺铂耐药指数(RI)为5.33;(2)SKOV3/DDP细胞中miR-16表达水平明显低于SKOV3细胞,约为后者的1/10(P=0.000),转染miR-16 mimics后SKOV3/DDP细胞中miR-16水平升高约660倍(P=0.001);(3)SKOV3/DDP细胞Bcl-2、c-myc蛋白的相对表达量较SKOV3细胞明显升高,转染miR-16 mimics后SKOV3/DDP细胞Bcl-2、c-myc蛋白的相对表达量明显降低(P<0.01);(4)SKOV3/DDP细胞转染miR-16 mim-ics后,顺铂IC50(14.19±0.06)较转染NC组(22.52±0.60)明显降低(P=0.002),且顺铂作用后caspase-3的酶活力单位也明显升高(P=0.000);(5)顺铂(20μg/ml)作用24h、48h后,SKOV3组凋亡率明显高于SKOV3/DDP组,转染miR-16 mimics的SKOV3/DDP细胞凋亡率约为转染NC细胞的1.5倍(P<0.01)。结论:miR-16可能通过靶向下调上皮性卵巢癌细胞Bcl-2蛋白,并协同调节c-myc蛋白的表达,增强卵巢癌顺铂耐药细胞对顺铂诱导凋亡的敏感性,发挥逆转耐药的作用。     

NAC-1通过自噬介导卵巢癌细胞顺铂耐药的研究

目的:探讨NAC-1在自噬介导的卵巢癌细胞顺铂耐药中的作用。方法:Western blot及流式细胞术检测顺铂诱导的耐药卵巢癌细胞(SKOV3/DDP)自噬及凋亡过程中,NAC-1蛋白的表达情况。采用siRNA下调NAC-1表达,检测其对SKOV3/DDP细胞自噬及凋亡的影响,并检测其对顺铂耐药性的影响。结果:顺铂处理SKOV3/DDP细胞后,细胞自噬及凋亡水平升高,NAC-1蛋白表达升高。siRNA下调NAC-1基因后,顺铂处理SKOV3/DDP细胞的自噬水平降低,凋亡升高,细胞顺铂耐药性降低。结论:NAC-1基因可能通过调节自噬参与卵巢癌细胞顺铂耐药,降低NAC-1基因表达有助于提高顺铂对卵巢癌细胞的杀伤作用。     

CTHRC1对卵巢癌细胞顺铂耐药的作用及机制研究

目的:探究胶原三股螺旋重复蛋白1(CTHRC1)对卵巢癌细胞顺铂耐药的作用及其相关机制。方法:Western blot法检测卵巢癌细胞株A2780、SKOV3及顺铂耐药细胞株A2780/DDP、SKOV3/DDP中CTHRC1蛋白表达水平。慢病毒lenti-sh CTHRC1转染SKOV3/DDP细胞,下调CTHRC1表达水平。CCK-8法检测沉默CTHRC1后SKOV3/DDP细胞增殖情况及顺铂半数抑制浓度(IC_(50))的变化。Western blot法检测转染后SKOV3/DDP细胞中抗凋亡蛋白Bcl-2的表达情况及Akt、STAT3的磷酸化水平。结果:与A2780和SKOV3细胞相比,顺铂耐药细胞株A2780/DDP和SKOV3/DDP细胞中CTHRC1蛋白表达水平相对较高(P0.05)。靶向下调CTHRC1表达后,SKOV3/DDP-sh CTHRC1细胞的增殖能力无明显变化,但顺铂的IC_(50)显著降低(P0.01),Akt、STAT3磷酸化水平受到抑制,Bcl-2表达水平降低(P0.05)。结论:CTHRC1可能通过Akt、STAT3信号通路,调节抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,继而影响卵巢癌细胞对顺铂的敏感度。     

带hTERT启动子的腺病毒干扰ERCC1基因表达逆转卵巢癌顺铂耐药的研究

目的:研究带hTERT启动子的腺病毒通过干扰ERCC1基因表达而逆转卵巢癌顺铂耐药的作用。方法:以1、10、50、80感染复数(MOI)的重组腺病毒分别感染卵巢癌细胞株SKOV3、卵巢癌细胞顺铂耐药株SKOV3/DDP和脐静脉内皮细胞ECV304,同时以相同滴度的空载体腺病毒感染细胞,将感染前的细胞作为对照,以RT-PCR方法检测重组腺病毒转染细胞中ERCC1 mRNA表达,以Western blot方法检测重组腺病毒转染细胞中ERCC1蛋白表达,并以MTT法检测肿瘤细胞对顺铂化疗敏感性的影响。结果:(1)在SKOV3及SKOV3/DDP细胞中,不同剂量Ad-hTERT-ERCC1 shRNA转染组与转染前相比,ERCC1 mRNA及ERCC1蛋白表达水平下调,差异有统计学意义(P<0.01)。而在空载体腺病毒转染组及ECV304细胞中,ERCC1 mRNA及ERCC1蛋白表达水平无改变,差异无统计学意义(P>0.05);(2)重组腺病毒转染后,SKOV3/DDP细胞对顺铂的敏感性显著增加(P<0.01),并呈剂量依赖性。结论:带hTERT启动子的腺病毒能够通过干扰ER-CC1基因表达而逆转卵巢癌顺铂耐药,并且具有剂量依赖性。     

五种卵巢癌耐药细胞系的建立及其部分耐药相关基因的表达

目的　建立 5种卵巢癌耐药细胞系 ,并比较耐药与其非耐药卵巢癌细胞系之间部分耐药相关基因的表达差异。方法　用卵巢癌细胞系SKOV3、A2 780分别建立顺铂、卡铂、紫杉醇 (商品名 :泰素 )耐药的细胞系SKOV3/DDP、SKOV3/CBP、A2 780 /DDP、A2 780 /CBP、A2 780 /toxol,验证其有关的生物学指标 ;并用RT PCR技术检测耐药与其非耐药卵巢癌细胞系之间部分基因的表达差异。结果　 (1)所有耐药细胞系对相关药物的耐药指数 (RI)较其非耐药细胞系均升高约 3倍或以上 ,并对临床常用的一些化疗药物表现出不同程度的耐受性 ,RI达 2～ 2 0倍 ;耐药细胞的生长速度较其非耐药细胞明显减慢 (P <0 0 1) ;群体倍增时间明显延长 1 4～ 2 4倍 (P <0 0 1) ,但G1、G2 、S期细胞比例无明显改变 (P >0 0 5 ) ;耐药细胞中药物浓度较其非耐药细胞中下降约 2 0～ 8 5倍 (P <0 0 5 )。 (2 )在检测的耐药相关基因中 ,耐药细胞较其非耐药细胞中表达下降的有p5 3、肺耐药蛋白 (LRP 1)、多药耐药相关蛋白 (MRP 1)基因 ,表达升高的有蛋白激酶C(PKC)、拓扑异构酶 (topo)Ⅰ、topoⅡβ基因 ,无明显改变的有谷胱甘肽 S 转移酶 (GST pi)、topoⅡα基因 ,多药耐药蛋白 (MDR 1)基因的表达改变不确定 ,包括升高和下降。结论　在不同类型的耐     

抑癌基因SPARCL1低表达对卵巢癌耐药和临床预后的影响

目的:探讨SPARCL1表达对卵巢癌顺铂耐药的影响,阐明SPARCL1表达与耐药及预后的相关性。方法:RT-qPCR和Western blot法检测卵巢癌细胞中SPARCL1表达,免疫组化法(IHC)检测卵巢癌组织中SPARCL1表达,Kaplan-Meier生存曲线分析基因表达与无疾病生存期(DFS)和总生存期(OS)的关系。慢病毒转染过表达或干扰基因在顺铂耐药细胞SKOV3/DDP中的表达,CCK-8法检测细胞增殖并计算IC_(50)。转录组测序研究SPARCL1表达对卵巢癌细胞分子水平的影响。结果:与卵巢癌敏感组织相比,SPARCL1蛋白在耐药组织中显著低表达(P=0.001),且该蛋白低表达能预测卵巢癌不良DFS(P=0.001)和OS(P=0.021)。SPARCL1在顺铂耐药细胞SKOV3/DDP中显著下调表达,其过表达能减缓耐药细胞增殖速度并提高对顺铂的敏感性,而干扰其表达则能加快细胞增殖并降低细胞对顺铂的敏感性。转录组测序结果发现,SPARCL1过表达可能影响p53及细胞黏附分子等经典卵巢癌耐药调控通路。结论:SPARCL1低表达促进耐药且与不良OS和DFS显著相关,有望作为卵巢癌治疗靶标和潜在预后标记物应用于临床。     

调节细胞自噬增强卵巢癌顺铂敏感性的体外研究

目的:探讨细胞自噬与上皮性卵巢癌顺铂耐药的关系及调节细胞自噬对卵巢癌顺铂耐药的影响。方法:应用MTT法、MDC荧光染色法及激光共聚焦显微镜技术,观察SKOV3、SKOV3/DDP细胞株自噬现象;通过自噬特异性抑制剂3-MA作用,了解3-MA对卵巢癌细胞胞浆内自噬体的抑制作用及抑制细胞自噬对卵巢癌顺铂敏感性的影响。结果:SKOV3细胞株顺铂IC50值为3.330μg/ml,SKOV3/DDP细胞株顺铂IC50值为14.152μg/ml。3-MA联合顺铂作用后SKOV3细胞株的顺铂IC50值为3.312μg/ml,其对顺铂的敏感性无明显影响(P=0.221),SKOV3/DDP细胞株顺铂IC50值为6.386μg/ml,提示3-MA可提高上皮性卵巢癌顺铂耐药细胞对顺铂的敏感性(P=0.000)。MDC荧光染色及激光共聚焦显微镜观察SKOV3、SKOV3/DDP细胞株胞浆自噬体的形成情况,顺铂能够诱导自噬体的生成,在3-MA作用下,SKOV3/DDP细胞株顺铂诱导的自噬体荧光强度变小,而SKOV3细胞株自噬体的荧光强度变化不大。结论:细胞自噬活性增强与上皮性卵巢癌顺铂耐药有关,抑制细胞自噬活性可以部分逆转上皮性卵巢癌SKOV3/DDP顺铂耐药,但不改变顺铂敏感型细胞SKOV3对顺铂的敏感性。     

MicroRNA-16逆转上皮性卵巢癌耐药的动物实验研究

目的:研究微小RNA-16(miR-16)对人上皮性卵巢癌裸鼠皮下移植瘤耐药性的逆转作用,并初步探讨其逆转作用机制。方法:24只BALB/c裸鼠,随机分为四组,每组6只:Ⅰ组给予皮下接种卵巢癌SKOV3细胞株,成瘤后应用顺铂治疗;Ⅱ组皮下接种卵巢癌SKOV3/DDP顺铂耐药细胞株,成瘤后给予顺铂治疗;Ⅲ组皮下接种卵巢癌SK-OV3/DDP顺铂耐药细胞株,成瘤后给予顺铂与miR-16阴性对照试剂(miR-16 Negative)协同治疗;Ⅳ组接种卵巢癌SKOV3/DDP顺铂耐药细胞株,成瘤后给予顺铂与miR-16化学修饰模拟物(miR-16 Agomir)协同治疗。观察比较四组皮下肿瘤生长情况,种瘤后第35天处死裸鼠,称取肿瘤组织质量,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测肿瘤组织中bcl-2 mRNA表达,免疫组化方法检测各组肿瘤组织中bcl-2蛋白表达。结果:顺铂与miR-16 Agomir协同治疗组裸鼠皮下肿瘤生长受到明显抑制,其肿瘤组织中bcl-2 mRNA表达水平较其余各组降低,差异具有显著性(P<0.05),其bcl-2蛋白表达亦明显低于其余各组(P<0.05)。结论:miRNA-16可能通过对其靶基因bcl-2的反向调控作用,逆转裸鼠卵巢癌皮下移植瘤顺铂耐药性。     

miR-101通过调节p-ERK1/2蛋白表达对SKOV3/DDP细胞行为活性的影响

目的:探讨miR-101表达对上皮性卵巢癌耐药细胞SKOV3/DDP行为活性的影响及相关作用机制。方法:上调SKOV3/DDP细胞中miR-101表达水平。RT-PCR法检测SKOV3/DDP细胞中miR-101 mRNA表达水平,CCK-8检测SKOV3/DDP细胞的顺铂敏感性,划痕实验检测SKOV3/DDP细胞的迁移力,Transwell实验检测SKOV3/DDP细胞侵袭力,Annexin V-FITC/PI流式细胞实验检测SKOV3/DDP细胞凋亡率,Western blot法检测SKOV3/DDP细胞p-ERK1/2、波形蛋白(Vimentin)、钙粘蛋白E(E-cadherin)及Caspase-3蛋白表达水平。结果:与各对照组比较,miR-101组SKOV3/DDP细胞miR-101mRNA表达水平明显升高(P0.05),顺铂敏感性明显增加,IC50显著降低(P0.05);划痕距离明显增宽(P0.05),透膜细胞数显著减少(P0.05);细胞凋亡率显著增高(P0.05),p-ERK1/2及Vimentin蛋白表达水平降低(P0.05),E-cadherin及Caspase-3表达水平显著升高(P0.05)。结论:高表达的miR-101可抑制SKOV3/DDP细胞中p-ERK1/2蛋白表达,同时抑制细胞行为活性,促进顺铂诱导的细胞凋亡。     

奥曲肽逆转人耐顺铂卵巢癌细胞耐药性及其机制研究

目的观察奥曲肽(octreotide,OCT)逆转人耐顺铂卵巢癌细胞SKOV3/DDP耐药性的作用,并探讨其机制。方法 2009年7月至2010年1月于东南大学医学院中心实验室进行本实验。MTT法及流式细胞术观察顺铂、奥曲肽联合作用后人卵巢癌耐顺铂细胞株SKOV3/DDP增殖与凋亡的变化。实时荧光定量PCR检测奥曲肽对SK-OV3/DDP细胞生长抑素受体-2(somatostatin receptor-2,SSTR2)、多药耐药基因-1(multiple drug resistance-1,MDR1)、多药耐药相关蛋白-2(multidrug resistance related protein-2,MRP2)mRNA表达的影响。结果奥曲肽与顺铂有协同抗卵巢癌耐顺铂细胞增殖的效应,奥曲肽在质量浓度2.5～20mg/L能显著降低顺铂的IC50(P<0.05),提高细胞的凋亡率(P<0.05)。SKOV3/DDP细胞有SSTR2mRNA表达,但奥曲肽对SSTR2mRNA表达的调节作用不明显,奥曲肽显著降低SKOV3/DDP细胞MRP2mRNA的表达(P<0.05),作用呈剂量依赖性,但对MDR1mRNA的表达没有影响。结论奥曲肽可以与卵巢癌细胞表面SSTR2结合,发挥抗增殖、促凋亡等作用,并可能通过降低卵巢癌细胞MRP2的表达逆转顺铂耐药性。     

人卵巢上皮性癌顺铂耐药细胞系3AO/cDDP模型的建立及耐药机理的实验研究

目的：模拟临床卵巢上皮性癌化疗的用药特点建立顺铂耐药细胞系3AO／CDDP,检测LRP、MRP、P－gp、GSTπ和TopeⅡ表达。方法：以临床卵巢上皮性癌化疗用药的最低剂量换算终浓度,采用大剂量顺铂（10μg／ml）反复间歇24h暴露法建立顺铂耐药细胞系;用FCM法检测LRP、MRP、P－gp、GSTπ和TopoⅡ表达。结果：历时4．5个月建成顺铂耐药株3AO／cDDP,耐药性稳定,耐药指数1．62,与临床耐药倍数相近。3AO／cDDP细胞MRP、P－gp表达与3AO相比无明显变化（P＞0．05）,LPR、GSTπ表达明显升高（P＜0．005及P＜0．05）,Tope-Ⅱ含量明显降低（P＜0．05）。结论：3A0／cDDP是模拟临床用药特点建立的、研究顺铂耐药的理想模型;顺铂耐药与LRP、GSTπ表达升高及TopoⅡ含量降低有关,与MRP、P-gp无关。     

ATP7B siRNA阳离子纳米脂质体逆转卵巢癌细胞株顺铂耐药的体内外实验研究

目的:探讨负载P型铜转运ATP酶(ATP7B)、小干扰RNA (siRNA)阳离子纳米脂质体( ATP7B/DC-Lip)逆转卵巢癌细胞株SKOV3顺铂(DDP)耐药的作用及意义.方法:通过DDP梯度诱导法构建卵巢癌耐药细胞株SKOV3/DDP,利用细胞增殖抑制实验测定其耐药指数.薄膜分散法制备ATP7B/DC-Lip并测定其各项纳米表征.利用细胞增殖抑制实验和裸鼠体内实验分别检测ATP7B/DC-Lip的体内外抗肿瘤效果.结果:成功构建了卵巢癌耐药细胞株SKOV3/DDP,ATP7 B/DC-Lip在体外条件下可以分别沉默75％(48小时)和78％(72小时)的ATP7B蛋白表达.在体内外抑制肿瘤生长实验的结果显示,当转染ATP7 B/DC-Lip后,体外条件下SK-OV3/DDP的IC50显著下降为3.51±0.93 μg/ml(n=6);体内DDP耐药型肿瘤模型中DDP+ATP7B/DC-Lip组的肿瘤大小较其他组明显更小(P＜0.05).结论:ATP7B/DC-Lip可以逆转卵巢癌细胞株SKOV3的DDP耐药,可能作为一种有效的纳米药物用于治疗DDP耐药性卵巢癌.     

神经酰胺增强卵巢癌顺铂敏感性的体外研究

目的:探讨神经酰胺增强卵巢癌顺铂敏感性的作用及机制,为筛选有效的卵巢癌顺铂耐药逆转剂提供实验依据。方法:本研究采用MTT法测定不同剂量的C6-神经酰胺(Ceramide C6)(5、10、20、40μmol/L)对卵巢癌顺铂化疗的增敏作用,以RT-PCR、Westernblot法检测Ceramide C6对肿瘤细胞Bcl-2 mRNA及其蛋白表达的影响,应用流式细胞技术观察Ceramide C6对肿瘤细胞凋亡的影响。结果:Ceramide C6对SKOV3、SKOV3/DDP细胞生长有抑制作用,与DDP联合应用时可增强DDP敏感性。SKOV3细胞中,与对照组相比,不同浓度Ceramide C6使顺铂敏感性分别增加了7.23%、20.14%、45.02%、57.75%。SKOV3/DDP细胞中,顺铂敏感性分别增加了23.08%、24.57%、45.86%、65.78%。随Ceramide C6浓度增加,SKOV3和SKOV3/DDP细胞中Bcl-2 mRNA及蛋白表达逐渐减低,差异有统计学意义(F=41.780,P=0.000;F=223.258,P=0.000;F=98.306,P=0.000;F=224.687,P=0.000)。Ceramide C6可增加SKOV3、SKOV3/DDP细胞凋亡率,差异有统计学意义(F=135.625,P=0.000;F=224.906,P=0.000)。结论:神经酰胺可能通过抑制肿瘤细胞Bcl-2 mRNA及其蛋白表达,诱导肿瘤细胞凋亡途径,增强顺铂对卵巢癌SKOV3和SKOV3/DDP细胞体外生长的抑制作用,在一定程度上逆转了卵巢癌顺铂耐药。     

白细胞介素6诱导卵巢上皮性癌细胞对化疗药物产生耐药的机制研究

目的 探讨白细胞介素6(IL-6)诱导卵巢上皮性癌(卵巢癌)细胞对化疗药物产生耐药的机制及相关信号传导通路.方法 应用外源性重组IL-6短期处理或将正义IL-6基因(ssIL-6)稳定转染至A2780细胞(不表达IL-6但表达其受体、对顺铂和紫杉醇敏感),同时将反义IL-6基因(asIL-6)稳定转染至SKOV3细胞(高表达IL-6及其受体、对顺铂和紫杉醇耐药),应用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法、逆转录PCR(RT-PCR)技术及蛋白印迹法(western blot)观察IL-6是否影响卵巢癌细胞对顺铂和紫杉醇的敏感性,并对可能的信号传导通路进行研究.结果 (1)外源性重组IL-6处理A2780细胞后,对顺铂和紫杉醇的耐药倍数分别为6.25和7.31倍;ssIL-6转染A2780细胞后(内源性过表达IL-6),IL-6低、中、高表达细胞对顺铂的耐药倍数分别为7.13、7.47和8.34倍,对紫杉醇的耐药倍数分别为7.61、8.27和10.70倍;而asIL-6转染SKOV3细胞后(抑制内源性IL-6表达),IL-6中、高抑制表达细胞对顺铂的耐药倍数分别为0.15和0.10倍,对紫杉醇的耐药倍数分别为0.10和0.08倍,可恢复SKOV3细胞对顺铂和紫杉醇的敏感性.(2)外源性IL-6作用后,上调了A2780细胞中耐药相关基因MDR1和GST-π以及凋亡抑制基因bcl-2、bcl-xL和XIAP mRNA和蛋白的表达;与此相一致,ssIL-6转染的A2780细胞中MDR1、GST-π及bcl-2、bcl-xL、XIAP mRNA和蛋白的表达水平增加,而asIL-6转染的SKOV3细胞则明显降低.(3)有丝分裂原活化的蛋白激酶-细胞外信号调节激酶(MEK)抑制剂--PD98059和磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)抑制剂--wortmannin能分别阻断IL-6诱导的卵巢癌细胞细胞外信号调节激酶(ERK)和蛋白激酶B(Akt)的活化作用,且两者均能阻断IL-6诱导的卵巢癌细胞对顺铂和紫杉醇产生的耐药,细胞生长明显减少.结论 IL-6诱导的卵巢癌细胞化疗耐药很可能与其上调卵巢癌细胞耐药相关基因MDR1、GST-π和凋亡抑制基因bcl-2、bcl-xL、XIAP的表达以及活化MEK/ERK和PI3K/Akt信号传导通路有关.     

叶酸受体-α在卵巢癌耐药细胞株中的表达及其介导的多药耐药的靶向逆转

目的:研究叶酸受体-α(folic acid receptor-α,FR-α)在卵巢癌多药耐药细胞株中的表达水平,并探讨FR-α靶向的MDR1小干扰RNA(siRNA)纳米粒对卵巢癌多药耐药细胞的逆转效果。方法:采用体外浓度梯度递增法建立卵巢癌紫杉醇耐药细胞株SKOV3-ts,应用激光共聚焦法检测FR-α的表达水平。复凝聚法将叶酸修饰壳聚糖载体包裹靶向MDR1的PGPU6/GFP/Neo/PshRNA真核表达质粒(PshRNA-MDR1),形成叶酸修饰壳聚糖PshRNA-MDR1纳米粒(FA-CS-PshRNA)。采用RT-PCR、Western blot检测叶酸修饰前后,纳米粒转染细胞后MDR1 mRNA及蛋白的表达,MTT法检测SKOV3-ts半数抑制浓度(IC50)的变化。结果:激光共聚焦法显示,耐药细胞株SKOV3-ts胞膜层有FR-α强表达,经叶酸修饰后,FA-CS-PshRNA纳米粒较CS-PshRNA能更有效降低靶细胞SK-OV3-ts的靶基因MDR1 mRNA和P-gp蛋白表达(P<0.01),并逆转SKOV3-ts细胞针对紫杉醇的IC50(0.3830±0.0096 vs 0.0353±0.0006,P<0.01)。结论:经FR-α介导,FA-CS-PshRNA能更有效敲除MDR1的表达,靶向逆转卵巢癌多药耐药。     

外源性FHIT基因表达对顺铂诱导宫颈癌SiHa细胞凋亡的影响

目的:探讨外源性脆性组氨酸三联体(fragile histidine triad,FHIT)基因表达与顺铂(cisplatin,DDP)是否可协同促进宫颈癌SiHa细胞的凋亡。方法:重组质粒PRcC-MV-FHIT(A组)及空质粒PRcCMV(B组)分别转染无内源性FHIT蛋白表达的SiHa细胞(未转染SiHa细胞为C组),Western Blot检测外源性FHIT蛋白的表达,使用不同浓度的顺铂分别处理各组细胞,通过AO-EB染色、流式细胞术检测顺铂处理后各组细胞的凋亡。结果:顺铂处理48h后进行流式细胞仪检测,重组质粒+DDP2.0μg/ml、未转染细胞+DDP2.0μg/ml及未用顺铂处理的重组质粒组凋亡率分别为51.03%、20.58%、22.07%,重组质粒+DDP组细胞凋亡更明显(重组质粒+DDP2.0μg/ml组与未转染细胞+DDP2.0μg/ml及未用顺铂处理的重组质粒组相比P<0.01),AO-EB染色亦见顺铂处理的重组质粒组凋亡细胞明显增多。结论:外源性FHIT基因表达与顺铂协同促进SiHa细胞凋亡,为基因治疗与化疗联合治疗宫颈癌提供理论基础。     

Caspase-3活性改变与人卵巢癌细胞系COC1/DDP耐药的关系

目的 探讨人卵巢癌顺铂耐药细胞株COC1/DDP中抗凋亡蛋白Bcl-XL、Bcl-2、细胞色素C的表达及半胱天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3)活性与人卵巢癌顺铂耐药的关系。方法:采用RT-PCR和Western Blot分析人卵巢癌顺铂敏感细胞株COC1和顺铂耐药株COC1/DDP中Bcl-XL、Bcl-2、细胞色素C的表达和caspase-3的活性。并用流式细胞术测定顺铂作用后COC1和COC1/DDP细胞株的凋亡率。结果:在COC1/DDP细胞中,Bcl-XL和Bcl-2的表达明显高于COC1细胞;顺铂作用后,在COC1/DDP细胞株中细胞色素C的表达明显减少,caspase-3活性明显降低(P<0.05);其凋亡率也明显低于COC1细胞株(P<0.05)。结论:人卵巢癌细胞株COC1/DDP对顺铂产生耐药可能与细胞内Bcl-XL、Bcl-2过度表达抑制了线粒体细胞色素C的释放及caspase-3活性有关。     

微小RNA－16参与上皮性卵巢癌细胞周期调控的实验研究

目的：研究微小RNA－16（miR－16）调控靶基因CCNDl及其蛋白表达产物一细胞周期相关蛋白DI（cyclinDl）在卵巢肿瘤细胞系SKOV3及其耐药株SKOV3／DDP中的表达,并初步探讨其逆转卵巢癌耐药的可能机制。方法：脂质体Lipofectamine2000介导miR－16成体模拟物（mimics）及其阴性对照片段（NC）成功转染人卵巢癌细胞顺铂耐药株SKOV3／DDP;流式细胞仪检测转染前后细胞周期的变化;Western blot法检测转染前后cy—clinDl表达的变化。结果：（1）成功转染miR－16后,SKOV3／DDP细胞系G1期细胞所占比例显著升高（P〈0．01）;（2）SKOV3／DDP细胞的cyclinDl蛋白相对表达量显著高于SK—OV3细胞：转染miR－16后,cyclinDl相对表达量显著下降（P〈0．01）。结论：miR－16很可能通过下调靶基因CCNDl及cyclinDl蛋白的表达,阻止细胞由C,期向S期转换,抑制肿瘤细胞无限增殖与生长。