前列地尔调控PI3K/AKT/mTOR通路抑制心肌缺血再灌注损伤诱导的自噬

目的 探讨前列地尔[又称前列腺素(PG)E1]对心肌缺血再灌注损伤的影响及其可能的作用机制。方法 进行原代乳鼠心肌细胞的分离和培养，将细胞随机分为对照组、缺氧/复氧(H/R)组、PGE1组和PGE1+磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)抑制剂(LY294002)组，除对照组外，其余组进行H/R处理，CCK-8检测细胞活力；试剂盒检测肌酸激酶同工酶(CK-MB)、乳酸脱氢酶(LDH)、丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)水平；流式细胞术检测细胞活性氧(ROS)产生和凋亡；Western印迹检测细胞微管相关蛋白轻链(LC)3、自噬效应蛋白(Beclin)1、p62、磷酸化(p)-PI3K、PI3K、p-蛋白激酶B(AKT)、AKT、p-雷帕霉素靶蛋白(mTOR)和mTOR蛋白表达。结果 成功分离培养原代乳鼠心肌细胞。与对照组相比，H/R组心肌细胞增殖能力显著降低，LDH、CK-MB、MDA和ROS水平显著升高，SOD水平显著降低，凋亡率、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和Beclin1蛋白表达显著升高，p62、p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT和p-mTOR/mTOR蛋白表达显著降低(均P<...     

二甲双胍激活腺苷酸活化蛋白激酶抑制心肌缺氧再灌注损伤介导的NOD样受体蛋白3炎症体活化的研究

目的:评价腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)介导的NOD样受体蛋白3(NLRP3)炎症体活化在二甲双胍后处理保护心肌缺氧再灌注(H/R)损伤中的作用及机制。方法:选取健康雄性SD大鼠64只,进行麻醉,开胸直接取心脏,将心脏悬挂在Langendoff灌注装置上建立离体心肌缺氧再灌注模型。随机分为4组(n=16):持续灌注组、缺氧再灌注组(H/R组)、二甲双胍后处理组(MET组)、二甲双胍后处理+AMPK抑制剂(CC)组(MET+CC组)。各组进行相应处理后,监测血流动力学指标,测定心肌梗死面积,观察心肌细胞超微结构,ELIS法测定心肌组织内乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)水平,心肌组织原位缺口末端标记法(TUNEL)染色检测细胞凋亡发生;蛋白免疫印迹(Western blot)法测定磷酸化AMPK、AMPK、NLRP3、活化含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-1(caspase-1)、IL-1β和GAPDH蛋白表达水平。结果:与持续灌注组比较,H/R组心肌梗死面积增大(P0.05),LDH、CK-MB水平增加(P0.05),心肌细胞凋亡率显著升高(P0.05);与H/R组比较,MET组心肌梗死面积缩小(P0.05),LDH、CK-MB水平降低(P0.05),心肌细胞凋亡率下降(P0.05),磷酸化AMPK/AMPK比值显著增加(P0.05),而NLRP3、活化caspase-1和IL-1β表达显著下降(P0.05);与MET组比较,MET+CC组抑制AMPK激活后心肌梗死面积进一步增大(P0.05),LDH和CK-MB水平进一步升高(P0.05),心肌细胞凋亡率明显升高(P0.05);磷酸化AMPK/AMPK比值降低(P0.05),而NLRP3、活化caspase-1和IL-1β表达显著升高(P0.05)。结论二甲双胍通过激活AMPK信号通路,抑制心肌内NLRP3炎症体活化,从而减轻离体大鼠心肌缺氧再灌注损伤。     

AMPK激动剂预处理对肝缺血再灌注损伤大鼠模型的影响及相关机制

目的初步探讨腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)激动剂预处理对大鼠肝缺血再灌注损伤大鼠模型的影响及可能机制。方法 54只健康SPF级SD雄性大鼠随机平均分为3组。5-氨基咪唑-4-甲酰胺核苷酸(AICAR)组(实验组)、缺血再灌注组(对照组)和假手术组,每组18只。每组分别于肝缺血再灌注术后12、24、72 h取材,检测ALT、AST、TBil、TNFα和IL-6浓度,肝三磷酸腺苷(ATP)水平,HE染色观察肝组织学变化,实时荧光定量PCR检测AMPK、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、葡萄糖转运蛋白4型(GLUT4)、多药耐药蛋白2(MRP2)的mRNA相对表达水平,Western Blot检测磷酸化AMPK、磷酸化mTOR、磷酸化GLUT4、MRP2的蛋白表达水平。多组间比较采用重复测量资料的方差分析,进一步两两比较采用LSD-t检验。结果 HE染色结果显示,实验组肝损伤程度在各时点都较对照组轻。术后12、24、72 h,对照组血清ALT、AST、TBil、IL-6、TNFα均高于实验组和假手术组,而实验组均高于假手术组(P值均0.05)。术后12、24、72 h,实验组肝组织ATP水平均高于对照组和假手术组,而对照组均低于假手术组(P值均0.05)。术后12、24、72 h,实验组AMPK、GLUT4、MRP2 mRNA相对表达水平及磷酸化AMPK、磷酸化GLUT4、MRP2蛋白表达水平均高于对照组和假手术组(P值均0.05);对照组AMPK mRNA相对表达水平及磷酸化AMPK蛋白表达水平均高于假手术组,而GLUT4、MRP2 mRNA相对表达水平及磷酸化GLUT4、MRP2蛋白表达水平均低于假手术组(P值均0.05)。实验组mTOR mRNA相对表达水平及其磷酸化mTOR蛋白表达水平均低于对照组和假手术组(P值均0.05);对照组mTOR mRNA相对表达水平及其磷酸化mTOR蛋白表达水平均高于假手术组(P值均0.05)。结论 AICAR预处理能激活AMPK信号通路,改善能量代谢途径,减轻肝脏炎症反应,从而降低肝缺血再灌注损伤程度。     

P62通过调控自噬与抗氧化通路保护大鼠脑缺血再灌注损伤

目的探讨大鼠脑缺血再灌注后P62介导的微管结合蛋白轻链3(LC3)和Kelch样ECH相关蛋白1(kelchlike ECH-associated protein 1,Keap1)表达的变化。方法将80只SD大鼠随机分为假手术组和模型组(采用线栓法制备局灶性脑缺血大鼠模型),每组40只,分别于12h,1、2和3d取材,每个时间点10只。采用化学荧光法测定脑组织活性氧水平,透射电子显微镜观察神经细胞中自噬及凋亡形态结构变化,分别采用qRT-PCR和Western blot法观察P62和LC3和Keap1 mRNA和蛋白在缺血半暗带表达变化。结果与假手术组比较,模型组大鼠各时间点脑组织中活性氧水平显著升高,1d时达峰值[(238.23±25.51)%vs (134.60±12.48)%,P0.01];透射电子显微镜下,模型组大鼠神经细胞线粒体肿胀,可见不同程度自噬小体形成,细胞发生迟发性神经元死亡。与假手术组比较,模型组各时间点P62mRNA和蛋白表达明显下调,1d达最低值(1.915±0.711 vs 1.253±0.679;0.10±0.02 vs 0.16±0.04,P0.01);各时间点LC3、Keap1mRNA和蛋白表达显著升高,1d达到最高值(0.862±0.501 vs 1.450±0.245,1.125±0.421 vs 2.037±0.730;1.25±0.17 vs 0.36±0.07,1.35±0.14 vs 0.24±0.05,P0.05,P0.01)。结论大鼠脑缺血再灌注损伤后LC3和Keap1表达水平增加,而P62表达减少,诱导了细胞自噬和氧化应激的发生。     

α-硫辛酸通过mTOR通路抑制缺血再灌注诱导的PC12细胞自噬性凋亡

目的研究α-硫辛酸(LA)对PC12细胞缺血再灌注损伤的保护作用及其分子机制。方法传代培养PC12细胞,PC12细胞缺氧/复氧(氧糖剥夺4 h,复氧18 h)模拟缺血再灌注损伤模型。实验分为正常组、缺氧/复氧组、缺氧/复氧+α-LA、缺氧/复氧+自噬抑制剂巴弗洛霉素(Baf)A1组。CCK8筛选α-LA的有效作用浓度;流式细胞术检测细胞凋亡变化;Western印迹检测细胞促凋亡蛋白B细胞淋巴瘤(Bcl-2)相关X蛋白(Bax)、酶切caspase-3、自噬标志分子SQSTM-1/P62、LC3-Ⅱ/Ⅰ及mTOR通路的表达变化。结果缺氧/复氧显著降低PC12细胞的存活率(P<0.05),Western印迹结果显示Bax、酶切caspase-3、LC3-Ⅱ/Ⅰ的表达水平均显著升高(P<0.05),P62和p-mTOR的表达水平降低(P<0.05);与缺氧/复氧组比较,给予α-LA和Baf A1均能显著降低缺氧/复氧诱导的凋亡水平(P<0.05)。结论α-LA通过抑制缺氧/复氧诱导的过度自噬进而减少过度自噬诱导的细胞凋亡。     

mTOR信号介导的自噬在褪黑素减轻心脏缺血/再灌注损伤中的作用

目的 探讨mTOR信号介导的自噬在褪黑素（melatonin,Mel）减轻心脏缺血/再灌注损伤中的作用。方法 将60只8周龄C57BL/6小鼠随机分为假手术（Sham）组、单纯褪黑素10 mg/(kg·d)处理(Mel)组、缺血/再灌注（ischemia reperfusion,I/R）组和褪黑素10 mg/(kg·d)干预I/R（Mel+I/R）组。采用冠状动脉左前降支结扎术制备心肌I/R模型,HE染色观察心肌组织形态学变化,试剂盒检测各组血清中LDH的含量,TUNEL染色检测各组细胞凋亡情况,蛋白印迹法（Western blot）检测自噬相关蛋白微管相关蛋白1轻链3（microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3）I和II、Beclin1和mTOR磷酸化的表达,免疫荧光染色法检测LC3B的表达。结果 与Sham组相比,Mel组各项指标均无明显变化;I/R组心肌纤维断裂明显排列紊乱,血清中LDH含量明显增加（P<0.01）,TUNEL阳性细胞明显增多（P<0.01）,LC3II和Beclin1表达显著升高（P<0.01）,而磷酸化mTOR的表达降低（P<0.01）,免疫荧光结果显示LC3B表达增加（P<0.01）; Mel+I/R组可明显减轻心肌纤维的断裂,降低血清中LDH含量（P<0.01）,减少TUNEL阳性细胞数（P<0.01）,减少LC3II和Beclin1的表达（P<0.01）,降低免疫荧光染色中LC3B的表达（P<0.01）。结论 褪黑素通过调节mTOR信号介导的自噬减轻心脏I/R损伤。     

红景天苷抑制缺血/再灌注诱导的心肌微血管内皮细胞凋亡

目的探讨红景天苷对大鼠心肌微血管内皮细胞(CMECs)缺血/再灌注损伤的影响及其可能的机制。方法分离培养大鼠CMECs,建立模拟缺血/再灌注模型,分为对照组、模拟缺血/再灌注(SI/R)组、SI/R+红景天苷组(1.0、2.5、5.0、10.0μmol/L)组。待红景天苷最适浓度确认为5μmol/L后,增加SI/R+红景天苷+LY[磷酯酰肌醇3激酶(PI3k)特异性抑制剂LY294002]组。MTT法检测细胞增殖能力,细胞划痕实验检测细胞迁移能力,TUNEL法检测细胞凋亡,采用Western blot检测Akt磷酸化水平,以及凋亡抑制蛋白生存素和Bcl-2的表达。结果与对照组相比较,SI/R组CMECs增殖能力明显降低(0.410±0.011比0.200±0.014,P=0.041),凋亡率显著上升(4.15%±0.12%比26.05%±0.97%,P=0.018),而与SI/R组相比,SI/R+红景天苷组(1.0、2.5、5.0、10.0μmol/L)细胞增殖能力明显升高并呈剂量依赖性,细胞迁移率,而凋亡率则明显下降(均为P<0.05),LY294002组凋亡指数与SI/R+红景天苷组相比显著提高(22.03%±0.98%比16.28%±1.40%,P=0.029)。与SI/R组相比较,红景天苷可显著上调Akt的磷酸化,以及上调抗凋亡蛋白生存素和Bcl-2的表达(均为P<0.05),而此作用可被LY294002显著抑制(均为P<0.05)。结论红景天苷可显著抑制缺血/再灌注损伤诱导的CMECs凋亡,促进细胞存活,改善细胞功能,其作用机制可能与激活PI3K/Akt,以及上调凋亡抑制蛋白生存素和Bcl-2表达相关。     

槲皮黄酮通过AMPK信号通路保护营养缺乏心肌H9c2细胞的损伤

目的研究槲皮黄酮对营养缺乏心肌H9c2细胞损伤的保护作用,及其对AMP依赖的蛋白激酶(AMPK)信号通路的影响。方法体外培养H9c2细胞,并将其分为对照组、营养缺乏组(NS组)、槲皮黄酮组(NS+Qu组)、Compound C组(NS+CC组)、Compound C+槲皮黄酮组(NS+CC+Qu组)。CCK8法和Hoechst染色法检测H9c2细胞增殖活性,流式细胞术检测H9c2细胞凋亡率和线粒体膜电位,ATP测定分析H9c2细胞中ATP含量,Western blot分析H9c2细胞中剪切型半胱天冬酶3(Cleaved caspase-3)、PTEN诱导假定激酶1(PINK1)、线粒体融合蛋白2(MFN2)和磷酸化AMP依赖的蛋白激酶(p-AMPK)蛋白的含量。结果与对照组比较,NS组H9c2细胞增殖活力明显降低(P0. 05),细胞凋亡率和促凋亡蛋白Cleaved caspase-3的含量明显升高(P0. 05),ATP含量、线粒体膜电位(AMRE)和线粒体自噬蛋白PINK1的含量明显降低(P0. 05)。与NS组比较,NS+Qu组H9c2细胞增殖活力明显升高(P0. 05),细胞凋亡率和Cleaved caspase-3蛋白的含量明显降低(P0. 05),ATP含量、AMRE值、PINK1和p-AMPK蛋白的含量明显升高(P0. 05)。与NS+Qu组比较,NS+CC+Qu组H9c2细胞增殖活力及AMPK磷酸化水平明显降低(P0. 05)。结论槲皮黄酮可通过调节AMPK信号通路活性改善营养缺乏诱导的心肌H9c2细胞损伤。     

黄芩苷对再灌注心肌细胞保护作用及与心肌细胞自噬的相关性

目的 :探讨黄芩苷对再灌注心肌细胞保护作用及与心肌细胞自噬的相关性。方法 :将48只大鼠随机分为4组(n=12):假手术组,假手术+黄芩苷组,缺血再灌注组,黄芩苷处理组。术前7天每日1次灌胃,建立各组模型。统计各组同时间点的血流动力学及再灌注45 min后心肌梗死面积情况,免疫印迹试验(Western blot)测定再灌注30 min后心肌微管相关蛋白(LC3-Ⅱ)及自噬体膜标记蛋白(Becl-1)表达情况,再灌注30 min后检测线粒体膜通道转换孔(m PTP)开放情况。结果 :假手术组和假手术+黄芩苷组心肌梗死面积极小,不便进行比较。缺血再灌注组心肌梗死面积(41.32±1.85)%,黄芩苷处理组心肌梗死面积(23.30±1.60)%,两组差异有统计学意义(P0.001)。再灌注30min后LC3-Ⅱ及Becl-1蛋白表达量,缺血再灌注组(LC3-Ⅱ:1.051±0.005,Becl-1:1.169±0.002)和黄芩苷处理组(LC3-Ⅱ:0.863±0.009,Becl-1:0.943±0.005)较假手术组(LC3-Ⅱ:0.763±0.007,Becl-1:0.647±0.014)明显增加(P0.01);黄芩苷处理组较缺血再灌注组明显下降(P0.01)。再灌注30 min后烟酰胺腺嘌呤=核苷酸(NAD+)含量(nmol/mg),缺血再灌注组(6.02±0.33)和黄芩苷处理组(9.56±0.53)较假手术组(11.28±0.37)明显下降(P0.01);黄芩苷处理组较缺血再灌注组明显增加(P0.01)。结论 :黄芩苷对正常心肌细胞自噬无影响,但能显著减少缺血再灌注心肌梗死面积,降低再灌注后的过度自噬发生,其机制可能通过抑制m PTP开放从而减少自噬的相关诱导因素发挥作用。     

高压氧预处理对正常和糖尿病大鼠缺血再灌注心肌细胞凋亡的影响

目的 探讨高压氧预处理对正常和糖尿病大鼠缺血再灌注心肌细胞凋亡及Bcl-2和Bax蛋白的影响.方法 雄性Wistar大鼠75只,随机分为正常大鼠对照组,正常大鼠缺血-再灌注组,正常大鼠高压氧预处理组,糖尿病大鼠对照组,糖尿病大鼠缺血-再灌注组,糖尿病大鼠高压氧预处理组,检测各组心肌凋亡及心肌Bax、Bcl-2蛋白表达.结果 ①正常大鼠高压氧预处理组凋亡指数与正常大鼠缺血-再灌注组相比[(33.15±4.36)％vs(41.72±3.47)％],糖尿病大鼠高压氧预处理组凋亡指数与糖尿病大鼠缺血-再灌注组相比[(41.69±5.79)％vs( 52.73±6.71)％]均明显降低,有统计学差异(P＜0.05).②正常大鼠高压氧预处理组Bax蛋白灰度值与正常大鼠缺血-再灌注组相比[(170.17±7.35)vs(157.50±8.12)],糖尿病大鼠高压氧预处理组Bax蛋白灰度值与糖尿病大鼠缺血-再灌注组相比[(141.17±6.77) vs (134.0±4.73)]均明显降低,有统计学差异(P＜0.05).③正常大鼠高压氧预处理组Bcl-2蛋白灰度值与正常大鼠缺血-再灌注组相比[(158.67±7.69) vs (171.83±8.66)],糖尿病大鼠高压氧预处理组Bcl-2蛋白灰度值与正常大鼠缺血-再灌注组相比[(166.0±10.53)vs(183.33±9.15)]相比均明显增高,有统计学意义(P＜0.05).结论 高压氧预处理对正常及糖尿病大鼠均有抗心肌细胞凋亡的作用,但对正常大鼠保护作用更强,其保护机制可能与下调Bax蛋白表达,上调Bcl-2蛋白表达有关.