黑胸大蠊若虫免疫兔血清对美洲大蠊若虫cDNA表达文库的筛选及克隆分析

目的从美洲大蠊若虫cDNA文库中筛选黑胸大蠊抗原相关基因,以期获得黑胸大蠊有潜在药用价值的蛋白质、多肽成分。方法用黑胸大蠊若虫免疫兔血清筛选美洲大蠊若虫cDNA文库,对阳性克隆进行PCR鉴定和序列测定,通过国际互联网进行核苷酸序列的同源性分析及编码蛋白质的结构分析和功能预测。结果经三轮复筛,从多个持续阳性克隆中挑选出3个进行测序、分析,其中N1克隆为新基因,Score<50,命名为Parcxpwnx01,GenBank登录号为AY838802。该基因编码231个氨基酸,初步预测该蛋白可能为一具信号转导功能的跨膜蛋白。N2克隆与美洲大蠊核蛋白体16SRNA基因高度同源,N3与黑胸大蠊线粒体DNA高度同源。结论免疫筛选获得与黑胸大蠊若虫抗原相关的基因克隆,其编码的蛋白结构和功能有待进一步研究。     

日本血吸虫文库筛选、Tetraspanin 2的抗体检测及其单抗的制备

目的筛选新的可能具有诊断意义的血吸虫蛋白分子,并对其进行生物信息学分析。方法以血吸虫病人血清筛选日本血吸虫15 d肝期童虫cDNA文库,对阳性克隆插入片段的核苷酸进行序列分析,将结果通过Internet送入NCBI GenBank进行同源性比较并利用蛋白质分析软件进行生物信息学分析。结果经3轮筛选,共获15个阳性克隆,对其进行测序,获得11个基因,其中5个为编码日本血吸虫线粒体的基因,1个为编码日本血吸虫肌球蛋白的基因,其他5个分别为编码SjCHGC05315、SjCHGC01371、SjCH-GC04782、SjCHGC05166、SjCHGC09769的基因。结论从日本血吸虫肝期童虫cDNA文库中筛选到一批日本血吸虫基因,为血吸虫病新的诊断候选分子的研究提供了材料。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5B反式激活基因的克隆化研究

目的：应用抑制性消减杂交（suppression subtractive hybridization，SSH）技术构建丙型肝炎病毒非结构蛋白5B（HCV NS5B）转染细胞差异表达cDNA消减文库，克隆HCV NS5B蛋白反式激活相关基因。方法：以HCV NS5B表达质粒pcDNA3.1（-）-NS5B转染HepG2细胞，以空载体pcDNA3.1（-）为对照，制备转染后的细胞裂解液，提取mRNA并逆转录为cDNA，进行抑制性消减杂交（SSH）分析。随机挑取克隆进行测序及同源性分析。结果：文库扩增后得到35个阳性克隆，经菌落PCR分析显示其中26个克隆含有大小不等的200～1000 bp插入片段。测序及同源性分析，显示16种已知基因编码蛋白和1种未知功能基因序列，包括一些与细胞周期、信号传导及肿瘤发生等细胞生长调节密切相关的蛋白编码基因，可能是NS5B反式激活靶基因。结论：成功构建了HCV NS5B反式激活基因差异表达的cDNA消减文库，为进一步阐明HCV NS5B反式调节的靶基因在肝炎、肝纤维化和肝细胞癌发生的分子生物学机制提供理论依据。     

牛带绦虫亚洲亚种核糖体蛋白L10a 基因分析

目的:分析和预测牛带绦虫亚洲亚种成虫核糖体蛋白L10a 基因及其编码蛋白的结构和功能.方法:构建牛带绦虫亚洲亚种成虫cDNA 文库,进行EST测序,将EST序列与GenBank 中登陆的序列进行同源性比对及基因完整性判断;应用NCBI上的BLAST对所筛选基因的保守域进行搜索比对,利用PredictProtein 分析、预测其功能域及二级结构.结果:BLASTX分析该基因为全长基因,全长 698 bp,编码区为24～681,编码218个氨基酸,无跨膜区,具有较稳定的理化性质.结论:从牛带绦虫亚洲亚种成虫cDNA 文库中筛选出核糖体蛋白L10a 基因.     

日本血吸虫真核生物翻译起始因子2α亚基全长cDNA的克隆与功能分析

目的对用表达序列标签(EST)策略从日本血吸虫(Schistosomajaponicum)尾蚴cDNA文库中筛选出的新基因进行全长cDNA克隆及功能预测。方法将插入于pTriplEx2 质粒上的cDNA进行测序,测序结果经BLASTn程序搜索,发现该插入cDNA序列与曼氏血吸虫真核生物翻译起始因子2α亚基(eukaryotic translation initiation factor 2 alpha subunit, eIF2α) 基因高度同源。根据该EST序列设计与pTriplEx2 质粒上的5'端测序引物相匹配的PCR下游引物,从该cDNA文库中扩出包含eIF2α全长ORF的cDNA片段。将PCR产物纯化后克隆到pGEM-T载体上,并对此克隆进行测序得到其全长cDNA序列。用NCBI 站点的BLASTx及BLASTn程序对所获得的新基因序列进行同源性搜索;用blast two sequence程序对同源性高的基因进行核苷酸及氨基酸水平的同源性比较。同时用网上分析软件进行基序和保守区域的搜索。结果发现一个与曼氏血吸虫eIF2α亚基mRNA高度同源的日本血吸虫新基因,核苷酸与氨基酸水平的同一性分别为87%和79%,编码由327个氨基酸组成的蛋白序列。结论用EST策略筛选到一个日本血吸虫新基因,编码eIF2α亚基,全长编码序列与曼氏血吸虫eIF2α亚基mRNA高度同源。     

日本血吸虫真核生物翻译起始因子2α亚基全长cDNA的克隆与功能分析

目的 对用表达序列标签(EST)策略从日本血吸虫(Schistosoma japonicum)尾蚴cDNA文库中筛选出的新基因进行全长cDNA克隆及功能预测。方法 将插入于pTriplEx2质粒上的cDNA进行测序，测序结果经BLAS Tn程序搜索，发现该插入cDNA序列与曼氏血吸虫真核生物翻译起始因子2α亚基(eukaryotic translation initiation factor 2 alpha subunit，elF2α)基因高度同源。根据该EST序列设计与pTriplEx2质粒上的5′端测序引物相匹配的PCR下游引物，从该cDNA文库中扩出包含eIF2α全长ORF的cDNA片段。将PCR产物纯化后克隆到pGEM-T载体上，并对此克隆进行测序得到其全长cDNA序列。用NCBI站点的BLASTx及BLASTn程序对所获得的新基因序列进行同源性搜索；用blast two sequence程序对同源性高的基因进行核苷酸及氨基酸水平的同源性比较。同时用网上分析软件进行基序和保守区域的搜索。结果 发现一个与曼氏血吸虫eIF2α亚基mRNA高度同源的日本血吸虫新基因，核苷酸与氨基酸水平的同一性分别为87％和79％，编码由327个氨基酸组成的蛋白序列。结论 用EST策略筛选到一个日本血吸虫新基因，编码eIF2α亚基，全长编码序列与曼氏血吸虫eIF2α亚基mRNA高度同源。     

抗日本血吸虫病天然分子疫苗免疫猪血清筛选日本血吸虫尾蚴cDNA文库结果分析

目的通过天然分子疫苗免疫猪血清作为探针筛选日本血吸虫尾蚴cDNA文库,应用表达序列标签获得日本血吸虫新基因.方法制备天然分子免疫猪血清,将筛选的尾蚴cDNA文库中大肠杆菌XL1-Blue侵入大肠杆菌BM25.8后环化成质粒,筛选出已转入质粒的菌株.提取质粒DNA,进行测序,得到一个表达序列标签(EST).通过NCBI网站的BLASTx及BLASTn公共数据库,编辑分析EST序列并进行同源性比较.结果从26个克隆样品中筛选出8个阳性克隆,其中有一个新基因(GenBank登录号DQ097517),该基因全长861 bp,有完整的阅读框架,与蜜蜂(Apis mellifera)SMC3蛋白编码的mRNA基因序列同源性最高.结论疫苗免疫猪血清可作为筛选日本血吸虫新基因的有效探针,新发现1个日本血吸虫相关基因.     

鼠细胞角蛋白EndoB基因组DNA克隆No4的亚克隆及核苷酸序列分析

本文报道了从鼠细胞角蛋白基因组DNA文库中,经核酸分子杂交筛选的与鼠细胞角蛋白Endo B同源的阳性克隆No.4的亚克隆及核苷酸序列分析,又经微机辅助分析,证明No.4的461个核苷酸序列中,与Endo B cDNA同源性达93%,是与Endo B cDNA相关的假基因。     

申克孢子丝菌翻译控制肿瘤蛋白的结构分析与功能预测

【目的】从cDNA文库中识别申克孢子丝菌翻译控制肿瘤蛋白(TCTP)的基因并分析预测其结构功能和应用前景.【方法】 利用NCBI和ExPASy网站中的各种基因和蛋白的序列结构信息分析工具,结合DNAstar和VectorNTI suite生物信息学分析软件包,从申克孢子丝菌全长cDNA质粒文库中识别TCTP的基因及其编码区,分析、预测该基因编码的蛋白结构特征和功能.【结果】 TCTP基因全长621 bp,编码区具有207个氨基酸,在GenBank同源序列中,其与蓝菌属真菌(Grosmannia clavigera) TCTP氨基酸序列一致性达到78%,理论预测分子质量为64581.4 ku,无质体和线粒体定位序列,预测结果显示编码蛋白含有1个跨膜区,7个亲水性部位和5个主要B细胞表位?与蓝菌属真菌及球毛壳霉(C.globosum)的TCTP进化关系最近.【结论】 应用生物信息方法筛选出申克孢子丝菌TCTP的cDNA全长序列并预测其结构与功能?潜在抗原表位,为进一步实验研究该蛋白生物学特性提供了依据.     

豫医卷毛大鼠表皮生长因子基因的比较生物学分析

目的:对豫医卷毛大鼠的表皮生长因子(EGF)基因进行比较生物学分析。方法:采用PCR方法对豫医卷毛大鼠EGF基因cDNA序列进行克隆测序,并与BN大鼠、家鼠、原鸡、猕猴和人EGF基因的核苷酸序列及其编码蛋白的氨基酸序列进行同源性比较和系统遗传学分析。结果:获得了豫医卷毛大鼠EGF基因全长3522bp的cDNA序列(GenBank登录号:JX437943)。豫医卷毛大鼠EGF基因编码区的核苷酸序列与BN大鼠、家鼠、原鸡、猕猴和人的同源性分别为97.8%、83.4%、59.7%、76.5%、73.5%,其编码蛋白的氨基酸序列同源性分别为99.3%、79.9%、52.9%、69.6%、69.4%。结论:EGF基因在进化过程中具有一定的保守性,但不同物种之间也具有特异性。     

与人巨细胞病毒UL130 编码蛋白相互作用蛋白的筛选

 目的利用酵母双杂交技术筛选与人巨细胞病毒（HCMV）UL130 表达产物有相互作用的细胞蛋白及其编码基因,了解其
在宿主基因组中的地位功能。方法将成功构建的酵母诱饵表达载体pGBKT7-UL130 转化到酵母菌AH109 中,再将人胎脑文
库DNA转化到含有pGBKT7-UL130的酵母细胞中,筛选与HCMV UL130 编码蛋白相互作用的细胞蛋白,并对阳性克隆进行测
序和生物信息学分析。结果最终确认9 个克隆与HCMV UL130 编码蛋白相互作用,其中2 个克隆与突触小体相关蛋白
（SNAP）高度同源。结论成功应用酵母双杂交系统筛选出与HCMV UL130 编码蛋白相互作用的蛋白,其中SNAP 在HCMV
感染致病过程中可能起重要作用。     

利用酵母双杂交系统筛选与FXR1P相互作用的蛋白

目的筛选FXR1P相互作用蛋白,探讨FXR1P生物学功能。方法应用酵母双杂交技术,构建诱饵表达载体pGBKT7/FXR1,转化酵母菌AH109,与转化了人胎脑cDNA文库的酵母菌Y187交配筛选阳性克隆并测序。结果重组表达载体pGBKT7/FXR1构建成功;从人胎脑cDNA文库中筛选出5个与FXR1P结合的蛋白基因,分别与5种已知的编码蛋白基因序列同源：胞苷一磷酸-N-乙酰神经氨酸合成酶（CMAS）、铁蛋白重链多肽1（FTH1）、高尔基体自身抗原golgina亚类4（GOLGA4）、17-β羟类固醇脱氢酶1（HSD17B1）、绒毛膜生长催乳激素1（CSH1）。结论为进一步研究FXR1P的功能及脆性X综合征发病机制提供新的线索。     

人纤溶酶原K5区基因真核表达载体的构建和活性鉴定

目的 构建含人纤溶酶原K5区基因的真核表达载体，转染人乳腺癌细胞株MDA—MB—231，观察阳性克隆表达的K5蛋白对人脐静脉内皮细胞株ECV304和MDA—MB—231细胞增殖的影响。方法 应用PCR将人纤溶酶原信号肽序列引入K5cDNA，所得的目的片段与真核表达载体pcDNA3重组，构建重组质粒poDNA3K5，脂质体法将其转染MDA—MB—231，G418筛选阳性克隆，PCR鉴定，RT-PCR和Western blot检测K5的表达。将鉴定正确的阳性克隆的培养上清作用于ECV304细胞，MTT、法检测其增殖情况，并用MTT法检测转染pcDNA3K5对MDA—MB—231细胞增殖的影响。结果 构建的重组质粒pcDNA3K5经酶切鉴定、测序正确，将其转染MDA-MB-231后挑取的阳性克隆有3个经PCR鉴定正确，并经RT-PCR和Western blot检测证实K5的表达。阳性克隆的培养上清作用于ECV304细胞后，其存活率降低；转染pcDNA3K5对MDA—MB—231细胞增殖无明显影响。结论 应用脂质体法将带有人纤溶酶原信号肽序列的K5cDNA转染MDA-MB-231细胞后，其分泌产生的有生物学活性的K5，呈现对ECV304细胞增殖的抑制作用，而对MDA-MB-231细胞的生长则无影响。     

人Jurkat细胞GAGA样元件结合蛋白cDNA的克隆

目的 探讨人Jurkat细胞中是否存在与GAGA样元件相互作用的结合蛋白。方法 采用酵母单杂交体系,在HTLV－1转化的Jurkat细胞cDNA文库中筛选与GAGA样元件相互作用的蛋白;提取人Jurka细胞总RNA,应用反转录反应标记cDNA探针,与候选的阳性克隆杂交。结果 共获得9个阳性克隆,其中6个阳性克隆的插入片段可以与cDNA探针杂交。结论 在人Jurkat细胞中有与GAGA样元件相关的结合蛋白。     

人泛素结合酶cDNA的分离与克隆

目的 分离、克隆人泛素结合酶基因,并初步研究其组织表达谱。方法 根据与鼠泛素结合酶有较高一致性的人表达序列标签（ＥＳＴ）设计筛库引物,筛选人胎脑ｃＤＮＡ文库,采用生物信息学方法分析筛选到的阳性克隆;设计控针,应用人多组织杂交膜分析该基因的组织表达谱。结果 从文库中筛选到两个互为剪接异构体的长度分别为１ ４７１和１ ３１５ｂｐ的ｃＤＮＡ克隆,其开放读码分别编码１４７和１０９个氨基酸,与鼠、果蝇、线虫     

IgA亲和体随机组合噬菌体文库的构建和体外分子进化

目的构建IgA亲和体随机组合文库并进行体外分子进化,研究IgA亲和体分子结构与功能的关系。方法基因合成两个IgA亲和体片段。3′端引入3个随机连接肽序列随机连接,克隆于噬菌粒展示载体pCANTAB5S,构建噬菌体展示随机组合分子文库。以人IgA为靶分子对该文库进行4轮亲和筛选。制备阳性筛选克隆的单克隆噬菌体,用ELISA鉴定IgA结合活性。结果成功构建噬菌体展示IgA亲和体随机组合分子文库,库容量为3.4×107,滴度为1.6×1012TU/L,阳性克隆占79%以上,序列分析IgA亲和体随机连接,随机连接肽序列呈随机分布。在人IgA分子诱导的分子进化过程中,展示多个IgA亲和体串联体的噬菌体比例明显增加,获得3种新型IgA亲和体组合分子结构形式:IgA亲和体二联体、三联体和四联体。ELISA结合实验表明IgA亲和体三联体和四联体的IgA结合能力远大于单体和二联体。结论通过构建IgA亲和体噬菌体展示随机组合文库和体外分子进化的方法,获得多种新型组合分子,其中IgA亲和体三联体和四联体的IgA结合能力明显增加,提示通过有效的分子进化成功地获得了高亲和力的IgA结合分子。     

人Endostatin cDNA的克隆及其在HT1080细胞中的表达

目的 :构建能表达人Endostatin的真核表达质粒。方法 :设计引物从成人肝cDNA文库中通过PCR扩增到EndostatincDNA ,并在 5′端融合编码人胰岛素信号肽序列 ,经测序证实后连接到真核表达载体pcDNA3.1(- )中。将携带基因的真核表达载体质粒pcDNA3.1(- ) SEND转染HT10 80细胞后用G4 18筛选获得克隆 ,采用RT PCR和West ern blot检测Endostatin的表达。结果 :测序结果表明克隆的人EndostatincDNA完全正确 ,并且在其 5′端融合编码人胰岛素信号肽序列 ;RT PCR显示转染后的HT10 80细胞可以有效地转录EndostatinmRNA ;Western blot检测到转染后的HT10 80细胞上清有相应的蛋白质 ,大小为 2 0kD左右。结论 :含有人胰岛素信号肽序列的人EndostatincDNA重组质粒pcDNA3.1(- ) SEND转染HT10 80细胞后可以有效的表达目的蛋白并能分泌到细胞外 ,本研究为Endostatin的功能研究及应用于基因治疗提供基础     

用T7噬菌体展示技术筛选HCV核心蛋白的相互作用蛋白

目的 用T7噬菌体筛选系统筛选HCV核心蛋白的相互作用蛋白.方法 应用T7噬菌体展示技术,以通过原核表达的方式得到HCV的核心蛋白作为靶分子,对噬菌体人肝细胞cDNA文库进行筛选,对筛选到的克隆进行DNA序列分析及同源性搜索.结果 经鉴定得到1个阳性克隆,确定了能与HCV核心蛋白相互作用的蛋白为:Smad interacting-protein 1(SIP1).结论 T7噬菌体展示筛选系统是筛选相互作用蛋白的一种简单、快速和有效的手段,筛选到的相互作用蛋白为进一步探讨核心蛋白的致病、致癌机制提供重要依据.