人Jurkat细胞GAGA样元件结合蛋白cDNA的克隆

目的 探讨人Jurkat细胞中是否存在与GAGA样元件相互作用的结合蛋白。方法 采用酵母单杂交体系,在HTLV－1转化的Jurkat细胞cDNA文库中筛选与GAGA样元件相互作用的蛋白;提取人Jurka细胞总RNA,应用反转录反应标记cDNA探针,与候选的阳性克隆杂交。结果 共获得9个阳性克隆,其中6个阳性克隆的插入片段可以与cDNA探针杂交。结论 在人Jurkat细胞中有与GAGA样元件相关的结合蛋白。     

ERBIN蛋白PDZ结构域结合蛋白的筛选和鉴定

目的 筛选和鉴定ERBIN蛋白的PDZ结构域结合蛋白。方法 以ERBIN蛋白的PDZ结构域为诱饵,采用酵母双杂交系统从人淋巴细胞白血病细胞系的MATCHMAKERcDNA文库中筛选ERBINPDZ结合蛋白,使用β-半乳糖苷酶（LacZ）活性的定性分析和免疫共沉淀技术鉴定所获结合蛋白识别和结合ERBINPDZ结构域的结合特性。结果 TAX1蛋白能选择性与ERBIN蛋白的PDZ结构域发生特异性结合。结论 TAX1蛋白是ERBIN结合蛋白家族中的一个新成员。     

酵母双杂交系统筛选FOXP3的相互作用蛋白

目的 利用酵母双杂交系统筛选与人FOXP3相互作用的蛋白.方法 应用酵母双杂交系统,将成功构建的酵母诱饵表达载体pGBKT7-FOXP3,与转化了成人肝cDNA文库的酵母菌Y187接合,筛选与FOXP3相互作用的蛋白,通过一对一的回复性杂交实验排除假阳性,并对阳性克隆进行序列测定和生物信息学分析.结果 经过酵母双杂交共获得最终确认3个阳性克隆,测序后经生物信息分析为肿瘤蛋白D52、分裂因子3b及未知蛋白.结论 成功应用酵母双杂交系统筛选出与FOXP3相互作用的3个蛋白,它们可能与Treg细胞的发育分化及其功能有关.     

人巨细胞病毒UL135蛋白结合蛋白的酵母双杂交筛选

目的 利用酵母双杂交系统从人胎脑cDNA文库中筛选与人巨细胞病毒(HCMV)UL135编码蛋白相互作用的蛋白.方法 将成功构建的酵母诱饵表达载体pGBKT7-UL135转化到酵母菌AH109中,再将人胎脑文库DNA转化到含有pGBKT7-UL135的酵母细胞中,筛选与HCMV UL135编码蛋白相互作用的细胞蛋白,并对阳性克隆进行测序和生物信息学分析.结果 最终确认60个克隆与HCMV UL135编码蛋白相互作用,其中2个克隆与Thy-1高度同源.结论 成功应用酵母双杂交系统筛选出与HCMV UL135编码蛋白相互作用的蛋白,其中Thy-1在HCMV感染致病过程中可能起重要作用.     

应用酵母双杂交系统筛选新基因AngRem104相关蛋白

目的：应用酵母双杂交系统筛选与新基因AngRem104相互作用的蛋白，为该基因的功能研究提供线索。方法：构建AngRem104的真核表达载体AngRem104-pGBKT7／c—myc，转化酵母菌AH109，Western blot证实蛋白表达，进行毒性和自激活检验，与转化了成人肾脏cDNA文库的酵母菌Y187接合，筛选与AngRem104相互作用的蛋白。结果：AngRem104蛋白能在酵母中正常表达，对酵母细胞无毒性，不存在自激活现象。筛选出的蛋白包括真核翻译延伸因子1α1、糖皮质激素受体AF-1特异延伸因子、β2-微球蛋白、巴戴-比德尔综合征2蛋白及4个与细胞代谢有关的蛋白。结论：AngRem104可能影响细胞内某些转录因子活性和细胞代谢，并与某些免疫相关疾病和遗传病发病有关。酵母双杂交结果为AngRem104的功能研究提供了重要线索。     

酵母双杂交技术筛选与HCMV-UL146编码产物相互作用蛋白

目的 应用酵母双杂交技术,在人胎脑文库中筛选与人类巨细胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV) UL146基因编码蛋白相互作用蛋白,以探讨HCMV-UL146的生物功能.方法 应用酵母双杂交系统,构建pGBKT7-UL146诱饵质粒,转化酵母AH109,与含人胎脑cDNA文库质粒的酵母相互作用,于涂有X-α-gal营养缺陷型培养基上筛选生长.挑选蓝色克隆,提取此酵母克隆的质粒转化大肠杆菌,提取质粒DNA进行测序分析.结果 pGBKT7-UL146构建成功.经严格筛选,共有200余个阳性克隆,分离测序80个克隆,成功筛选出30个与HCMV-UL146特异性相互作用的蛋白.结论 HCMV-UL146与多种蛋白有相互作用,提示其生物学功能复杂.此结果为进一步研究HCMV-UL146基因功能提供依据.     

人淋巴细胞CD2胞内区结合蛋白的分子克隆

ＣＤ２分子,又称Ｅ受体,分布于胸腺细胞及所有成熟Ｔ淋巴细胞和大部分ＮＫ细胞的表面,是Ｔ淋巴细胞的粘附和信号分子,在Ｔ淋巴细胞分化、成熟、识别、粘附、激活和凋亡等方面都具有重要作用。ＣＤ２分子的胞内区含有能调节细胞识别作用、粘附作用和细胞信号传递作用的...     

用酵母双杂交体系筛选与FMRP相作用蛋白的cDNA

目的 采用平双杂交体系寻找与脆性Ｘ智力低下蛋白相互作用的蛋白,探讨ＦＭＲＰ的生物医学功能。方法以编码ＦＭＲＰＰｐｒｏ３２７－Ｔｈｒ５１８肽段的ＣＤＮＡ序列与ＰＢＴＭ１１６质粒ＤＮＡ结合结构域重组作为“钓饵”,从小鼠胎ＣＤＮＡ文库中筛选与之相互作用蛋白的ＣＤＮＡ。结果 筛选出１３个与ＦＭＲＰＰｒｏ３２７Ｔｈｒ５１８肽段特异性地相互作用的克隆,其中１２个为小鼠泛素转运酶９（ＵＢＣ９）,１个是在ＧｅｎＢ     

用于筛选COPS3相互作用蛋白酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-COPS3的构建及鉴定

目的 用COPS3基因片段构建酵母双杂交GAL4系统的诱饵载体pGBKT7-COPS3，并检测其表达产物对酵母细胞有无毒性及对报告基因有无激活作用。方法 运用RT-PCR技术从骨肉瘤细胞系SOSP-9607中扩增出COPS3基因片段，克隆入pUC19质粒，经测序正确后，插入酵母双杂交诱饵载体pGBKT7中，将重组质粒导入酵母菌AH109，检测其表达产物在酵母细胞中对报告基因有无激活作用。结果 成功获得COPS3基因片段，其表达蛋白对酵母菌AH109无毒性，对报告基因亦无激活作用。结论可以利用酵母双杂交GAL4系统来研究与COPS3相互作用蛋白。     

酵母双杂交筛选与ANGPTL5相互作用的蛋白实验研究

目的采用Clontech公司酵母双杂交系统,筛选与血管生成素样蛋白5（ANGPTL5）相互作用的蛋白。方法将ANGPTL5基因克隆到诱饵载体pGBKT7,在证实ANGPTL5蛋白不具有自激活作用的前提下,在人HeLa细胞cDNA文库中,以酵母双杂交系统筛选与ANGPTL5相互作用的蛋白,并进行相互作用的验证。结果成功构建酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-ANGPTL5,筛选出2种蛋白与ANGPTL5相互作用,即SNARE相关蛋白（SNAPIN）和ZW10相互作用蛋白（ZWINT）。结论运用酵母双杂交技术,从人Hela细胞cDNA文库中成功获得2个与ANGpL5相互作用的蛋白质,为研究ANGPTL5的功能提供了新的线索。     

靶向趋化因子受体5短肽的筛选及活性初步分析

目的筛选人趋化因子受体5(CCR5)的亲和短肽。方法采用噬菌体十二肽库对稳定表达CCR5的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(CHO/CCR5)进行筛选,得到30个阳性克隆,通过酶联免疫吸附试验(ELISA)分析,发现其中17个克隆含有AFDWTFVPSLIL基序。结果含有该序列的噬菌体和合成肽AFDWTFVPSLIL能阻止单克隆抗体2D7与CHO/CCR5细胞的结合;并能竞争性地抑制RANTES对CHO/CCR5细胞的结合。结论小分子肽AFDWTFVPSLIL能特异性地结合CCR5,并有可能成为CCR5的拮抗剂。     

人新型C5a受体C5L2结合域的信息学及其结合力的初步研究

目的 通过生物信息学分析人C5L2受体的配体结构域,并进一步利用生物分子相互作用测定技术(biomolecular interaction analysis,BIA)研究其与配体C5a分子间的相互作用.方法 以人C5L2蛋白的氨基酸序列为基础,利用网络分析软件以及Goldkey计算机分析软件对人C5L2蛋白二级结构及亲水性、抗原性、可及性、柔韧性、表位等参数进行综合分析,确定可能与rhC5a结合的区域肽段序列,Fmoc方法固相多肽合成候选的结合位多肽,采用IAsys Plus生物传感器系统,以rhC5a为固定相,分别以这些候选结合位多肽为流动相,测定与rhC5a的结合力.结果 合成多肽N2(第12～22位)、C3(第265～275位)可与C5a发生特异性结合,结合率分别为53%和23%.结论 人C5L2分子第3～22、179～183、190～195、265～275位等区域满足各项指标,最可能是其配体C5a的结合域.     

重组人Tum-5融合蛋白的克隆、表达、纯化及鉴定

目的:构建人肿瘤抑素(tumstatin)活性片段Tum-5的融合重组表达载体并对其进行诱导表达和蛋白纯化以获得大量重组融合蛋白.方法:人工合成Tum-5基因,进行测序分析,将该基因克隆入原核表达载体pQE-30中,转化感受态细胞DHSα,经IPTG诱导表达重组融合蛋白,对表达产物进行Tricine-SDS-PAGE电泳分析和Western Blot检测分析.结果:构建了重组融合表达质粒pQE-30-Tum-5,表达的蛋白经Tricine-SDS-PAGE电泳分析,在约Mr10×103处出现了一条新生的蛋白条带,经灰度扫描检测,表达量约占菌体总蛋白的40%,纯化后的蛋白灰度扫描检测,纯度为95%.结论:成功地构建了人Tum-5基因的原核表达载体,并纯化了该基因的原核表达产物.     

人肺腺癌细胞单羧酸转运泵基因的克隆及基因序列分析

目的 克隆人肺腺癌细胞单羧酸转运泵基因编码序列并对此序列作同源性分析。方法 通过ＲＴ－ＰＣＲ方法克隆人肺腺癌Ａ５４９细胞单羧酸转运泵基因ｄＤＮＡ编码序列,应用ＰＣＲ、四色荧光、双脱氧终止法测序;通过Ｇｅｅｂａｎｋ数据库应用分析软件对克隆基因序列进行同源性分析。结果 应用ＲＴ－ＰＣＲ方法克隆出人肺癌细胞的单羧酸转运泵基因;肺癌民人心肌细胞单羧酸转运泵基因第一亚型的ｃＤＮＡ编码序列具有主度同源性。结论     

H22肿瘤细胞aptamer的筛选与结构分析

目的：获得与H22肿瘤细胞特异性结合的aptamer。方法：利用SELEX技术,以小鼠DC细胞为反筛选细胞,以H22肿瘤细胞为靶细胞,从体外合成的80bp随机单链DNA文库中筛选出能与H22肿瘤细胞特异结合的aptamer。采用荧光标记引物法检测aptamer与H22肿瘤细胞的亲和力：所获得的aptamer采用MACAWv2．05软件进行aptamer序列的一级结构同源序列比较,用DNASISv2．5软件计算分析序列最低二级结构能量值,获得其二级结构模拟图。结果：本实验设计的文库序列：5’-CGTCGCTGCACATTCCG—N46-CGCACAGCTGGGAGTAC-3’具有较高的扩增效率,适合于aptamer与以细胞为靶物质的筛选。经过11轮循环筛选,随机单链DNA文库与靶细胞结合的荧光强度从1％上升到59％,结合曲线进入平台期,表明结合已基本处于稳定状态,因此可以判断aptamer与靶细胞的结合基本已经处于饱和状态：对所获得的32个aptamer进行测序,然后进行一级结构和二级结构分析。一级结构分析获得5个保守序列：AGGGA、AGAAGG、GTGAXAA、ATAGT、CAAGG,其余10个aptamer无同源序列。二级结构分析表明,aptamer形成的茎环、凸环结构可能是与H22肿瘤细胞特异性结合的结构基础。亲和力检测结果表明第24号aptamer具有最强的亲和力。结论：利用随机单链寡核苷酸文库成功获得与H22肿瘤细胞特异结合的aptamer,其一级和二级结构与亲和力密切相关。     

大鼠脑损伤后脑皮质及血清5—HT和5—HIAA含量及赛庚啶对其的影响

通过大鼠脑落体损伤模型,采用荧光分光光度仪检测脑损伤后不同时间脑皮质和血清中5-羟色胺(5-HT)及其代谢产物5-羟吲哚醋酸(5-HIAA)含量。观察了用盐酸赛庚啶治疗后对5-HT和5-HIAA含量的影响。结果表明,脑皮质中5-HT和5-HIAA含量均升高。伤后48h,脑皮质中5-HT升高达高峰,为4.29±0.44μg,是对照值的4.8倍;5-HTAA于伤后24h达高峰,为5.48±0.41μg/g,是对照值的5.8倍。血清中5-HT变化不明显,5-HIAA亦明显升高。应用5-HT受体阻断剂赛庚啶治疗后,脑皮质中5-HT下降为1.32±0.09μg/g,5-HIAA含量下降为1.36±0.10μg/g;血清中5-HIAA含量也较明显降低为0.27±0.03μg/ml。     

PDCD5和TRAIL诱导胃癌细胞凋亡的实验研究

目的探讨PDCD5及TRAIL对胃癌细胞株MKN28体外诱导凋亡的作用及机制。方法培养,MTT法分析细胞增殖抑制率及细胞存活率,流式细胞仪分析细胞凋亡及细胞周期．AO／EB染色进行观察凋亡细胞？结果TRAIL可明显抑制MKN28细胞增殖,并可诱导凋亡。PDCD5对MKN28细胞抑制增殖、诱导凋亡作用不明显。PDCD5、TRAIL联合应用对MKN28细胞有显著的抑制增殖、诱导凋亡作用。两者具有协同作用。结论TRAIL对MKN28细胞株有一定程度的凋亡诱导作用。PDCD5对MKN28细胞的凋亡作用不明显。TRAIL联合PDCD5可以高效诱导MKN28细胞凋亡。     

mRNA差异显示法筛选和克隆胎肝中差异表达基因

0　引言　胎肝正处于生长发育阶段 ,其中表达的一些基因在成人肝脏中处于关闭状态 ,当成人肝脏部分切除或肝细胞广泛受损时 ,剩余肝细胞表现出很强的再生能力 ,再生成年肝脏和肝癌细胞中都出现有发育早期基因的表达 [1 ] .克隆这类胎肝中差异表达的基因 ,将有助于了解肝脏的发育过程 ,并为肝脏再生及肝脏相关疾病的研究提供线索 .1　材料和方法1.1　材料　胎肝和成人肝组织分别由西京医院妇产科和肝胆外科提供 .差示 PCR引物为 5′端 10碱基随机引物 I(RPI) :5′- AGCCACCATG- 3′ ;5′端 10碱基随机引物 II(RPII) :5′- TAGCAG…     

人T细胞基因组随机MARs的分离、克隆及序列分析

目的分离、克隆人基因组随机MARs片段,分析其序列特征,为进一步研究MARs在真核细胞DNA复制及基因表达调控中的作用与机制奠定基础.方法用DNaseⅠ、高盐和蛋白酶K处理细胞核,分离人T细胞基因组随机MARs片段,并将其克隆进入PUC19质粒;用体外结合实验筛选能与核基质蛋白结合的克隆并测序,生物信息学分析其序列的特征.结果从人T细胞基因组中分离得到大量的MARs片段,构建成MARs库,初步任意挑选58个克隆,体外结合实验证实其具有与核基质蛋白结合活性,对其中1个克隆的序列分析表明,其序列AT含量较高,不仅含有AC-和ATAT基序,还包含有多个转录/复制起点、增强子序列、弯曲DNA和扭结DNA基序以及多个反向重复序列.结论分离获得的DNA片段具有MAR的特性,同一DNA序列中存在不同的元件组合,其参与基因表达调控的功能应该是复杂、多样的.     

Distribution of melatonin receptor in human fetal brain

Melatonin,synthesizedbypinealglands,hasmanyimportantbiologicalfounctions.Whenbindingwithmelatoninreceptors(MR),itactivatesthetrans-membranesignaltransductionbymodulatingthecon-centrationofthesecondmessengers.Melatoninrecep-torbelongstoGprotein-couplesuperfamilythatwidelyexistsinnervesystemandperipheraltissues.Thereare2kindsofmelatoninreceptorsinhuman,mt1andMT2,whichmostlyexistinthecentralner-voussystemandfetalleptomeninges［1］.Currentlytherearelittledocumentsaboutthedistributionofmelatoninr…