SD大鼠乳鼠胰岛细胞体外培养方法探讨

目的 探讨一种获得足量、纯度高和功能良好的大鼠胰岛细胞的体外培养方法。方法采用胶原酶对胰腺组织进行分次短时间消化；细胞接种18h时，倒置显微镜下观察细胞生长情况；将细胞转入新的培养板培养，定期收集培养液上清。分别检测胰岛素、淀粉酶含量及葡萄糖刺激下的胰岛素分泌水平。结果 SD大鼠乳鼠原代培养的胰岛细胞中成纤维细胞明显减少，双硫腙可染率85％-90％，锥虫兰染色细胞活力90％以上，培养7～11d的细胞分泌功能正常。结论 用胶原酶反复短时间消化胰腺组织，细胞接种后及时转板的方法可获得纯度较高、生长良好、适合实验研究的胰岛单层细胞。     

成年大鼠胰岛的分离纯化及体外培养

目的:探讨大鼠胰岛细胞分离纯化及体外培养方法。方法:胆总管内逆行灌注胶原酶Ⅴ,分次短时间消化胰腺,F ico ll 400间断密度梯度法纯化胰岛,所得胰岛进行培养鉴定。结果:大鼠胰腺消化后胰岛产量为1050±59个胰岛/胰腺,F ico ll 400纯化后产量为498±60个胰岛/胰腺,纯度可达70%,细胞存活率在93%以上,胰岛素释放试验显示高糖刺激后胰岛素释放量为低糖时的1.91倍,表明胰岛细胞功能良好。培养第13天,约有30%~40%胰岛存活,并具有完整的形态结构,胰岛素分泌量约降为最高值的30%。结论:该方法所得胰岛产量、纯度较高,功能良好,是一种较理想的胰岛细胞分离方法。普通培养条件适合胰岛的短期培养。     

大鼠胰岛的分离和纯化

目的 探讨获得足够数量和较高纯度大鼠胰岛的分离和纯化方法.方法 采用V型胶原酶灌注消化法分离成年大鼠胰岛,Ficoll 400非连续密度梯度法纯化胰岛.双硫腙(DTZ)染色鉴定培养的胰岛细胞,锥虫蓝染色检测细胞活性.葡萄糖刺激胰岛素释放试验评价胰岛细胞的功能.结果 分离纯化后大鼠胰岛平均收获量为(480±30)IEQ,纯度大于90%,活性大于90%.在低糖和高糖刺激下,胰岛素分泌量分别为(12.28±0.89)mIU/L、(19.01±1.49)mlU/L,二者相比较.差异有统计学意义(P<0.05),刺激指数为(1.55±0.01).结论 胶原酶V逆行灌注消化胰腺和Ficoll400非连续密度梯度纯化法,可获得高纯度高活率的大鼠胰岛.     

大鼠胰岛细胞分离纯化的实验研究

目的优化胰岛细胞分离纯化的方法,提高胰岛产量、纯度和功能。方法本实验经胰管注射胶原酶、胰腺静止消化分离成年大鼠胰岛,葡聚糖离心纯化,获得胰岛细胞,进行记数和功能鉴定。结果纯化后胰岛收获量为7021±861IEQ/胰腺(IEQ=胰岛当量,一个胰岛当量为一个150μm直径的胰岛),纯度达86%;胰岛形态结构完整,胰岛素释放试验显示胰岛细胞功能良好。结论细节优化可以显著提高胶原酶消化、葡聚糖不连续梯度离心分离胰岛的效率。     

大鼠胰岛细胞的分离纯化及培养

目的　探讨大鼠胰岛细胞分离纯化和培养的方法。方法　采用胰导管逆行灌注Hanks液分离成年大鼠胰岛,Ⅴ型胶原酶消化,不连续密度梯度Ficoll 4 0 0纯化胰岛。用台盼蓝和双硫腙染色检测胰岛活性和纯度,葡萄糖刺激胰岛素释放试验检测胰岛功能。结果　胰岛细胞的收获量为5 4 0±15 0个胰岛 胰腺,活性>90 % ,纯度>90 % ,高糖刺激后胰岛素释放量为低糖刺激的2倍多。结论　胰导管灌注Hanks液,Ⅴ型胶原酶消化和不连续密度梯度葡聚糖纯化胰岛,可以获取数量多,活性和纯度好的胰岛     

成年猪胰岛的分离和纯化

目的观察胶原酶消化法对成年猪胰岛的分离效果.方法采用胶原酶胰导管注射负荷技术,静止消化与物理消化相结合消化分离成年猪胰腺脾叶;不连续密度梯度比重离心纯化,胰岛素释放试验检测胰岛细胞功能.结果胰岛收获量为8339±2305胰岛数/g胰腺,纯化后胰岛数/g胰腺为4367±1876,纯度为85%,胰岛素释放反应良好.结论采用本方法消化分离成年猪胰岛,胰岛细胞产量、纯度较高,功能良好.     

推进式离心管结合单密度梯度法快速纯化大鼠胰岛

目的 探索用简化的单一密度梯度法建立快速纯化大鼠胰岛细胞的方法.方法 用胶原酶P消化分离SD大鼠胰腺,采用自制的推进式离心管以及单一密度(1.090 g/cm3)的HCA-Ficoll-400密度梯度液来纯化大鼠胰岛细胞.通过DTZ染色,在倒置显微镜下计数胰岛细胞的数量和纯度,用胰岛素释放试验检测胰岛细胞的功能.结果 纯化后平均每条SD大鼠胰腺可获得(731±89)个胰岛细胞当量(IEQ),平均纯度为(73.2±9.4)%.平均活率为(92.8±2.4)%.纯化后的胰岛细胞对胰岛素释放刺激反应良好,高糖时胰岛素的释放量为低糖时的3.54±O.79倍(P＜o.001).结论 为各种胰岛细胞的实验研究建立了快速分离纯化胰岛细胞的方法,纯化的胰岛细胞功能良好.     

试管法纯化人胰岛细胞的初步研究

目的　探索用试管法初步建立纯化人胰岛细胞的方法。方法　用胶原酶P两步法消化分离胰腺 ,用试管法通过不连续密度梯度HC -A -Ficoll纯化液纯化人胰岛细胞。通过DTZ染色 ,在倒置显微镜下计数胰岛细胞的数量和纯度 ,用胰岛素释放试验检测胰岛细胞的功能。结果　纯化后平均每个胰腺可获得 (5 35 0 0±2 1 4 6 5 )个胰岛细胞团 ,平均每克胰腺组织可获得胰岛细胞团 (75 0± 2 6 7) ,平均纯度为 72 92 %。纯化后的胰岛细胞对胰岛素释放刺激反应良好 ,高糖时胰岛素的释放量为低糖时的 1 89倍 (P <0 0 1 )。结论　建立了人胰岛细胞纯化的方法 ,纯化的胰岛细胞功能良好     

一种简便分离纯化大鼠胰岛方法的探索

目的　探索可大量获取纯化大鼠胰岛的最佳方法。方法　采用胰管内灌注生理盐溶液 KRBB, 外置胶原酶消化法及用单核细胞分离液Histopaque 1077纯化胰岛。结果　成年Wistar大鼠胰腺消化后能获得 (540±84) 胰岛/胰腺, 纯化后获得 (335±81) 胰岛/胰腺, 纯度可达90%。纯化后的胰岛培养上清液中未检测到胰淀粉酶。胰岛培养1周后, 胰岛素分泌量仍保持较旺盛状态。结论　本方法能获得大量纯度较高且活性好的胰岛, 是一种简便高效的胰岛分离方法。     

半自动消化法分离纯化人胰岛细胞的实验研究

目的 探索用半自动胰腺消化系统建立大规模人胰岛细胞纯化的可靠方法.方法 使用自制的半自动人胰腺消化分离装置及胶原酶P进行人胰腺的消化分离,用COBE2991细胞分离机及HCA-Ficoll纯化人胰岛细胞.通过DTZ染色,在倒置显微镜下计数胰岛细胞的数量和纯度,用胰岛素释放试验检测胰岛细胞的分泌功能.结果 消化后平均每条胰腺可平均获得(38 6201±78 219)个胰岛细胞当量(IEQ),纯化后平均每条胰腺可获得231 420±28 054IEQ,平均每克胰腺组织可获得(3148±317)IEQ,纯化后胰岛细胞平均纯度为(62.81±2.68)%.纯化后的胰岛细胞对胰岛素释放刺激反应良好,高糖(16.7 mmol/L)时胰岛素的释放量为低糖(3.3 mmol/L)时的3.53倍(P≤0.001).结论 成功建立了半自动人胰岛细胞分离、纯化的方法,纯化的人胰岛细胞具有良好的生物活性.     

人胎胰岛细胞的分离培养及其意义

目的 初步探索人胎胰岛细胞的分离培养方法,以期深入研究胰岛细胞的凋亡机制及开展人胰岛细胞移植。方法 采用机械分离、体外胶原酶消化,并通过组织块联合培养、转皿、时间消化差法获取人胎胰岛细胞,观察胰岛细胞生长及开展人胰岛素释放情况。结果 双硫腙（Dithizone）染色显示胰岛纯度约80％～90％,细胞培养至7～9d为其对数生长期,培养至11d可测到胰岛素释放高峰,培养至15d仍具有一定的生物活性。结论 机械分离消化、转皿、时间消化差法可获得生物活性较好的胰岛细胞,为深入探讨胰岛细胞凋亡、胰岛细胞移植提供细胞基础。     

胰腺干细胞与胰岛混合培养对其转化率的影响

目的  研究胰腺干细胞与胰岛混合培养对增加胎鼠胰腺干细胞向β前体细胞转化率的作用及机制。 方法  实验分为胰腺导管干细胞单独培养组（Ⅰ组）,胰岛单独培养组（Ⅱ组）及干细胞-胰岛混合培养组（Ⅲ组）。V型胶原酶消化大鼠胰腺获得胰岛后,使用Ficoll-400梯度离心法纯化胰岛;采用胶原酶消化法获得胎鼠胰腺干细胞进行培养,通过RT-PCR及免疫组织化学染色的方法,检测细胞角蛋白-19（CK 19）、巢蛋白（Nestin）、胰高血糖素和胰岛素等干细胞相关标志物。干细胞诱导培养基中加入纯化的胰岛进行混合培养,通过观察干细胞表达胰岛素的阳性率评价其诱导转化率。结果  V型胶原酶逆行胰管灌注继而Ficoll 400梯度离心可获得生物活性良好的胰岛;所培养的干细胞表达CK-19、Nestin、胰高血糖素,诱导后部分表达胰岛素。干细胞-胰岛混合培养组及干细胞单独培养组诱导后,细胞胰岛素阳性率分别为38.2%和23.9%,差异有统计学意义(P<0.05);CK-19阳性率分别为89.3%和81.6%,其差异亦有统计学意义(P<0.05)。结论  胰腺导管干细胞与胰岛混合培养可提高胰腺导管干细胞向β前体细胞的转化率,其作用与CK-19的表达密切相关。     

小鼠胰岛α细胞的缺失对移植胰岛功能的影响

目的　探讨胰岛α细胞的丢失对胰岛素分泌功能的影响。方法　在人胰岛分离过程中 ,经胶原酶的过度消化造成胰岛周边α细胞缺失 ,用免疫组化及胰岛素 /胰高糖素含量分析予以证实。在体外 ,检测葡萄糖刺激引起的实验性糖尿病小鼠胰岛素的分泌 ;在体内 ,评价胰岛移植后对糖尿病小鼠血糖的调节 ,并研究胰高糖素对α细胞缺失胰岛功能的影响。结果　胶原酶的过度消化引起胰岛周边的α细胞丢失 ,使分离胰岛内胰岛素 /胰高糖素比值明显升高。与正常胰岛相比 ,α细胞缺失胰岛对葡萄糖刺激产生的胰岛素明显降低 ,胰岛素释放在正常胰岛和α细胞缺失胰岛分别为2 2 2 7uU/ml± 32 1uU/ml和 12 4 6uU/ml± 12 6uU/ml(P <0 0 1)。在体内 ,移植α细胞缺失的胰岛到糖尿病的C5 7/BL小鼠后不能有效地纠正动物的高血糖 ,胰岛移植后的平均血糖浓度在正常胰岛组和α细胞缺失胰岛组分别为 :8 9mmol/L± 1 98mmol/L和 2 1 3mmol/L± 2 2mmol/L(P <0 0 1) ,而给予外源性的胰高糖素可以在体外及体内明显改善α细胞缺失胰岛的胰岛素分泌功能。结论　胰岛α细胞的缺失明显降低胰岛的胰岛素分泌功能 ,用外源性的胰高糖素可以改善α细胞缺失胰岛的胰岛素分泌功能。     

人大网膜间充质干细胞的体外培养、鉴定及诱导化分方法

目的建立人大网膜脂肪问充质干细胞（adiposederivedIIlesechymalSteITIcells,ADSCs）的原代培养及诱导分化为脂肪细胞的方法．方法术中取人大网膜脂肪组织,采用胶原酶消化法原代培养,经流式细胞仪鉴定细胞CD44、CD34、CD90和CD45分子、MTTr法测定细胞生长曲线,取P3细胞以3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、胰岛素、地塞米松及吲哚美辛诱导该细胞向脂肪细胞分化,油红O脂肪染色法进行脂肪细胞鉴定．结果培养卅的细胞形态均-呈梭形或漩涡状生长,经流式细胞仪鉴定为ADSCs,细胞生长曲线表明P3细胞增值旺盛,用分化培养基诱导后,细胞形态由梭形变为圆形,细胞体积增大,胞浆内聚集脂肪颗粒,油红0染色鉴定为成熟的脂肪细胞．结论该方法能培养出形态均一的人大网膜ADSCs,经诱导后可向成熟脂肪细胞分化．     

软脂酸对美吡哒刺激的大鼠胰岛β细胞功能的影响

目的:观察软脂酸对美吡哒刺激的鼠胰岛β细胞功能的影响。方法:以0、0.25、0.5、1.0mmol/L软脂酸原代培养SD大鼠胰岛细胞,在24、72、120小时测定上清胰岛素、细胞内胰岛素、甘油三酯含量。结果:不含软脂酸组上清中胰岛素、细胞内胰岛素、甘油三酯含量差别无统计学意义;余各浓度组及各时间组差别有统计学意义。结论:在体外软脂酸抑制美吡哒刺激的鼠胰岛β细胞功能;脂毒性可能是磺脲类药物作用失效的重要原因之一。     

云南小耳猪胰岛细胞的分离和纯化方法

目的探索云南小耳猪胰岛细胞分离和纯化的有效方法.方法采用胶原酶胰导管注射负荷技术,静止消化与物理消化相结合消化分离小耳猪胰腺;不连续密度梯度比重离心纯化,胰岛素释放试验检测胰岛细胞功能.结果胰岛收获量为（4580±257）IEQ/g胰腺,纯化后为（3660±449）IEQ/g胰腺,纯度为80%左右,胰岛素释放反应良好.结论采用本方法消化分离小耳猪胰岛,腱岛细胞产量、纯度较高,功能良好,为进一步成人胰岛细胞的分离纯化提供了实验依据.     

猫胰岛细胞的分离纯化和培养

目的建立猫胰岛细胞分离纯化和体外培养的方法。方法在自制玻棒持续振荡下常规分离胰岛细胞,进行单层细胞培养和组织块培养。采用差速贴壁法。碘乙酸法、消化时间差法去除培养中的成纤维细胞。动态收集单层细胞培养液, 分别用放射免疫法和比色法检测胰岛素和淀粉酶含量。光镜下观察５～３０ｄ细胞生长情况。分别对培养第５、１５、２１天的 细胞进行葡萄糖负荷试验、组织块培养的细胞进行透射电镜检查。结果猫胰岛细胞在体外培养可保持良好的生物学活 性３周或３周以上（组织培养）。结论　在国内首次建立的猫体外胰岛细胞培养方法可行可靠,体外培养第７～２５ｄ的细 胞形态和功能良好,是进行实验研究的极好材料。     

软脂酸对体外原代培养大鼠胰岛细胞凋亡作用的实验研究

目的 观察软脂酸诱导体外原代培养胰岛细胞的凋亡，初步探讨软脂酸在2型糖尿病发病中的机制。方法 应用分离的体外单层培养SD大鼠胰岛细胞，与不同浓度软脂酸(分别为0、0．125、0．250、0．500mmol／L)共同孵育48h，用放免法测定培养液中胰岛素含量，PI／Hoechst33342双染法荧光显微镜观察胰岛细胞凋亡的形态变化。结果 0．250、0．5mmol／L软脂酸可抑制高糖刺激下的胰岛素分泌，促进胰岛细胞的凋亡。结论 软脂酸可诱导胰岛细胞凋亡，凋亡程度与游离软脂酸浓度有关。