TH基因逆转录病毒表达载体的构建及产病毒细胞系的建立

目的　构建含有鼠酪氨酸羟化酶 (TH)基因的重组逆转录病毒表达载体 p N2 ATH,建立 PA317产病毒细胞系。方法　将质粒 p GEM- 2上酶切下的 THc DNA片段与线性化的逆转录病毒表达载体 N2 A连接 ,克隆出重组逆转录病毒表达载体 p N2 ATH。把 p N2 ATH质粒转入 PA317包装细胞 ,通过 G4 18抗性筛选 ,NIH3T3细胞测定病毒滴度 ,得到高滴度产毒 PA317/p N2 ATH细胞株 ,免疫组化测定细胞 TH表达。结果　重组质粒 p N2 ATH经酶切鉴定证明 THc DNA正向插入 N2 A表达载体中 ,PA317/p N2 ATH产毒细胞高效表达 TH。结论　成功地构建了重组逆转录病毒表达载体p N2 ATH,建立了 PA317/p N2 A产毒细胞株     

肝癌细胞内表达抗肝癌单链抗体

0引言细胞内抗体（intrabody）技术是近几年来完善的一种新的基因治疗策略[1]。细胞内抗体具有结合、灭活肿瘤细胞癌蛋白、诱导细胞凋亡的作用[2]。未见有关在肝癌细胞内表达抗肝癌单链抗体的研究报道。本研究在肝癌细胞内表达抗肝癌单链抗体，观察单链抗体在肝癌细胞内表达对肝癌细胞的影响。1方法抗人肝癌单链抗体基因由本室制备。该基因长700加，由重链可变区基因和轻链可变区基因I－inker（Gly4Ser）。连结组成，重链5’端含有EcoRI酶切位点和A”l’G启始码，删除了轻链可变区分端57个碱基，轻链3’端含有一个Sail酶切位点。将含有…     

PRS-CTGF-SiRNA逆转录病毒载体及包装细胞株的构建

目的 用PRS逆转录病毒载体构建介导人结缔组织生长因子（CTGF）小分子干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）表达的PRS—CTGF—SiR．NA逆转录病毒载体，并建立高效、稳定表达CTGF—SiRNA的包装细胞株。方法 根据siRNA靶序列设计要求及PRS逆转录病毒载体特点分别设计含64bp DNA序列的4对寡核苷酸，并在体外合成。PRS载体用Bg1Ⅱ、HindⅢ双酶切完全后，分别与退火的4对寡核苷酸进行连接，构建成表达CTGF小分子干扰RNA的PRS—CTGF—SiRNA逆转录病毒载体。用脂质体2000介导转染PT67包装细胞，经抗性筛选，挑单克隆，扩大培养，用NIH3T3细胞测定病毒滴度，筛选出高效产毒细胞株。结果经酶切、连接后构建成的质粒称之为PRS—CTG—siRNA1—4，经酶切与测序证实构建成功，无任何碱基突变。经脂质体介导转染包装细胞、抗性筛选和NⅠH3T3测定病毒滴度，筛选出具有高病毒滴度的细胞集落，扩大培养后建立CTGF—SiRNA高效表达的包装细胞株。结论 成功构建了能表达CTGFsiRNA的PRS—CTGF—SiRNA逆转录病毒载体，并建立了稳定、高效生产有活性的的CTGF-SiRNA产毒包装细胞株。     

抗NI-35重组单链抗体表达载体的构建与融合表达

目的：重新设计并人工合成抗NI-35重组单链抗体(anti-NI-35-scFv)的cDNA克隆，构建其表达载体，在原核系统中实现初步表达。方法：根据抗NI-35抗体的轻链重链序列，重新设计适于在大肠杆菌中表达的基因片段，经退火、复性连接成目的片段后，克隆到克隆栽体pUC—18中，经全自动序列分析仪测序证实，再亚克隆至表达栽体pET-28a( )，转化大肠杆菌BL21，诱导表达。结果：合成的基因序列与设计的仅差一个碱基，目的基因连接方向及阅读框架正确；SDS-PAGE检测显示，表达出相对分子量31kDa的融合蛋白，并得到了良好的生物活性。结论：抗NI-35重组单链抗体基因表达载体的构建和表达，为深入研究其应用于神经系统的损伤和修复奠定了基础。     

mIL-12重组逆转录病毒载体的构建及包装细胞系的建立

目的：构建 mIL-12重组逆转录病毒载体。方法：将 mIL-12 DNA克隆到载体pLEGFP,用该重组质粒转染PA317包装细胞获得重组逆转录病毒。结果：重组质粒pLEGFP-mIL12酶切及PCR产物在2 290 bp区域见强荧光条带与mIL-12基因大小相符;转染PA317细胞后的上清感染NIH3T3细胞后,经共聚焦显微镜能观察到融合蛋白的表达。结论：包装细胞上清中有含mIL-12 DNA的重组逆转录病毒,mIL-12重组逆转录病毒可感染NIH3T3细胞并在细胞中进行有效的复制。     

反义AFP增强子/TK基因重组逆转录病毒载体的构建及在肝癌细胞中的专一性表达

目的构建在肝癌细胞中特异性高表达的重组逆转录病毒载体,观察其对体外培养肝癌细胞生物学行为的影响。方法应用DNA重组技术将α-甲胎蛋白増强子(AFE)核心区DNA与单纯性疱疹病毒胸苷激酶(TK)基因融合,反向插入逆转录病毒载体pLXSN,重组体命名为pL/TK/AFE/SN;经PA317细胞包装、G418筛选、病毒滴度测定,挑选滴度高的抗性克隆细胞株扩增培养,收获病毒上清,感染体外培养的Hap3B肝癌细胞和Hela宫颈癌细胞。用Southernblot、Northernblot检测转染细胞的DNA、mRNA,以羟甲基无环鸟苷(GCV)对细胞的杀伤毒性检测外源基因在转染细胞中的表达。结果酶切及Southernblot证实插入pL/TK/AFE/SN的反义AFE/TK基因大小、方向及克隆位点正确。达到一定的产病毒滴度。Northernblot分析显示Hep3B肝癌细胞有TK基因mRNA水平表达;应用GCV后,导入反义AFE/TK基因的Hep3B肝癌细胞生长明显受抑制(P<0.01)。结论成功构建了含反义AFE/TK基因的重组逆转录病毒载体并包装出具有感染能力的假型逆转录病毒;重组载体所含的反义AFP増强子能调控外源性TK基因特异地在Hep3B肝癌细胞中高表达。     

抗恶性黑素瘤单链抗体-鱼精蛋白融合蛋白表达载体的构建及评价

目的 构建抗MM单链抗体-鱼精蛋白融合蛋白表达载体,并验证其表达效率及功能.方法 通过PCR方法将鱼精蛋白截短片段序列与抗黑色素瘤细胞表面抗原单链抗体基因相连接;采用TaKaRa pMD 19-T载体试剂盒将PCR后获得的融合蛋白扩增产物进行T载体构建;构建GST融合蛋白表达载体以实现在大肠杆菌中该融合蛋白的可溶性表达,经两步亲和纯化后获得scFv-tP蛋白;采用凝胶阻滞电泳迁移率变动分析EMSA技术检测Anti-MM scFv-tP与siRNA的结合活性;荧光分子标记scFv-tP蛋白后分别采用流式细胞术检测和共聚焦显微镜观察其与LiBr细胞株进行细胞表面抗原结合活性验证;采用不同浓度FITC标记的siRNA与scFv-tP进行混合,分别与LiBr细胞(A)及DU145细胞(B)进行混合孵育,观察肿瘤细胞对携载siRNA的单链抗体的内化活性.结果 成功构建抗恶性黑素瘤单链抗体-鱼精蛋白片段融合蛋白(Anti-MM scFv-tP)表达载体;实现在大肠杆菌中该融合蛋白的可溶性表达,可获得较纯的scFv-tP蛋白;Anti-MM scFv-tP蛋白与siRNA有明显的结合与携载能力,可以有效与LiBr细胞表面特异性抗原进行结合,且有较强的内化活性.结论 本研究构建的抗MM单链抗体-鱼精蛋白融合蛋白表达载体可稳定表达,Anti-MM scFv-tP蛋白具有siRNA结合携载能力,可靶向识别结合进入LiBr细胞,为后续进一步研究该单链抗体融合蛋白靶向载体携载siRNA在体内外抑制恶性黑色素瘤恶性进展奠定坚实的基础.     

抗CD44抗体单链抗体构建及表达

目的构建抗 CD44抗体的单链抗体(anti-CD44-ScFv),为进一步应用基因工程抗体研究打下基础。方法从分泌抗 CD44单克隆抗体的杂交瘤细胞系 HII44a 中提取总 RNA,经 RT-PCR 分离获得了轻、重链可变区(V_L、V_H)基因,用连接肽将其构建成具有 V_L-Linker-V_H 结构的单链抗体基因,并将构建的单链抗体基因克隆到分泌型蛋白表达载体 PET22b( )中进行表达。结果经测序表明,V_H、V_L 及 Linker 的序列正确。ScFv 在大肠杆菌中的表达量约占菌体总蛋白的16%。能够特异性与 CD44抗原结合。结论成功构建抗 CD44抗体单链抗体,为进一步制备基因工程抗体奠定了基础。     

葡萄糖激酶基因逆转录病毒表达载体及包装细胞系的构建及鉴定

目的构建葡萄糖激酶(glucokinase,GK)基因逆转录病毒表达载体及稳定的产毒细胞系,为将GK基因应用于糖尿病的基因治疗打下基础.方法质粒pCMV4-GKZ1经EcoRⅠ/BamHⅠ双酶切后亚克隆至逆转录病毒载体PLXSN,构建成重组逆转录病毒表达载体PLX-GK,采用酶切及测序对重组体进行鉴定.而后脂质体转染PLX-GK至包装细胞PA317,检测培养上清病毒滴度,挑选滴度较高的稳定产毒细胞系并对其行PCR及免疫组化鉴定.结果构建了GK基因逆转录病毒表达载体PLX-GK,经酶切及序列分析证实目的基因插入位点和读码框架正确、无突变;建立了稳定产毒细胞系PA317/GK,其培养上清平均病毒滴度为6.8×105cfu/ml,最高为1.8×106cfu/ml,PCR及免疫组化证实GK基因整合入PA317/GK细胞基因组并有GK的表达.结论成功构建了携GK基因的逆转录病毒表达载体及高滴度的稳定产毒细胞系.     

稳定表达人巨细胞病毒pUL49蛋白人胚肺成纤维细胞系的建立

目的 用逆转录病毒载体介导的基因转移方法,建立稳定表达人巨细胞病毒(HCMV)UL49基因的HELF细胞系.方法 首先应用KT-PCR从感染HCMV的HELF细胞RNA中扩增UIA9基因,克隆到逆转录病毒载体pLEGFP-N1上,以此构建重组逆转录病毒栽体pLEGFP-N1-FLAG-uL49,并转染AmphoPackTM-293细胞,收集逆转录病毒,感染HELF细胞,经G418抗性筛选出阳性细胞.结果 经IFA、KT-PCK及Wcstem blot检测到UIA9基因在稳定细胞系中表达.结论 HELF-PLEGFP-N1-FLAG-UL49稳定细胞系构建成功.此细胞系为进一步研究HCMV pUL49蛋白的功能提供了一个有力工具.     

含HSVtk基因重组逆转录病毒包装细胞PA317/TK的建立

目的 :研究肿瘤的自杀基因疗法 ,建立含单纯疱疹病毒胸苷激酶 (HSVtk)基因重组逆转录病毒包装细胞PA317/TK。　方法 :应用脂质体转移方法将逆转录病毒载体GINaTK导入PA317,经G4 18筛选阳性克隆细胞后分别用PCR和扫描电镜检测HSVtk基因整合和病毒颗粒分泌情况。　结果 :逆转录病毒载体GINaTK导入PA317,G4 18后筛选得到阳性克隆细胞 ,命名为PA317/TK。PCR检测PA317/TK细胞出现一特异性 4 0 4bp阳性条带 ,而PA317细胞没有扩增出相应条带。PA317/TK细胞经扫描电镜检测见其表面有颗粒状突起 ,其周围有许多呈团状的病毒颗粒。证实含HSVtk基因重组逆转录病毒存在于包装细胞中。　结论 :成功建立含HSVtk基因重组逆转录病毒包装细胞     

携带EGFP与rtTA双基因的逆转录病毒载体的构建及其在PA317细胞中的表达

目的 构建表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)、rtTA双基因的重组逆转录病毒载体pLXSN-EGFP-rtTA,并在PA317细胞中表达.方法 以质粒pEGFP-C1为模板进行PCR反应获得EGFP基因片段,定向插入逆转录病毒载体pLXSN,筛选出正确的重组逆转录病毒载体pLXSN-EGFP.PCR方法从pTet-on质粒中扩增出rtTA基因,酶切纯化后克隆于逆转 录病毒载体pLXSN-EGFP中,限制性内切酶酶切分析及PCR鉴定筛选出正确的重组载体pLXSN-EGFP-rtTA,脂质体介导转染PA317细胞,PCR方法检测PA317细胞内EGFP、rtTA基因,RT-PCR方法检测PA317细胞内rtTA基因的mRNA表达,荧光显微镜观察EGFP基因的表达情况.以NIH3T3细胞为靶细胞测定重组逆转录病毒滴度.结果 成功构建了表达EGFP、rtTA双基因的重组逆转录病毒载体,转染PA317细胞后,RT-PCR方法可检测到rtTA基因的mRNA表达,荧光显微镜下可观察到EGFP基因表达所产生的绿色荧光,说明连接有EGFP和rtTA双基因的逆转录病毒载体在PA317细胞中可正常表达,转染pLXSN-EGFP-rtTA载体的PA317细胞可产生4.8x 104 CFU/ml病毒滴度的重组病毒.结论 成功构建表达EGFP、rtTA双基因的重组逆转录病毒载体,该载体可在PA317细胞内正常表达,获得较高滴度的病毒上清.     

大鼠前脑啡肽原基因逆转录病毒表达载体及产毒细胞系的建立

目的:构建大鼠前脑啡肽原基因(pENK)逆转录病毒载体,获得携带该基因的高滴度产毒细胞系.方法:应用RT-PCR方法获得大鼠pENK基因,HindⅢ、Cla Ⅰ双酶切后,同相应双酶切的pLNCX2载体大片段连接,构建成pENK基因逆转录病毒载体pLNCX2-pENK.然后用脂质体法将该载体转染PT67细胞,G418筛选,并进行滴度测定.结果与结论:成功地构建了pLNCX2-pENK载体,获得8×108CFU/L的产毒细胞系.成功建立了携带pENK的高滴度逆转录病毒产毒细胞系.     

人胰岛素原突变体重组逆转录病毒及稳定包装细胞系的构建和鉴定

目的　构建携带人胰岛素原突变体的逆转录病毒载体及稳定的包装细胞系。方法　采用PCR重叠延伸定点突变技术 ,将普通细胞内Furin蛋白酶的识别和切割位点Arg X Lys Arg 样序列 ,引入人胰岛素原C肽两端 ,同时加上信号肽、Kozak序列和酶切位点并克隆至逆转录病毒载体 pLXSN中 ,测序正确后转染包装细胞PA317,经G4 18筛选后挑选稳定生产病毒的细胞株 ,用NIH3T3细胞测定病毒滴度。结果　测序证明胰岛素原cDNA的 5个预定位点成功突变 ,其上游加上了信号肽和增强表达的Kozak序列 ;G4 18筛选重组pL mPIN SN转染PA317细胞抗性克隆 ,其病毒滴度为 2 .6× 10 5CFU/ml,而且基因组PCR和病毒液的RT PCR都显示有 2 86bp的条带 ,提示构建携带人胰岛素原突变体的逆转录病毒载体以及稳定的包装细胞系成功。结论　成功构建了携带人胰岛素原突变体的逆转录病毒载体及包装细胞系 ,为进一步胰岛素基因治疗糖尿病的实验研究奠定了基础     

人p58.2重组逆转录病毒载体的构建及稳定包装细胞系的鉴定

目的　构建并鉴定携带人p5 8 2基因的重组逆转录病毒载体及稳定的包装细胞系。方法　用PCR技术从pSPORT1-p5 8 2扩增出编码p5 8 2N端 1～ 3 45个氨基酸的全长基因 ,定向克隆入逆转录病毒载体pMSCVneo中 ,酶切鉴定 ;脂质体法将重组逆转录病毒转入包装细胞系PT67,G418筛选建立稳定产病毒的细胞株。结果　双酶切鉴定 ,成功构建重组逆转录病毒载体 ;重组逆录病毒载体转入包装细胞 ,经G418筛选 ,形成了抗性克隆 ,并测得病毒滴度为 3×10 5cfu/ml,提示构建携带人p5 8 2基因的逆转录病毒载体及稳定的包装细胞系成功。结论　构建人p5 8 2基因的逆转录病毒载体可行 ,并且可望成为一种很好的对血液系统疾病进行基因治疗的方法     

抗肝癌单链双功能抗体在Hut-78细胞系中的表达及体外杀伤活性

目的 用携带分泌型抗肝癌单链双功能抗体基因（sFv-TNF-α）的重组逆转录病毒感染T细胞淋巴瘤Hut-78细胞,使其表达并分泌针对人肝癌细胞的sFv-TNF-α融合蛋白,观察转导的T细胞对体外培养肝癌细胞的杀伤作用。方法 用感染性重组病毒产生细胞C22（PA317/PST）产生的病毒上清转导入T细胞淋巴瘤Hut-78细胞,采用PCR,RT-PCR,细胞原位杂交及免疫组织化学染色等方法,对转导的Hut-78细胞进行DNA,mRNA及蛋白水平的分析。转导的Hut-78细胞分别与SMMC-7721,HHCC共培养,MTT法检测Hut/PST细胞表达产物对两种肝癌细胞的杀伤作用。结果 PCR,RT-PCR结果显示转导Hut细胞中扩增出外源目的基因对应的电泳条带,neo基因探针原位杂交显示转导细胞质内有较强的紫蓝色阳性反应信号,其阳性率约为95%,鼠抗人TNF-α多克隆抗体免疫组织化学染色,转导细胞质内有明确的棕黄色阳性反应信号,MTT法检测结果,分泌型抗肝癌单链双功能抗体对体外培养的两种肝癌细胞的杀伤率分别为15.4%和26.5%。结论 分泌型抗肝癌单链双功能抗体基因可以在T细胞中整合并稳定表达,其分泌的表达产物对两种肝癌细胞均具有一定的亲合活性,并且具有一定的体外杀伤作用。     

小鼠PD-L1真核表达载体的构建及其在CHO细胞中的稳定表达

目的构建含有小鼠PD-L1基因的真核表达载体,并通过转染获得稳定表达小鼠PD-L1分子的CHO细胞系。方法从小鼠脾细胞总RNA逆转录的cDNA中扩增出PD-L1基因,通过双酶切（XhoI和EcoRI）装入真核表达载体pIRES2-EGFP中,脂质体法转染CHO细胞,经G418筛选后,建立稳定高表达PD-L1分子的CHO细胞系。结果构建了真核表达载体pIRES2-EGFP／PD-L1,建立了稳定表达PD-L1目的基因的CHO细胞系。结论成功构建了PD-L1真核表达载体并获得了稳定表达该分子的CHO细胞系为后续研究奠定了物质基础。