Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1和核因子E2相关因子2对大鼠脑缺血再灌注损伤机制

目的探讨大鼠脑缺血再灌注后Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1(Keap1)-核因子E2相关因子2(Nrf2)信号通路介导的氧化应激相关蛋白Keap1、Nrf2和血红素加氧酶1(HO-1)的表达变化。方法将80只SD大鼠随机分为假手术组和模型组,每组40只,模型组采用线栓法制备局灶性脑缺血大鼠模型,假手术组以假手术代替缺血再灌注,仅分离右侧颈总动脉而不插入线栓,分别于模型建立后12h,1d,2d,3d时间点,每组处死10只大鼠。采用化学荧光法测定脑组织活性氧水平,ELISA法检测还原型谷胱甘肽(GSH)活性;分别采用qRT-PCR和Western blot方法观察Keap1、Nrf2和HO-1mRNA及其蛋白表达水平。结果与假手术组比较,模型组各时间点脑组织GSH活力显著降低,活性氧水平,Keap1、Nrf2和HO-1表达水平显著升高(P0.05,P0.01)。与12h、3d比较,模型组再灌注1dKeap1、Nrf2和HO-1mRNA(2.82±1.10 vs 2.35±0.96和2.06±0.88,1.62±0.60 vs 1.36±0.59和1.18±0.56,2.32±1.05 vs 1.83±0.97和1.65±0.70)及其蛋白表达最高(1.35±0.14 vs 0.73±0.07和0.94±0.11,0.48±0.04 vs 0.42±0.03和0.44±0.03,0.98±0.17 vs 0.86±0.15和0.82±0.14,P0.05)。结论大鼠脑缺血再灌注损伤后激活了Keap1-Nrf2信号通路,从而发挥抗氧化应激作用。     

细胞外信号调节激酶抑制剂对间歇低氧大鼠认知功能的影响

目的探讨细胞外信号调节激酶(ERK)抑制剂对间歇低氧大鼠海马CA1区神经细胞自噬相关蛋白表达及认知功能的影响。方法成年雄性Wistar大鼠96只,采用随机数字法分为正常对照组(UC组)、5%间歇低氧组(5%IH组)、ERK抑制剂组(U0126组),每组又分为7、14、21、28 d 4个时间点,每个时间点8只大鼠。应用透射电镜观察大鼠海马CA1区神经细胞线粒体、自噬体等超微结构的改变;免疫组织化学法检测海马CA1区ERK1/2、Beclin-1、微管相关蛋白1轻链3(LC3)蛋白表达;TUNEL检测海马CA1区神经细胞凋亡情况;Morris水迷宫检测各组大鼠学习记忆功能。结果与UC组比较,5%IH组7、14、21、28 d海马CAl区神经细胞ERK1/2蛋白表达明显增加(P0.05);与5%IH组比较,U0126组7、14、21、28 d海马CAl区神经细胞ERK1/2蛋白表达明显降低(15.48±2.00 vs 27.91±2.15,15.51±1.93 vs 35.86±2.58,15.57±2.09 vs 47.04±3.96,15.43±1.97 vs 59.03±4.09,P0.05)。与UC组比较,5%IH组和U0126组7、14、21、28 d海马CAl区神经细胞Beclin-1和LC3蛋白表达及神经元凋亡指数明显增加(P0.05);与5%IH组比较,U0126组7、14、21、28 d海马CAl区神经细胞Beclin-1和LC3蛋白表达及神经元凋亡指数明显降低(P0.05)。与UC组比较,5%IH组和U0126组大鼠7、14、21、28 d逃避潜伏期明显延长,跨越目标象限时间明显缩短(P0.05);与5%IH组比较,U0126组大鼠7、14、21、28 d逃避潜伏期明显缩短,跨越目标象限时间明显延长(P0.05)。结论 ERK抑制剂U0126通过阻断ERK信号通路抑制大鼠海马神经细胞自噬的激活,进而减轻神经细胞损伤,改善认知功能。     

电针脑缺血大鼠水沟穴调节微小RNA-328促进血管新生的机制研究

目的观察电针脑缺血大鼠水沟穴对缺血半暗带区血管新生及微小RNA(miR-328)、CD44mRNA和蛋白表达的影响,探讨电针脑缺血大鼠水沟穴调节miR-328促血管新生的机制。方法 SD雄性大鼠80只,随机分为正常组、假手术组、模型组、电针组,每组各5只。Longa法评估各组大鼠神经功能缺损,免疫组织化学染色法观察CD34变化,实时荧光定量PCR技术检测miR-328、CD44mRNA表达水平,Western blot技术检测CD44蛋白表达水平。结果假手术组与正常组大鼠在神经功能缺损、CD34为标记的血管新生、miR-328和CD44表达无差异(P0.05)。与假手术组比较,模型组神经功能缺损、血管新生、miR-328、CD44表达明显增加(P0.01);与模型组比较,电针刺组神经功能缺损程度改善[(2.6±0.6)分vs(3.4±0.6)分,P0.01],血管新生增加显著[(80.40±3.85)vs(67.60±2.79)分,P0.01],miR-328 1.22±0.37 vs 2.02±0.22和CD44mRNA 4.35±1.33 vs 7.16±1.83,CD44蛋白0.42±0.04 vs 0.55±0.06表达降低(P0.05,P0.01)。结论电针水沟穴可通过调节miR-328及靶基因CD44表达水平,促进缺血半暗带区的血管新生。     

胰岛素治疗对糖尿病大鼠肾脏自噬水平及纤维化影响的观察

目的观察胰岛素治疗对糖尿病大鼠肾脏纤维化的影响。方法将24只健康清洁级雄性SD大鼠随机分为正常对照组(NC,n=8)、糖尿病模型组(DM,n=8)和胰岛素治疗组(DMA,n=8)。HE、Masson染色,qRT-PCR和Western blot分别检测肾组织中自噬及纤维化相关指标的变化。结果HE、Masson染色结果显示,DM组肾小管上皮细胞空泡变形甚至萎缩脱落,肾小管基底膜增厚,炎症细胞浸润;肾小管及肾间质大量蓝色胶原纤维沉积。qRT-PCR结果显示,与DM组比较,DMA组肾组织中平滑肌肌动蛋白(α-SMA)[(1.06±0.42)vs(0.22±0.02)]和胶原I(Col I)mRNA[(18.03±8.42)vs(6.36±1.89)]表达下降(P0.05),自噬相关蛋白Beclin1mRNA[(0.74±0.26)vs(1.35±0.61)]表达上调(P0.05)。Western blot结果显示,与DM组比较,DMA组肾组织中α-SMA[(0.06±0.02)vs(0.02±0.01)],Col I[(0.74±0.18)vs(0.22±0.12)]以及泛素结合蛋白(p62)[(0.7±0.1)vs(0.3±0.11)]表达减少(P0.05),Beclin1[(0.02±0.01)vs(0.05±0.01)]和自噬标记蛋白(LC3)[(0.02±0.01)vs(0.06±0.04)]表达增加(P0.05)。结论自噬相关蛋白可能有参与胰岛素对糖尿病肾脏疾病治疗的作用机制。     

低强度运动改善急性心肌梗死后大鼠运动能力与骨骼肌自噬机制

目的观察低强度运动对急性心肌梗死(简称心肌梗死)后大鼠有氧运动能力和骨骼肌自噬水平的影响,探讨运动改善有氧运动能力的机制。方法 30只雄性SD大鼠,体质量180～200 g,随机分为假手术组、心肌梗死组和心肌梗死运动组。结扎左冠状动脉前降支制备心肌梗死模型。术后3 d心肌梗死运动组在跑台上进行适应性运动,术后1周进行低强度跑台运动,跑台速度从10～15递增至15～20 m/min,运动时间从10～30递增至30～60 min/d,5 d/周,共4周。运动结束检测大鼠最大运动距离和运动时间、心脏质量、心脏质量指数和心肌梗死面积。透射电镜观察腓肠肌自噬体或自噬溶酶体形态。Western blot检测腓肠肌自噬相关蛋白Beclin-1和微管相关蛋白1轻链3(LC3)-Ⅰ、Ⅱ表达。结果心肌梗死组和心肌梗死运动组心肌梗死面积分别为左心室面积的(30.8±5.5)%和(27.6±5.0)%。心肌梗死组心脏质量和心脏质量指数高于假手术组[(1 097.0±97.4)比(740.8±68.7)mg,(3.0±0.4)比(2.1±0.2)mg/g,均P0.01];心肌梗死运动组心脏质量[(854.4±65.3)mg]和心脏质量指数[(2.5±0.2)mg/g]低于心肌梗死组(均P0.01)。心肌梗死组最大运动距离和运动时间低于假手术组[(391.9±55.7)比(535.4±24.3)m,(20.6±2.1)比(26.4±0.8)min,均P0.01];心肌梗死运动组最大运动距离[(478.3±53.5)m]和运动时间[(23.7±1.5)min]高于心肌梗死组(均P0.05)。电镜下假手术组腓肠肌细胞内偶见自噬溶酶体,心肌梗死组自噬溶酶体散在分布,心肌梗死运动组自噬溶酶体簇状分布。心肌梗死组Beclin-1蛋白表达和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ轻度升高,但与假手术组相比,差异无统计学意义。心肌梗死运动组Beclin-1蛋白表达和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ高于心肌梗死组(P0.05)和假手术组(P0.01)。结论低强度运动改善急性心肌梗死大鼠有氧运动能力,其机制可能与增强骨骼肌自噬水平有关。     

FOXO3a蛋白对脑缺血损伤大鼠细胞自噬的影响研究

目的研究FOXO3a蛋白对脑缺血损伤大鼠细胞自噬的影响。方法选取20只Wistar大鼠,经过1周饲养时间后,随机分为正常组和脑缺血组,其中正常组10只,脑缺血组10只,采用四动脉结扎法构建脑缺血模型。采用免疫组化法检测FOXO3a蛋白、Bax蛋白及B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)蛋白表达水平,采用双盲法测定神经功能评分,采用Western Blot检测细胞自噬相关蛋白Beclin-1、LC3细胞自噬功能的改变,用倒置荧光显微镜观察细胞自噬现象的产生。结果脑缺血组大鼠FOXO3a蛋白表达高于正常组(P0.05);脑缺血组大鼠Bax蛋白表达高于正常组,Bcl-2蛋白表达低于正常组(P0.05);脑缺血组大鼠神经功能评分高于正常组(P0.05);脑缺血组细胞自噬相关蛋白Beclin-1、LC3及细胞自噬率高于正常组,均具有统计学意义(P0.05)。结论 FOXO3a蛋白在大鼠脑缺血损伤中高表达,Bax蛋白在大鼠脑缺血损伤中高表达,Bcl-2蛋白在大鼠脑缺血损伤中低表达,对细胞自噬具有诱导作用。     

大鼠局灶性脑缺血预处理后生长停滞与DNA损害可诱导基因34表达的变化

目的观察脑缺血预处理(brain ischemia preconditioning,BIP)对大鼠脑缺血再灌注后,生长停滞与DNA损害可诱导基因34(GADD34)mRNA及蛋白表达的影响。方法健康雄性SD大鼠120只,随机分为假手术组、脑缺血组、BIP组,每组40只,后2组行大脑中动脉栓塞法制模后,各组于再缺血后12 h、1、2和3 d 4个时间点观察,每个时间点10只。采用2次线栓法制备大鼠局灶性脑缺血预处理模型,用原位杂交法检测GADD34 mRNA表达,western blot法观察各组GADD34蛋白表达。结果与假手术组比较,脑缺血组12 h GADD34 mRNA及蛋白表达均达高峰,随再灌注时间延长,其表达逐渐下降,但1、2和3 d时仍高于假手术组(P<0.05,P<0.01);BIP组GADD34 mRNA及蛋白表达各时间点均较脑缺血组明显升高(P<0.05,P<0.01)。结论 BIP可诱导GADD34mRNA及蛋白的表达。     

曲美他嗪对心肌梗死大鼠心肌细胞凋亡和自噬及心功能的影响

目的:观察曲美他嗪对心肌梗死模型大鼠缺血心肌细胞凋亡、自噬以及心功能的影响。方法:成年雄性,SD大鼠, SPF级, 90只,随机分为假手术组、模型对照组和曲美他嗪干预组,假手术组暴露心脏后不结扎前降支,模型对照组结扎前降支,曲美他嗪干预组结扎前降支后给予10 mg·kg~(-1)·d~(-1)曲美他嗪,连续4周。心肌细胞凋亡使用TUNEL法检测,LC3Ⅱ自噬蛋白使用Western blot检测。Vevo2100小动物超声仪测定LVESD、短轴缩短分数(FS)和EF。结果:HE病理切片显示曲美他嗪干预心肌细胞坏死和间质炎性细胞浸润较模型对照组减轻。模型对照组心肌凋亡指数为(20.87±5.64)%,显著高于曲美他嗪干预组的[(10.26±1.88)%,P0.01]。曲美他嗪干预组心肌凋亡指数显著高于假手术组的[(0.62±0.14)%,P0.01]。假手术组、模型对照组和曲美他嗪干预组心肌自噬蛋白LC3Ⅱ相对灰度值分别为[(0.13±0.02)vs.(0.42±0.09)vs.(0.73±0.14),P0.01]。假手术组心肌自噬蛋白LC3Ⅱ表达显著低于模型对照组,模型对照组又显著低于曲美他嗪干预组。术后4周,曲美他嗪干预组LVEDD显著低于模型对照组(P0.05),而FS和EF又显著高于模型对照组(P0.05)。结论:曲美他嗪显著减低心肌梗死模型大鼠心肌细胞凋亡和增加心肌细胞自噬,有利于心功能的恢复。     

重组人血小板活化因子乙酰水解酶对脑缺血后候选可塑性相关基因15蛋白的表达

目的探讨重组人血小板活化因子乙酰水解酶(rPAF-AH)对局灶性脑缺血大鼠缺血区候选可塑性相关基因15(CPG15)蛋白表达的影响。方法选择SD大鼠45只,随机分为假手术组、生理盐水组、rPAF-AH组,每组15只,后2组建立大脑中动脉栓塞模型。选取2、7、14d3个时间点,每个时间点各组分别取5只用于实验。开颅取视交叉后的冠状切块,匀浆提取总蛋白,运用Western blot技术检测CPG15蛋白表达水平。结果生理盐水组和rPAF-AH组2、7、14d缺血区CPG15蛋白表达明显高于假手术组,7d缺血区CPG15蛋白表达最高,且rPAF-AH组7d缺血区CPG15蛋白表达明显高于生理盐水组(1.48±0.04 vs 1.12±0.05,P0.01)。结论 rPAF-AH能够上调局灶性脑缺血大鼠CPG15蛋白表达,可能在脑缺血的神经重构中发挥积极作用。     

参芎注射液对大鼠脑缺血再灌注后神经细胞凋亡的相关研究

目的探讨参芎注射液对大鼠脑缺血再灌注后神经细胞凋亡及凋亡相关因子caspase-8、抗凋亡因子FLIP的蛋白及其mRNA表达的影响。方法选择SD大鼠100只随机分为正常组(10只)、假手术组(10只)、模型组(40只)和参芎注射液治疗组(干预组,40只),采用TUNEL法检测神经细胞凋亡,免疫组织化学及RT-PCR法分别检测caspase-8、FLIP的蛋白和mRNA表达。结果与正常组和假手术组比较,模型组大鼠各时间点凋亡细胞明显增加(P<0.01),caspase-8、FLIP的蛋白和mRNA表达明显增强(P<0.05,P<0.01)。与同时间点模型组比较,干预组大鼠凋亡细胞明显减少,caspase-8蛋白和mRNA表达明显减弱(P<0.05,P<0.01),FLIP蛋白和mRNA表达分别于再灌注6 h和12 h时间点明显增强(P<0.05)。结论参芎注射液能通过减弱caspase-8表达及增强FLIP表达,从而拮抗大鼠脑缺血再灌注后神经细胞凋亡。