代谢型谷氨酸受体亚型1基因在锂—匹罗卡品致痫大鼠齿状回中的长期高表达

目的:观察锂-匹罗卡品诱导的癫痫大鼠模型海马结构中代谢型谷氨酸受体亚型1(mGluRl)mRNA的动态表达变化。方法:用地高辛标记的多相寡核苷酸探针通过原位杂交方法检测海马各个区域在7d、14d和28d时mGluRlmRNA的表达。结果:在上述3个时间点齿状回mGluRlmRNA的表达明显上调,而在海马CA1区仅7d时可见mGluRl mRNA的相对上调,其余时间点无明显变化。结论:本研究提示锂-匹罗卡品癫痫模型齿状回mGluRl mRNA表达长期上调可能与海马结构的重塑和癫痫易感性形成有关。     

代谢型谷氨酸受体亚型1基因在锂一匹罗卡品致痫大鼠齿状回中的长期高表达

目的：观察锂一匹罗卡品诱导的癫痫大鼠模型海马结构中代谢型谷氨酸受体亚型1(mGluRl)mRNA的动态表达变化。方法：用地高辛标记的多相寡核苷酸探针通过原位杂交方法检测海马各个区域在7d、14d和28d时mGluRlmRNA的表达。结果：在上述3个时间点齿状回mGluR1mRNA的表达明显上调，而在海马CAl区仅7d时可见mGluRlmRNA的相对上调，其余时间点无明显变化。结论：本研究提示锂一匹罗卡品癫痫模型齿状回mGluRlmRNA表达长期上调可能与海马结构的重塑和癫痫易感性形成有关。     

GAD在颞叶癫痫大鼠海马内源性促痫机制中的作用

目的:探讨GAD65、GAD67在颞叶癫痫发生后海马内源性促痫机制中的作用。方法:112只雄性SD大鼠随机分为实验组(n=70)与对照组(n=42),实验组大鼠选用海人酸腹腔注射法建立颞叶癫痫模型,对照组大鼠腹腔注射无菌生理盐水。选取腹腔注射后3小时、6小时、12小时、24小时、48小时、7天、30天为研究的时间点,颞叶海马的CA1区、CA3区、齿状回为研究部位。腹腔给药后每天观察大鼠的行为学变化,大鼠处死前进行EEG描记。用原位杂交方法检测不同时间点海马不同区域GAD65、GAD67mRNA的表达,免疫组织化学法检测GAD65、GAD67蛋白的表达。结果:实验组大鼠海马GAD65 mRNA及其蛋白的表达随时间呈逐渐增高趋势,致痫后48小时～30天,GAD65 mRNA及其蛋白表达较对照组增高(48小时P<0.05;7～30天P<0.01);海人酸致痫后6小时、24小时实验组大鼠海马的GAD67mRNA及其蛋白表达较对照组增高(分别为P<0.01、P<0.05)。结论:颞叶癫痫急性期海马GAD67表达的增高及慢性期海马GAD65表达的增高是癫痫发生后机体的内源性抗痫机制。     

癫痫持续状态大鼠内质网应激预适应对海马神经元保护作用的实验研究

目的 探讨2-脱氧葡萄糖诱导内质网应激预适应对癫痫持续状态大鼠海马神经元的保护作用及其可能机制。方法 采用2-脱氧葡萄糖连续腹腔注射诱导内质网应激,并在此基础上制备氯化锂-匹罗卡品癫痫持续状态大鼠模型。Nissl染色观察癫痫持续状态后海马神经元损伤情况、计数海马CA1和CA3区存活神经元数目;免疫组织化学检测海马CA3区内质网应激标志物葡萄糖调节蛋白78（GRP78）和X盒结合蛋白1（XBP-1）表达变化。结果 与癫痫持续状态组相比,癫痫持续状态后第7天时内质网应激预适应组大鼠海马存活神经元数目增加,以CA1区显著（t=5.353,P=0.000）。癫痫持续状态组大鼠发作后6 h,海马CA3区GRP78和XBP-1表达水平升高且高于对照组（均P=0.000）,于发作第2天达峰值水平（均P=0.000）;内质网应激预适应组大鼠发作前海马CA3区GRP78和XBP-1表达即高于对照组（均P=0.000）,GRP78在发作后24 h和2 d时维持在峰值水平（均P=0.000）,XBP-1在发作后24 h达峰值水平（P=0.000）;内质网应激预适应组大鼠海马CA3区GRP78和XBP-1表达在癫痫持续状态前,以及癫痫持续状态后6、12、24 h均高于癫痫持续状态组（均P=0.000）,至第2和7天时与癫痫持续状态组之间差异无统计学意义（P〉0.05）。结论 经2-脱氧葡萄糖诱导的内质网应激预适应对癫痫持续状态大鼠海马神经元具有保护作用,而XBP-1-GRP78信号转导通路的活化可能是其机制之一。     

免疫组化、Western blot蛋白印迹和免疫荧光染色观察磷酸鞘氨醇受体2大鼠海马中的表达变化

目的观察磷酸鞘氨醇受体2(S1PR2)基因在颞叶癫痫大鼠海马中的表达变化。方法将72只健康雄性Wistar大鼠随机均分为实验组(36例)和对照组(36例)。实验组使用氯化锂—匹罗卡品进行颞叶癫痫诱导制模,成功后持续大发作1h终止待检,对照组以相同剂量生理盐水注射,然后以进行免疫组化、Western blot印迹和免疫荧光染色检测并进行统计学分析。结果免疫组化检测结果显示,两组1d、3d、7d、28d、56d海马S1PR2阳性细胞计数相比有统计学意义(P<0.05);Western blot检测结果显示,两组3d、7d、28d、56d海马S1PR2蛋白表达水平相比有统计学意义(P<0.05);免疫荧光染色检测显示,S1PR2蛋白表达阳性为红色,星形胶质细胞为绿色,细胞核为蓝色。结论颞叶癫痫大鼠海马中S1PR2表达水平显著下降,说明颞叶癫痫发病机制可能与神经元功能、星形胶质细胞增生受到S1PR2影响有关。     

红藻氨酸致痫大鼠海马神经元凋亡及其与caspase-3关系的研究

目的　研究大鼠癫痫发作后海马神经元凋亡及其与天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶 -3 (cysteinylasparate-specific proteinase,caspase-3 )表达的关系。方法　采用红藻氨酸 (kainic acid,KA)诱导大鼠癫痫模型 ,以原位末端标记 (TUNEL)及透射电镜检测癫痫发作后 6h及 1、3、7d海马神经元凋亡 ;半定量 RT-PCR及免疫组化法检测 caspase-3 m RNA及 caspase-3阳性表达。结果　KA致痫后 1 d,海马 CA1、CA3及 CA4区开始出现凋亡细胞 ,3 d时明显增多 ,7d时最多。 3个时间组相应区域间凋亡神经元数比较差异均有显著性 (P<0 .0 0 1 )。透射电镜观察可见典型的凋亡细胞形态学改变。 RT-PCR结果显示 ,KA致痫后 6h,海马组织 caspase-3 m RNA表达较对照组显著增高 (P <0 .0 5 ) ,1、3、7d caspase-3 m RNA仍持续高水平表达 (P <0 .0 5 )。免疫组化结果显示 ,KA致痫后 1 d,海马 CA1、CA3、CA4区开始出现 caspase-3阳性表达 ,3 d时阳性表达进一步增强 ,7d时表达最强。结论　凋亡参与 KA致痫大鼠癫痫发作后海马神经元迟发性死亡过程 ,caspase-3可能在癫痫后神经元凋亡过程中具重要的作用。     

创伤性脑损伤后海马区S1PR1表达与NSCs增殖的关系

目的探讨创伤性脑损伤(TBI)后大鼠海马区1-磷酸鞘氨醇受体1(S1PR1)的表达变化特点及其与神经干细胞(NSCs)增殖的关系。方法 96只健康雄性SD大鼠随机分为TBI后1、3、7、14、21、28 d组(n=10)和各时点相应的对照组(n=6)。采用控制性皮层损伤法建立大鼠TBI模型,5-溴脱氧尿嘧啶核苷(Brd U)和性别决定相关基因簇2(Sox2)免疫荧光染色双标NSCs,观察TBI后海马区NSCs的增殖趋势,Western Blot检测和分析海马区S1PR1的表达变化规律。结果与对照组相比,伤后第1天海马区NSCs数量增多,第7天达到高峰,第14、21、28天逐渐减少(P0.05)。海马区S1PR1于伤后第1天表达显著上调,高峰出现在伤后第7天,于第14、21、28天表达逐渐下调(P0.05)。结论 TBI后海马区S1PR1表达变化与NSCs增殖趋势在时程上一致,S1PR1可能在TBI后神经再生与修复过程中具有重要调控作用。     

红藻氨酸所致癫痫大鼠海马阿片受体表达的动态观察

目的研究红藻氨酸癫痫大鼠海马神经元阿片受体表达动态变化。方法利用红藻氨酸颈部皮下注射,诱发大鼠癫痫发作,用Westernblotting方法,检测不同时间段大鼠海马神经元阿片受体表达情况。结果在诱发4,5级癫痫发作后1周后海马mu型阿片肽受体（MORs）表达开始上调,至4周时达到高峰。结论红藻氨酸诱导的癫痫发作促进海马MORs表达,这种变化对进一步深入了解海马mu型阿片肽受体介导大鼠癫痫发作敏感性形成具有一定的意义。     

GSDMD蛋白在匹罗卡品致癫痫大鼠模型海马组织中的表达及作用

目的探讨Gasdermin-D(GSDMD)蛋白在匹罗卡品致癫痫大鼠模型海马组织中的表达及作用。方法成年级SD大鼠64只,随机选取12只为正常对照组,其余大鼠建立氯化锂-匹罗卡品癫痫模型,造模成功后随机分为1d、7d、14d、28d组。通过免疫组化、RT-PCR检测大鼠海马组织GSDMD、Caspase-4及IL-1β在癫痫造模后不同时间点的表达水平。结果 GSDMD、Caspase-4阳性表达及mRNA表达除了对照组和造模后1d比较差异无统计学意义外,其余两两比较差异均有统计学意义(P0.01),且造模28d高于其余四组(P0.01)。IL-1β阳性表达、mRNA表达造模前后各时间点比较差异均有统计学意义(P0.01),造模28d表达明显高于其余四组(P0.01)。结论 GSDMD蛋白在大鼠癫痫模型海马中异常升高,与造模时间相关,造模28d表达最高,可能与介导Caspase-4激活IL-1β炎症因子表达有关。     

外源性GM1对癫痫大鼠脑损伤的保护作用

目的　探讨外源性神经节苷脂GM1对癫痫大鼠脑损伤有无保护作用。方法　采用硫代氨基脲 (7.5mg/kg)诱导大鼠癫痫发作模型 ,用免疫组化方法动态观察致痫组大鼠和GM 1干预组大鼠在癫痫发作 2 4小时、4 8小时、72小时及 7天时 ,以及正常对照组、生理盐水组大鼠 72小时时神经生长因子 (NGF)在实验大鼠海马及额叶神经细胞表达情况。同时应用电镜技术观察受损海马神经细胞形态及结构变化。结果　正常对照组和生理盐水组大鼠无癫痫发作 ,致痫组和GM1干预组大鼠有Ⅰ Ⅴ级癫痫发作。免疫组化结果显示 ,癫痫鼠在其海马、额叶有较多的NGF阳性神经细胞表达 ,而未致痫鼠偶有NGF阳性细胞表达 (P <0 .0 5 )。在致痫鼠中 ,GM1干预后NGF表达明显高于未干预组 (P <0 .0 5 ) ,且以 72小时NGF表达为最高(P <0 .0 5 )。电镜显示癫痫鼠神经细胞损伤 ,但GM1干预后损伤减轻 ,而正常对照组和生理盐水组神经细胞形态和结构正常。结论　癫痫发作可引起脑细胞损伤 ;GM1对癫痫大鼠脑损伤具有一定保护作用 ,其保护作用可能通过诱导NGF表达增多来实现。     

癫癎大鼠海马区白细胞介素1受体1免疫反应阳性细胞的观察

目的:探讨白细胞介素1受体1(IL-1R1)在海马区的表达与癫(疒间)发病的关系。方法:用免疫细胞化学法,观察成年和美解眠致(疒间)大鼠海马区IL-1R1免疫反应(IL-1R1-IR)阳性细胞分布。结果:成年大鼠海马区存在IL-1R1-IR阳性细胞。美解眠致(疒间)后,海马区该阳性细胞数显著增多(P＜0.01);致(疒间)前后给予尼莫地平,海马区该阳性细胞均较癫(疒间)大鼠显著减少(P＜0.01),与正常比较无显著差异(P＞0.05)。结论:海马区IL-1R1参与癫(疒间)的病理过程,其机制可能与其介导该区细胞内信号传导有关。尼莫地平不仅可以阻止癫(疒间)发作,而且可以减轻其继发的脑损伤。     

Redistribution of astrocytic glutamine synthetase in the hippocampus of chronic epileptic rats

Glutamine synthetase (GS) is an astrocytic enzyme, which catalyzes the synthesis of glutamine from glutamate and ammonia. In the central nervous system, GS prevents glutamate-dependent excitotoxicity and detoxifies nitrogen. Reduction in both expression and activity of GS was reported in the hippocampus of patients with temporal lobe epilepsy (TLE), and this reduction has been suggested to contribute to epileptogenesis. In this study, we characterized hippocampal GS expression in the pilocarpine model of TLE in Wistar rats by means of stereology and morphometric analysis. Neither the GS positive cell number nor the GS containing cell volume was found to be altered in different hippocampal subregions of chronic epileptic rats when compared with controls. Instead, redistribution of the enzyme at both intracellular and tissue levels was observed in the epileptic hippocampus; GS was expressed more in proximal astrocytic branches, and GS expressing astrocytic somata was located in closer proximity to vascular walls. These effects were not due to shrinkage of astrocytic processes, as revealed by glial fibrillary acidic protein staining. Our results argue for GS redistribution rather than downregulation in the rat pilocarpine model of TLE. The potential contribution of increased GS perivascular affinity to the pathogenesis of epilepsy is discussed as well.     

NDRG2通过Hes1参与癫痫发作后海马齿状回的神经发生

目的 探讨N-Myc下游调节基因2(N-Myc downstream regulated gene 2,NDRG2)与癫痫发作后海马齿状回神经发生的关系。方法 C57BL/6小鼠20只,随机分为癫痫组和对照组,每组又分为癫痫造模后1和7 d两个时间点,每个时间点5只,通过蛋白免疫印迹检测癫痫后海马齿状回NDRG2蛋白相对表达水平和mRNA相对表达水平变化; 使用双皮质素(DCX)染色标记未成熟神经元,神经巢蛋白(Nestin)标记神经干细胞,神经核蛋白(NeuN)标记成熟神经元,观察NDRG2对海马齿状回神经干细胞增殖影响; 采用RT-PCR检测发状分裂相关增强子1(hairy and enhancer of split 1,Hes 1)、NDRG2 mRNA相对表达表达水平,并分析两者之间的相关性; 观察NDRG2参与癫痫发作后神经发生的可能机制。结果 癫痫组与对照组比较,DCX、Nestin、NeuN、Hes1、NDRG2蛋白相对表达水平在1和7 d这2个时间点有显著性增高,并随时间逐渐递增。结论 癫痫发作后海马NDRG2蛋白相对表达水平增高,与癫痫发作后海马齿状回的神经细胞增值时间具有一致性和相关性,NDRG2可能参与癫痫发作后海马齿状回的神经发生过程; 同时发现海马NDRG2表达增加和Hes1分子表达增加具有相关性,故推测NDRG2可能通过Hes1参与癫痫发作后海马齿状回的神经发生。     

氯化锂-匹罗卡品致痫大鼠脑髓鞘转录因子的表达及其意义

目的探讨氯化锂-匹罗卡品致     

Decreased epileptic susceptibility correlates with neuropeptide Y overexpression in a model of tolerance to excitotoxicity

Prior epileptic episodes have been shown to decrease markedly the neuronal damage induced by a second epileptic episode, similar to the tolerance following an episode of mild ischemia. Endogenous neuroprotective effects mediated by various mechanisms have been put forward. This study investigated whether neuroprotection against the excitotoxic damage induced by re-exposure to an epileptic challenge can reflect a change in epileptic susceptibility. Tolerance was elicited in rats by a preconditioning session using intrahippocampal kainic acid (KA) administration followed at 1, 7 and 15-day intervals by a subsequent intraventricular KA injection. The degree of pyramidal cell loss in the vulnerable CA3 subfield contralateral to the KA-injected hippocampus was extensively reduced in animals experiencing KA ventricular administration. This neuroprotection was highly significant 1 and 7 days after injection, but not 15 days after injection. In preconditioned animals, the after-discharge threshold was assessed as an index of epileptic susceptibility. It increased significantly from 1 to 15 days after intrahippocampal KA administration. Finally, an enhancement of neuropeptide Y expression in both non-principal cells and mossy fibers was detected, occurring at the same time as the decrease in epileptic susceptibility. These results provide further evidence of an 'epileptic tolerance' as shown by the substantial neuroprotective effect of a prior episode of epileptic activity upon subsequent epileptic insult and suggest that the prevention of excitotoxic damage after preconditioning results from an endogenous neuroprotective mechanism against hyperexcitability and seizures.     

实验性癫癇大鼠海马内GDNFmRNA表达的变化

目的 :为探讨癫活动对大鼠GDNF基因表达的影响。方法 :应用同位素标记的原位杂交研究海人藻酸致后大鼠海马区GDNFmRNA表达时相的变化。结果 :正常大鼠海马未见GDNFmRNA表达 ,而癫大鼠海马神经元在致后 4h以后出现GDNFmRNA表达强烈的上调反应 ,12h达高峰 ,且各区均有表达 ,此后逐渐衰减 ,2 4h恢复正常。结论 :癫后内源性GDNFmRNA表达上调很可能是神经元对抗兴奋性损害的一种保护效应     

HIF-1α与SDF-1α/CXCR4在星形胶质细胞缺氧应激过程中的调控机制与作用

目的探讨星形胶质细胞缺氧模型中缺氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)与基质衍生因子-1α/趋化因子受体(stromal cell derived factor 1α/chemokine receptor 4、SDF-1α/CXCR4)通路在缺氧应激过程中的调控机制与作用。方法原代培养SD大鼠星形胶质细胞并构建缺氧模型,采用不同浓度梯度与时间CoCl2处理后,使用RT-PCR检测缺氧前后HIF-1α和SDF-1α的mRNA表达情况,并采用ELISA的方法检测SDF-1α的分泌情况。针对HIF-1α基因序列设计siRNA,诱导星形胶质细胞缺氧模型内HIF-1α基因沉默并检测HIF-1α、SDF-1α的mRNA表达情况与SDF-1α的分泌水平的变化情况。结果研究显示星形胶质细胞在CoCl2模拟的缺氧环境下HIF-1α和SDF-1αmRNA表达的水平均上调。另一方面,沉默HIF-1α基因的星形胶质细胞在缺氧环境中SDF-1α的表达水平无显著性升高。结论缺氧刺激上调星形胶质细胞SDF-1α的表达是通过上调HIF-1α表达介导的。HIF-1α与SDF-1α/CXCR4之间可能存在调控关系。     

颞叶癫痫神经元型钙粘素mRNA表达研究

目的研究匹罗卡品诱导的颞叶癫痫神经元型钙粘素的表达变化.方法用氯化锂加匹罗卡品诱导SD大鼠颞叶癫痫模型,特异性探针原位杂交检测神经元型钙粘素mRNA表达.结果对照组动物神经元型钙粘素mRNA在皮层和海马各区均有表达,给药后4 h和12 h神经元型钙粘素mRNA在CA1、CA3和齿状回均表达下降,24 h开始恢复,注药后3 d神经元型钙粘素mRNA表达显著高于对照组,7 d表达最高.结论神经元型钙粘素mRNA在颞叶癫痫表达呈双相变化.     

普瑞巴林对慢性颞叶癫癎大鼠海马凋亡调控基因的影响

目的通过观察普瑞巴林对匹罗卡品慢性癫癎大鼠海马区Bcl-2和Bax表达的影响,探讨普瑞巴林治疗癫癎的药理学机制及对大鼠海马神经元的抗凋亡作用。方法采用氯化锂-匹罗卡品化学诱导方法建立慢性颞叶癫癎模型。经腹腔注射普瑞巴林40mg(/kg·d)连续治疗3周,免疫组织化学染色和Western blotting法检测不同处理组大鼠海马区Bcl-2和Bax表达变化。结果与生理盐水对照组比较,模型组大鼠海马区Bcl-2和Bax表达水平显著升高(均P=0.000);与模型组比较,普瑞巴林治疗组大鼠海马区Bcl-2表达水平升高、Bax表达水平降低,组间差异具有统计学意义(均P=0.000)。结论新型抗癫癎药物普瑞巴林可通过降低慢性颞叶癫癎大鼠海马区Bax表达、上调Bcl-2表达而抑制细胞凋亡,发挥神经元保护作用。