RNA干扰抑制视网膜母细胞瘤血管内皮生长因子基因的表达

目的利用RNA干扰技术在视网膜母细胞瘤(retinoblastoma,RB)细胞内诱导RNA干扰(RNAi),抑制血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)基因表达,在体外细胞水平探讨RNAi对视网膜母细胞瘤治疗的可行性。方法构建靶向VEGF基因的siRNA(VEGF-siRNA),转导入RB细胞,在瘤细胞内诱导RNAi,采用RT-PCR、细胞增殖抑制实验、Northern杂交等技术检测siRNA处理前后RB细胞增殖及VEGF基因表达变化。结果成功构建了两种抗VEGF基因的shRNA表达载体,RT-PCR发现VEGF-siRNA在RB细胞系中,能明显抑制VEGF基因的表达,抑制率为72%;对RB细胞生长抑制率达47%;VEGF基因的mRNA表达降低了78%。结论VEGF-siRNA在体外能明显抑制了视网膜母细胞瘤细胞增殖和VEGF基因的表达。     

综合治疗前后视网膜母细胞瘤微血管密度和血管内皮生长因子表达研究

目的 观察视网膜母细胞瘤(RB)未行综合治疗和行综合治疗后微血管密度(MVD)、血管内皮生长因子(VEGF)表达以及与RB肿瘤视神经浸润和综合治疗后复发的关系.方法 61例RB石蜡标本纳入研究.分为未行综合治疗直接摘除眼球(未治疗)组、综合治疗前计划眼球摘除(计划眼摘)组、综合治疗后肿瘤复发(复发)组,3组分别为52、...     

质粒介导RNA干扰抑制视网膜母细胞瘤细胞的血管内皮生长因子表达

目的探讨血管内皮生长因子（VEGF）短发夹RNA（shRNA）表达质粒稳定转染对视网膜母细胞瘤（RB）细胞中VEGF表达的作用。方法构建VEGF shRNA表达质粒p4．1CMV—VEGF shRNA,以脂质体介导其转染两种RB细胞系SO—RB50和HXO—RB44,新霉素筛选结合梯度稀释法获得p4．1CMV—VEGF shRNA阳性RB细胞单克隆,继续培养扩增建立p4．1CMV—VEGF shRNA阳性RB细胞,用荧光定量聚合酶链反应（PCR）法检测RB细胞中VEGF基因的表达,并用酶联免疫吸附（ELISA）法检测RB细胞上清中VEGF蛋白的表达;以与哺乳动物基因组无同源性的shRNA表达质粒p4．1CMV—Neg shRNA作为阴性对照,同时以未做任何处理组作为空白对照。结果成功构建p4．1CMV—VEGF shRNA并获得其表达阳性的RB细胞克隆。阴性对照组和空白对照组SO-RB50细胞的VEGF基因表达量分别为实验组的5．02倍和6．32倍;阴性对照组和空白对照组HXO—RB44细胞分别为实验组的5．70倍和4．86倍。实验组SO—RB50细胞上清中,VEGF蛋白浓度为（187．69±83．89）μg/L,显著低于阴性对照组（822．98±187．98）μg/L和空白对照组（865．76±170．33）μg／L,差异有统计学意义（均P〈0．01）;实验组HXO—RB44细胞上清中,VEGF蛋白浓度为（162．20±66．33）μg／L,与阴性对照组（764．33±164．79）μg／L和空白对照组（828．22±145．94）μg／L比较,差异也有统计学意义（均P〈0．01）。结论VEGF shRNA表达质粒稳定转染可高效抑制RB细胞中VEGF的表达,靶向VEGF的RNA干扰可作为拮抗VEGF并治疗RB的有效手段。（中华服科杂志,2007,43：493-498）     

血管内皮生长因子对人胚胎视网膜血管发生的调节作用

目的研究血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)对人胚胎视网膜血管发生的调节作用。方法收集54例9-40周龄胎儿眼球后壁标本,免疫组织化学染色,光镜观察。结果①VEGF在视网膜的表达呈波峰式分布,高峰在9-13周及26周左右。②节细胞层的梭形细胞（血管内皮细胞前提细胞）、血管内皮细胞呈增殖细胞核抗原(proliferation cell nuclear antigen,PCNA)免疫反应阳性,水平波动,高峰在9-13周及21周前后,此期间梭形细胞不断增殖、分化形成内皮细胞索,经改建形成视网膜内层血管,26、34周起见内核层内、外缘血管内皮细胞呈PCNA免疫反应阳性,并保持至足月。③视网膜VEGF表达量与梭形细胞、血管内皮细胞PCNA表达量呈显著正相关(r=0.736,p＜0.01)。结论VEGF对视网膜血管的发生有显著促进作用。(中华眼底病杂志,1999,15:12-15)     

基质金属蛋白酶-1、血管内皮生长因子在视网膜母细胞瘤中的表达及意义

目的:检测基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinase,MMP)-1及血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VECF)在视网膜母细胞瘤组织中表达情况,分析其与临床分级之间关系的临床意义.方法:采用免疫组化方法检测31例视网膜母细胞瘤组织MMP-1、VEGF表达,对两者的相关性进行统计学分析.结果:MMP-1、VEGF蛋白在视网膜母细胞瘤组织中呈高表达,MMP-1主要表达于肿瘤细胞胞浆或胞膜中,VEGF主要表达于肿瘤细胞胞浆中,MMP-1、VEGF表达和临床分期密切相关(P＜0.05),且其表达在不同临床分期间差异有统计学意义(P＜0.05),MMP-1、VEGF两者表达存在正相关(r=0.787,P＜0.05).结论:MMP-1、VEGF蛋白在视网膜母细胞瘤组织中呈高表达,两者表达与肿瘤临床分级密切相关,可能均参与视网膜母细胞瘤新生血管的生成,在肿瘤的浸润转移等中起重要作用.     

糖尿病大鼠视网膜中血管内皮生长因子的表达

目的 利用糖尿病大鼠动物模型，通过大鼠视网膜中血管内皮生长因子(vascular endothellal growth fac—tor，VEGF)的表达情况，探讨VEGF在糖尿病视网膜病变(Diabetlc Retinopathy，DR)发展过程中作用机理。方法 复制链脲佐菌素(Streptozocin，STZ)糖尿病大鼠动物模型，取不同组、不同时期大鼠视网膜，利用免疫组织化学及原位杂交方法，检测VEGF蛋白质及mRNA的表达情况。结果 正常对照组(H)、血糖恢复组及糖尿病1月组(H1)大鼠视网膜均无VEGF蛋白质及mRNA的阳性表达。糖尿病3月组(M3)未见VEGF mRNA表达，而在内核层及节细胞层VEGF蛋白表达阳性(34％)，此表达与胶质纤维酸性蛋白(GFAP)染色阳性细胞相同。糖尿病5月组(M5)VEGFmRNA表达阳性率为67％，表达位于视网膜各层，内界膜中的表达与GFAP免疫组化阳性分布相同，VEGF蛋白质表达强阳性(89％)，主要位于内核层、节细胞层的细胞及血管上。结论 VEGF在STZ大鼠视网膜中的表达与病程相关，而且VEGF的产生存在着自分泌和旁分泌多种途径。     

血管内皮生长因子在新生小鼠视网膜的表达

目的 研究血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF)与新生小鼠视网膜血管系统形成的内在联系，方法 分别于小鼠出生后3d,1、2、4周以免疫组化观察VEGF在视网膜的表达，并与视网膜铺片和光镜结果相对照。结果 小鼠出生后视网膜血管系统由视盘处呈放射状穿出，逐渐由后极部向周边部，视网膜病理切片显示；出生后3d时，视网膜只有2层，即神经节细胞层和神经母细胞层，内层毛细血管仅限于视网膜后极及中周部，7d时外丛状层形成，出生后14d，视网膜外层毛细血管发育基本完成，出生后28d，视网膜与14d时大致相似，VEGF免疫组化结果显示；出生后3d，阳性信号位于神经节细胞层和神经母细胞层内，外缘，7d时，VEGF明显表达在神经节细胞层，外丛状层和几乎全层内核层，出生后14d及28d。当视网膜血管系统发育基本完成时，VEGF阳性细胞数量和强度都明显减少和减弱。结论 本研究提示，VEGF的表达在空间和时间上与视网膜血管形成密切相关，VEGF的存在对于小鼠视网膜血管系统的形成及维持正常生理功能可能至关重要。     

血管内皮生长因子在视网膜缺血性病变中的应用研究

视网膜缺血性病变是一种严重的眼内病变 ,常伴有眼内新生血管形成 ,可导致严重的眼内并发症 ,如增殖性玻璃体视网膜病变 ,新生血管性青光眼和眼内出血等。近年来 ,许多学者认为视网膜缺血性病变新生血管的发生发展与血管内皮生长因子 (ＶＥＧＦ)有着密切的关系。一、ＶＥＧＦ的     

视网膜母细胞瘤的免疫组织化学研究

本文应用GFAP,S-100蛋白和NSE(PAP法)免疫组织化学染色,探讨视网膜母细胞瘤的组织发生问题。我们认为该肿瘤起源于神经外胚层,具有向神经元系统和神经胶质细胞系统双向分化的潜在趋势,其中更主要的是向神经元系统分化。     

视网膜静脉阻塞家兔血管内皮生长因子的表达

目的研究血管内皮生长因子（Vascular Endothelial Growth Factor，vEGF）在视网膜静脉阻塞（Retinal Vein Occlusion，RVO）中的作用及在视网膜新生血管中的参与机制。方法经玻璃体眼内电凝法建立RVO家兔模型，利用荧光素眼底血管造影（Funds Fluorescein Angiomphy，FFA）观察视网膜及血管的情况，采用免疫组化观察对照组、模型组视网膜组织中VEGF蛋白的表达情况。结果正常家兔视网膜组织中VEGF免疫反应弱。模型组与正常对照组比较，阻塞近端术后2wk、4wk，P〈0．05（P=0．000，0．024），差异有显著性，而术后1wk，P〉0．05（P=0．144），差异不明显。各组两两比较，2wk组与1wk、4wk组，P〈0．001（P=0．000，0．000），差异有显著意义。结论VEGF蛋白表达在视网膜局部缺血时提高，在再通或侧支循环形成时降低，与RVO眼内组织缺血形成存在一定的时空对应关系。     

糖尿病大鼠视网膜血管内皮细胞生长因子及 碱性成纤维细胞生长因子的表达

目的研究糖尿病大鼠视网膜病变早期血管内皮细胞生长因子（VEGF）及碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）作用的关系。方法Wistar大鼠55只，建立糖尿病大鼠模型，随机分为正常对照组（10只），糖尿病1、3、5个月组（每组各15只）。每组分别在视网膜石蜡切片上行VEGF、bFGF原位杂交及免疫组织化学检测，以观察两者的表达情况。结果原位杂交检测结果显示，bFGF在糖尿病3个月组开始有表达，表达个体数百分比为77.8%， 5个月组表达个体数百分比为88.9%；VEGF在糖尿病3个月组无阳性表达，5个月组表达个体数百分比为66.7%。免疫组织化学检测结果显示，bFGF在糖尿病3个月组开始阳性表达，表达个体数百分比为55.6%，5个月组表达个体数百分比为88.9%； VEGF在3个月组表达个体数百分比为33.3%，5个月组表达个体数百分比为88.9%。结论糖尿病大鼠视网膜病变的VEGF表达出现在bFGF之后。(中华眼底病杂志,2005,21:37-40)     

巴曲酶对糖尿病大鼠血视网膜屏障和视网膜血管内皮生长因子表达的影响

目的 研究巴曲酶对糖尿病大鼠血视网膜屏障以及视网膜血管内皮生长因子（VEGF）表达的影响。 方法 将60只大鼠用链尿佐菌素腹腔注射制成糖尿病大鼠模型，分成糖尿病组（n＝20）、40mg/kg巴曲酶注射组（n＝20）和20 mg/kg巴曲酶注射组（n＝20）。另25只正常大鼠为正常对照组。7d 后处死全部大鼠，通过伊凡思蓝法观察各组大鼠血视网膜屏障情况，酶连免疫吸附法分析视网膜总蛋白中的VEGF含量，比较各组结果。 结果 正常对照组大鼠视网膜内渗漏的伊凡思蓝含量明显低于另外3个糖尿病大鼠组（P<0.01）,不同剂量巴曲酶治疗组之间伊凡思蓝含量无明显差异（P>0.05），巴曲酶治疗的2组大鼠伊凡思蓝含量均比糖尿病组大鼠低（P<0.05）。正常对照组大鼠、不同剂量巴曲酶注射的2组大鼠视网膜内VEGF含量明显低于糖尿病大鼠（P<0.01）；正常对照组视网膜内VEGF含量与20 mg/kg巴曲酶注射组比较无明显差异（P＝0.06）；40mg/kg 巴曲酶注射组视网膜内VEGF含量比正常对照组低(P＝0.01)；不同剂量的巴曲酶治疗组之间VEGF含量无明显差异（P＝0.78）。 结论 巴曲酶治疗减轻了糖尿病大鼠血视网膜屏障功能的损伤，降低了VEGF的表达，提示巴曲酶对糖尿病大鼠血视网膜屏障功能有一定的保护作用。 (中华眼底病杂志, 2006, 22: 16-19)     

基质金属蛋白酶-2、基质金属蛋白酶-9和血管内皮生长因子在视网膜母细胞瘤中的表达

　　目的　观察基质金属蛋白酶（MMP）-2、MMP-9和血管内皮生长因子(VEGF)在视网膜母细胞瘤(RB)中的表达及其与RB分化程度和视神经浸润的关系。方法　经病理检查确诊的40例RB眼球石蜡标本纳入研究。按照RB细胞中有无菊形团排列以及RB肿瘤细胞是否浸润视神经分为分化型、未分化型以及视神经浸润、视神经无浸润组。其中,分化型15例,未分化型25例;视神经浸润13例,视神经无浸润27例。采用免疫组织化学方法检测其MMP-2、MMP-9和VEGF的表达,对比分析MMP-2、MMP-9和VEGF表达与肿瘤病理组织分型和视神经是否侵润之间的关系。结果　40例RB中,MMP-2、MMP-9和VEGF的阳性表达率分别为52.5%、57.5% 和72.5% 。未分化型RB中MMP-2、MMP-9和VEGF的阳性表达均高于分化型RB中MMP-2、MMP-9和VEGF的阳性表达,差异有统计学意义(χ²=9.037,9.253,8.095;P＜0.05);有视神经浸润的RB中MMP-2、MMP-9和VEGF的阳性水平均高于无视神经浸润RB中MMP-2、MMP-9和VEGF的阳性水平,差异有统计学意义(χ²=11.045,10.243,8.956;P＜0.05)。RB中MMP-2、MMP-9和VEGF的表达呈正相关关系(r=0.126,0.314;P＜0.05)。结论　RB细胞内有MMP-2、MMP-9和VEGF的表达。MMP-2、MMP-9表达与VEGF表达存在相关性。MMP-2、MMP-9和VEGF的表达水平与视神经浸润存在密切的关系。       

新生血管性青光眼患者眼内液血管 内皮生长因子的检测

目的了解新生血管性青光眼(neovascular glaucoma, NVG)患者房水及玻璃体中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)的含量以及对虹膜新生血管发生的影响。方法应用酶联免疫吸附测定法(enzyme linked immu nosorbent assay, ELISA)分别对11例NVG患者行内眼手术时抽取的房水、玻璃体22个标本以及同期6例黄斑裂孔手术患者(对照组)房水、玻璃体12个标本进行VEGF检测。结果NVG患者房水、玻璃体中VEGF含量分别为(1.451±0.247)、(1.610±0.125) ng/ml,较对照组房水、玻璃体中的 VEGF含量(0.189±0.038)、(0.201±0.055) ng/ml明显增高, 两组间差别有非常显著性意义(t=12.007,P<0.001;t=26.057,P<0.001)。结论NVG患者房水、玻璃体中VEGF浓度显著增高,提示VEGF在NVG患者虹膜新生血管形成过程中可能具有一定作用。(中华眼底病杂志,2001,17:305-306)     

鼠角膜碱烧伤后血管内皮细胞生长因子在其角膜中的表达及意义

目的：探讨角膜碱烧伤后血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF)在鼠角膜中的表达及意义。方法：采用1mol/L氢氧化钠溶液烧伤Sprayue-Dawley(SD)大鼠角膜,建立炎症性角膜新生血管动物模型;用免疫印迹分析SD大鼠角膜烧伤后不同时间段VEGF蛋白在角膜中的表达量;免疫组织化学染色方法检测SD大鼠角膜烧伤后VEGF蛋白在角膜各层中的分布。结果：正常SD大鼠角膜中未检出VEGF蛋白;伤后6h,鼠角膜可检测出VEGF蛋白;伤后96h时,角膜中VEGF蛋白达高峰;伤后168hVEGF蛋白表达量下降,伤后SD大鼠角膜基质层,尤其是毗邻于烧灼区的浅基质层中有大量炎性细胞浸润,浸润的炎性细胞和新生血管内皮细胞均有VEGF蛋白表达。结论;炎性细胞分泌的VEGF蛋白参与了炎症性角膜新生血管增殖的调控,对新生血管的生长有诱导和维持作用。     

缺氧诱导因子-1α和血管内皮生长因子干扰性RNA对人血管内皮细胞血管内皮生长因子表达的抑制

目的 探讨缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）和血管内皮生长因子（VEGF）小片段干扰性RNA（siRNA）对人血管内皮细胞VEGF表达的影响。 方法 构建HIF-1α siRNA重组质粒。将体外培养的人血管内皮细胞（HUVEC-12）分成常氧（20%）组和低氧（1%）组。低氧组中，采用脂质体Lipofectamine ^TM 2000（LF2000）分别转染空载体质粒（空载体组）、HIF-1α siRNA（HIF-1α组）、VEGF-₁₆₅ siRNA（VEGF组）和HIF-1α siRNA+VEGF₁₆₅ siRNA（共转染组）。低氧组中未转染的细胞为对照组。采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）鉴定基因转染效率；RT-PCR和免疫细胞化学法检测各组细胞中VEGF基因和蛋白表达的变化。 结果 成功构建HIF-1α siRNA重组质粒。人血管内皮细胞转染24 h后，HIF-1α siRNA和VEGF-₁₆₅ siRNA重组质粒有表达。常氧组细胞中仅见微弱的VEGF mRNA和蛋白表达，而低氧组表达明显上调；HIF-1α组、VEGF组和共转染组表达较对照组减弱，其中共转染组抑制效果最明显。 结论 HIF-1α和VEGF₁₆₅ siRNA能有效抑制人血管内皮细胞VEGF的表达。     

低氧诱导人视网膜血管内皮细胞中乙酰肝素酶和血管内皮生长因子相关性研究

目的 观察人视网膜血管内皮细胞（HREC）低氧模型中乙酰肝素酶（Hpa）、血管内皮生长因子(VEGF)和RNA 聚合酶-Ⅱ (Pol-Ⅱ)的表达变化,探讨低氧性视网膜新生血管形成中Hpa和VEGF的相关性及可能机制。方法 使用低氧模拟剂氯化钴（CoCl2）造成HREC低氧模型,分为4组,分别为正常对照组、低氧诱导组、磷酸甘露戊糖硫酸盐（PI-88）组和空白对照组。低氧诱导组为含CoCl2 100 μmol/ml的培养液培养48 h;PI-88组为含CoCl2 100 μmol/L和Hpa竞争性抑制剂PI 88 5 μg/ml的培养液干预48 h;空白对照组为等量PBS干预HREC 48 h。免疫荧光染色法观察正常对照组和低氧诱导组HREC中Hpa、VEGF以及Pol Ⅱ的表达。蛋白质免疫印迹（Western blot）检测各组间Hpa和VEGF蛋白表达变化。 结果免疫荧光染色结果显示,低氧诱导组HREC细胞质内Hpa荧光和VEGF荧光均较正常对照组增强;PI-88组细胞质内VEGF荧光较低氧诱导组减弱。低氧诱导组细胞核内Hpa较正常对照组明显增强,且分布与Pol-Ⅱ相吻合。Western blot检测结果显示,与正常对照组比较,低氧诱导组Hpa蛋白和VEGF蛋白表达均明显升高,差异有统计学意义（Hpa：F=-4.005,P＜0.05;VEGF：F=-4.063,P＜0.05）;PI-88组VEGF蛋白表达较低氧诱导组VEGF蛋白表达降低,差异有统计学意义（F=5.963,P＜0.05）。结论 低氧诱导的HREC中,Hpa的表达增高,导致VEGF的增加,促进了视网膜新生血管形成。     

反义RNA抑制人视网膜色素上皮细胞VEGF分泌的研究

目的　探索应用血管内皮生长因子 (VEGF12 1)的反义RNA抑制人视网膜色素上皮细胞 (RPE)VEGF表达的可行性。方法　构建编码反义hVEGF12 1真核表达质粒 ,转入人RPE细胞。将稳定表达外源基因的细胞分别置于大气氧环境 ( 2 1%O2 )或缺氧环境 ( 1%O2 )中培养 ,以空白细胞为对照 ,18h后收集上清液 ,ELISA测定其中VEGF的浓度 ,将此上清液加入人脐静脉血管内皮细胞 (HUVEC) ,观察其对细胞生长的影响。结果　反义VEGF转染能使RPE细胞VEGF的分泌量降低 62 7%。缺氧条件下 ,RPE细胞大量分泌VEGF ,18h时细胞培养上清液能刺激HUVEC细胞增殖 18 4% (P <0 0 1)。同样状态下 ,转染反义VEGF的RPE细胞培养上清液则无明显促内皮细胞生长作用 (P >0 0 1)。结论　本实验构建的反义VEGF12 1质粒能通过下调RPE细胞VEGF的蛋白分泌水平 ,有效抑制缺氧情况下该细胞上清液对血管内皮细胞的生长刺激作用