偶联多种单链抗体免疫纳米微粒的制备方法及鉴定

【摘要】 目的 建立一种多单链抗体修饰氧化铁纳米微粒的方法。方法 利用聚乙二醇（polyethylene glycol, PEG）及羧基（COOH group）修饰的氧化铁纳米微粒（Iron Oxide Nanoparticles, IONPs）,以及抗MUC4、抗CEACAM6及抗CD44v6单链抗体（Single chain antibodies, scAbs）,通过EDC/Sulfo?NHS交联剂将IONPs?PEG与3种scAbs进行交联,构建IONPs?PEG?multi scAbs复合物,再利用zeta粒度仪、透射电子显微镜（TEM）对IONPs?multi scAbs复合物进行表征,同时,在IONPs?PEG表面偶联荧光抗体,通过荧光强度测定其偶联效率;再鉴定复合物的抗原识别特异性及在放置1个月、6个月后评估复合物水溶液稳定性。结果 偶联3种scAbs后,IONPs?PEG?multi scAbs复合物的平均粒径为（23.6±0.5） nm,粒径分布集中,zeta电位约（?17.3±06） mV;TEM显示粒径约10 nm,荧光强度测定结果提示抗体偶联效率约为75%,细胞免疫荧光实验结果提示IONPs?PEG?multi scAbs复合物对高表达MUC4、CEACAM6及CD44v6分子的胰腺癌细胞BxPC?3具有特异性识别能力,证实该复合物具有良好的抗原识别特异性;在放置1个月、6个月后,偶联复合物的溶液分散性良好,放置6个月后平均粒径约（23.9±0.8） nm,zeta电位约（?17.6±0.4） mV,TEM拍照提示粒径约10 nm,细胞免疫荧光提示复合物抗原识别特异性良好。结论 本研究利用EDC/Sulfo?NHS交联剂组合,将3种单链抗体交联到PEG和羧基修饰的IONPs表面,构建IONPs?PEG?multi scAbs复合物,该方法偶联效率高,且复合物具有粒径小、分散性好、抗原识别特异性及水溶液稳定性好的特性。     

聚酰胺-胺型树形分子脂质体对人结肠癌细胞摄入和细胞毒性的影响

目的 研究聚酰胺-胺型树形分子(PAMAM)脂质体对人结肠癌细胞摄入和细胞毒性的影响.方法 以1,2-二油烯氧基-3-三甲氨基丙烷(DOTAP)和二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)为材料制备脂质体,将质粒PEGFP-N1与脂质体和PAMAM混合分别制备PAMAM脂质体/DNA转染复合物和PAMAM/DNA转染复合物.透射电镜观察转染复合物的形态、粒径,zeta电位分析仪测定载质粒纳米粒子的zeta电位,离心法和紫外分光分度仪测定载质粒纳米粒子的包封率,将上述两种载质粒纳米粒子转染人结肠癌细胞SW620、人乳腺癌细胞MCF-7、血管内皮细胞ECV304,流式细胞仪测定增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的入胞量,MTT法对PAMAM脂质体/DNA复合物和PAMAM/DNA复合物的毒性进行评价.结果 PAMAM脂质体载质粒纳米粒子的粒径与PAMAM载质粒纳米粒子的粒径差异无统计学意义[(192±16)nm比(189±19)nm,P＞0.05],zeta电位前者高于后者[分别为(42±7)mV和(32±7)mV,P＜0.05],包封率两者之间差异无统计学意义[(82±7)%比(84±6)%,P＞0.05].PAMAM脂质体载质粒纳米粒子和PAMAM载质粒纳米粒子转染SW620、MCF-7、ECV304细胞后,PAMAM脂质体/DNA组细胞EGFP基因摄入量高于PAMAM/DNA组,差异有统计学意义(P＜0.05).前者细胞存活率高于后者,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 脂质体修饰聚酰胺-胺型树形分子可提高基因转染细胞的效率,降低细胞毒性.     

靶向阳离子脂质体递送乳腺癌抑制作用的研究miRNA对三阴性

目的探讨靶向阳离子脂质体(CLPs)递送miRNA对三阴性乳腺癌(TNBC)相关特异性抑瘤基因的作用。方法通过薄膜分散法评估理化性质对阳离子脂质成分进行优化,制备具有理想表征性质的新型透明质酸(HA)CLP,表征CLPs的粒径和zeta电位。对CLPs进行表面HA靶向修饰,并通过激光共聚焦观察和流式细胞术的荧光检测评估HA-CLPs进入细胞的能力。利用EdU细胞增殖检测和细胞划痕实验对负载miRNA的HA-CLPs对细胞产生的生物学效应进行研究。结果薄膜分散法制备的CLPs纳米颗粒分散性良好、形态均一,呈中空球形结构,CLPs平均粒径为(180.6±3.4)nm、平均zeta电位为(43.4±2.8)mV。经过HA修饰后的纳米颗粒及运载miR-205后的纳米颗粒平均粒径分别为(236.65±6.9)nm、(205.6±2.2)nm,平均电位分别为(29.1±5.4)mV、(11.2±1.1)mV。经过激光共聚焦检测和流式细胞术荧光检测,验证了HA-CLPs能够顺利将miR-205运送至细胞内而分布在细胞核附近,且HA的靶向作用显著。EdU实验和细胞划痕实验验证了运载入TNBC细胞内的miR-205和miR-34a对其增殖和迁移的抑制作用。结论制备的靶向阳离子脂质体对TNBC细胞具有较强的靶向特异性,且通过靶向递送miR-205和miR-34a对TNBC细胞的增殖和迁移起到了一定的抑制作用。     

癌胚抗原相关细胞黏附分子-6在人肝门部胆管癌细胞株QBC939中的表达及其在侵袭转移中的作用

目的 观察癌胚抗原相关细胞黏附分子-6(CEACAM6)在人肝门部胆管癌细胞株QBC939中的表达,探讨其在侵袭转移中的作用.方法 实时定量聚合酶链反应(Real-time PCR)检测CEACAM6在QBC939细胞中的表达;构建CEACAM6的RNA干扰(RNAi)慢病毒载体,并感染QBC939细胞,Real-time PCR验证RNAi效果;Transwell侵袭试验检测QBC939细胞体外侵袭力的改变.结果 CEACAM6在QBC939细胞中高表达.成功构建CEACAM6基因RNAi慢病毒载体并转染QBC939细胞.和对照组比较,RNAi组CEACAM6 mRNA表达抑制率为93.1％ (P ＜0.05);Tran-swell实验提示RNAi后,侵袭细胞OD570 RNAi组(0.09 ±0.01)明显少于对照组(0.13 ±0.02),侵袭抑制率为69.2％ (P ＜0.05).结论 CEACAM6在QBC939细胞中高表达,其表达程度与肝门部胆管癌细胞侵袭转移能力呈正相关.     

双靶向整合素αvβ3及VEGFR2微泡造影剂的制备及其对肝癌细胞寻靶能力的分析

本研究采用生物素亲和素法将整合素αvβ3及VEGFR2抗体与Usphere微泡结合, 制备双靶向整合素αvβ3及VEGFR2微泡造影剂。制备成功的双靶向整合素αvβ3及VEGFR2微泡分布均匀, 平均粒径(1 205.06±103.70)nm, 电位(-27.0±3.0)mV。将微泡与MHCC-97H肝癌细胞共孵育, 免疫荧光法检测显示双靶向微泡组微泡荧光与细胞核DAPI荧光强度比值显著高于单靶向微泡组和非靶向微泡组(P<0.05)。提示本研究成功制备双靶向整合素αvβ3及VEGFR2微泡造影剂, 可与MHCC-97H细胞特异性结合, 可作为一种监测肿瘤生长的分子影像探针。     

抗内毒素类脂A单链抗体基因的克隆、表达和初步鉴定

为探索 G 杆菌脓毒症的治疗问题,应用基因工程技术从本所制备的分泌抗内毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞中提取 mRNA,然后反转录成 cDNA 第一链,用特异性轻、重链引物扩增反应产物,获得重链(340bp)和轻链(320bp)基因片段,经纯化后将轻链和重链基因用一多肽连接物连接,构成单链抗体基因片段。此单链抗体基因经再次 PCR 扩增后克隆入 PCANTAB_5噬菌粒中再转化于感受态的 TG_1大肠杆菌中,通过噬菌体抗体库技术筛选重组噬菌体,结果在 TG_1细菌中表达了9G_6单链抗体基因。ELISA 阻断试验初步证明了该单链抗体能阻断其亲本单克隆抗体对内毒素的结合。提示:抗内毒素单链抗体可为脓毒症的治疗提供一条途径。     

癌胚抗原相关黏附分子6促进肿瘤的发生、发展

癌胚抗原相关黏附分子6(carcinoembryonic antigenrelated cell adhesion molecule 6,CEACAM6),属于免疫球蛋白超家族,在多种实体肿瘤中高表达,对肿瘤的发生、发展有重要的促进作用。CEACAM6分子促进肿瘤转移、侵袭和血管生成,并抑制肿瘤凋亡、增加肿瘤抗药性,其高表达往往预示病人预后差。随着CEACAM6分子促进肿瘤发生、发展重要性的凸显,其在肿瘤生物学行为中的分子机制也得到了进一步的阐明,为肿瘤的早期诊断和治疗提供研究基础。针对该分子的特异性抗体可明显抑制肿瘤的侵袭、转移并增加凋亡,且增加细胞对化疗药物的敏感性,这极大推动     

利用噬菌体展示技术制备人血管生成素2单链抗体

目的 用纯化的人血管生成素2(Ang2)蛋白,通过噬菌体展示技术从非免疫小鼠噬菌体展示抗体库中淘选、鉴定Ang2单链抗体.方法 以纯化的人Ang2蛋白为抗原,对非免疫小鼠噬菌体展示抗体库进行富集和筛选,获得Ang2单链抗体,利用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western blot法检测目的蛋白的表达并测序.结果 经过3轮富集和筛选,获得了1个能特异性识别Ang2蛋白的阳性噬菌体克隆,DNA测序表明其含有完整的单链抗体基因片段,大小约750 bp,表达蛋白相对分子质量约33.7×103；通过SDS-PAGE进一步实现Ang2单链抗体(phage-Ang2-scFv)的鉴定.结论 成功分离并鉴定人Ang2-scFv,为进一步的功能学研究奠定了基础.     

重组腺相关病毒载体表达抗表皮生长因子受体抗体对胰腺癌细胞株抑制作用的研究

目的 构建能在体内长期表达抗表皮生长因子受体(EGFR)抗体的重组腺相关病毒(rAAV)载体,观察其对人胰腺癌细胞株的抑制作用.方法 将抗人EGFR单链抗体可变区(SCFV)基因插入腺相关病毒载体的Kpn Ⅰ和BglⅡ位点,构建成含抗EGFR单链抗体基因的重组腺相关病毒载体(rAAV-anfiEGFR).设立对照组(rAAV1-EGFP组)和实验组(rAAV1-anti EGFR组),观察抗EGFR单链抗体蛋白的表达情况.采用Western blot检测抗体蛋白的表达、CCK-8法和流式细胞仪检测6种人胰腺癌细胞株(PCT-3、SW1990、Capan-1、ASPC-1、MiaPaCa-2及PANC-1细胞)的抑制率和凋亡率.两组比较采用t检验.结果 抗EGFR单链抗体蛋白能在6种人胰腺癌细胞株中表达,对照组和实验组胰腺癌ASPC-1细胞抑制率分别为1.1%±2.4%和15.1%±3.5%,两组比较,差异有统计学意义(t=6.598,P＜0.05).对照组和实验组PANC-1细胞凋亡率分别为7.0%±3.0%和11.4%±2.5%,两组比较,差异无统计学意义(t=1.952,P＞0.05);对照组和实验组SW1990、ASPC-1、Capan-1、PCT-3、MiaPaCa-2细胞凋亡率分别为1.1%±0.8%、1.5%±0.7%、1.7%±1.2%、1.1%±0.7%、2.2%±1.1%和17.6%±2.2%、46.9%±3.9%、20.0%±2.8%、12.1%±1.6%、31.1%±2.5%,两组比较,差异均有统计学意义(t=12.208,19.846,10.405,10.909,18.327,P＜0.05).结论 成功构建了携带抗EGFR单链抗体基因的rAAV载体,其表达的抗EGFR单链抗体蛋白对人胰腺癌细胞株有明显的抑制作用.     

磁转染MUC1/Y基因入树突状细胞抗膀胱肿瘤的免疫效应研究

目的：研究体外磁转染人MUC1/Y基因至人树突状细胞（DC）的可行性,以及在体外诱导特异忡抗MUC1／Y膀胱癌的免疫效应。方法：以葡聚糖磁性纳米颗粒（DMN）作为载体,在多聚赖氨酸（PLL）的辅助下,通过静电作用结合MUC1／Y基因的真核表达载体pEGFP-C1—MUC1／Y．在铜-硼-锡磁块的固定磁场作用下转染至人DC中,荧光显做镜下以及流式细胞仪观察其转染效率;再将这种转基因DC与自体T细胞共培养,观察其致敏的细胞毒性T淋巴细胞（CTL）对MUC1／Y特异性抗膀胱癌（膀胱肿瘤BIU87细胞系）的杀伤活性,即分别用LDH释放法检测CTL杀伤活性和透射电镜观察CTL诱导靶细胞凋亡情况：ELISA法测定基冈修饰后的DC刺激自体T细胞分泌IFN-γ了的能力。结果：pEGFP-C1／-MUC1／Y转染效率为15％左右,荧光显微镜下可观察到明显绿色荧光蛋白的表达;与自体T细胞混合培养后能诱导出湿著的MUC1/Y特异性的CTL对BIU87细胞的杀伤实验表明T-DC-MUC1的杀伤活性约为52％,显著高于埘照组T-DC诱导的CTL;住透射电镜下也可以清楚的观察到部分BIU87膀胱肿瘤细胞出现了细胞核核仁消失,染色质浓集于核膜周围等早期凋亡表现;基因修饰后的DC能刺激自体T细胞分泌高水平的IFN-γ,与未转染的DC相比差异有统计学意义（P〈0．05）。结论：葡聚糖磁性纳米颗粒（DMN）在固定磁场的作用下成功将MUC1/Y基因转入DC,并可有效诱导出特异性的抗MUC1/Y膀胱癌的免疫效应。     

多烯紫杉醇免疫脂质体对结肠癌细胞的靶向放射增敏作用

目的探讨免疫脂质化的多烯紫杉醇对LoVo细胞的放射增敏作用。方法制备偶联CEA抗体的多烯紫杉醇脂质体,测定抗体活性及细胞结合率,分析其对LoVo细胞体外放射增敏作用。结果多烯紫杉醇免疫脂质体平均粒径为：(213．0±17．4)nm、包封率为97．6%、较多烯紫杉醇脂质体处理的LoVo细胞荧光强度差异有统计学意义(P＜0．01)；偶联抗CEA单抗的免疫活性无明显改变；2nmol/L和100nmol/L多烯紫杉醇免疫脂质体均可提高LoVo细胞放射敏感性。SER_(D0)分别为1．70、1．78,而2nmol/L多烯紫杉醇脂质体对其放射敏感性的的影响不明显。SER_(D0)为1．02。结论多烯紫杉醇免疫脂质体可特异的与LoVo细胞结合并具有放射增敏作用。     

慢病毒介导的人黏蛋白1基因修饰的树突状细胞体外抗结肠癌免疫效应

目的 观察慢病毒介导的人黏蛋白1(MUCl)核心肽串联重复(TR)基因修饰树突状细胞(DC)后体外诱导的特异性抗结肠癌免疫效应.方法 CD14+外周血单核细胞诱导DC,感染含人MUC1TR基因的慢病毒表达载体pLV-MUC1,感染后DC按DC/T=1∶10与自体T淋巴细胞共培养21 d诱导产生细胞毒性T淋巴细胞(CTL),CTL与肿瘤靶细胞以5∶1、10∶1、20∶1的效靶比共孵育,乳酸脱氢酶(LDH)释放法和Elispot法分别检测CTL体外杀伤活性及干扰素(IFN)-γ的释放,以空载pLV-GFP感染DC组和未感染DC组作为对照进行比较.结果 pLV-MUC1感染DC后荧光显微镜下可见绿色荧光表达,流式检测感染效率约为32％;诱导产生的CTL对MUC1和HLA-A2双阳性的HCT-116肿瘤细胞的杀伤活性[E/T =5∶1时为(12.74±1.91)％,10∶1时为(23.14±2.97)％,20∶1时为(35.38±3.15)％]显著高于对照组,差异有统计学意义(P＜0.01);感染后DC诱导的CTL分泌IFN-γ的能力明显高于对照组,差异有统计学意义(P＜0.01).结论 慢病毒介导的MUC1核心肽TR基因修饰的DC可有效诱导体外特异性抗结肠癌免疫效应.     

正常肺组织和肺癌组织激光诱发自体荧光光谱

目的　分析正常肺组织和肺癌组织的激光诱发自体荧光光谱 ,特征 ,探讨激光诱发自体荧光光谱区分正常肺组织和肺癌组织的可行性。方法　收集肺癌手术标本 39例 ,使用三倍频YAG激光(波长 35 5nm)和光学多道分析仪 (OMA)测定肺癌组织和正常肺组织的激光诱发荧光光谱 ,寻找其自体荧光光谱特征并与病理结果比较。结果　 (1)正常肺组织和肺癌组织的主峰位置不同 [(471 6± 5 2 )nm对 (46 1 9± 4 3)nm],向右偏移 (P <0 0 0 1) ;(2 )肺癌组织的相对荧光强度大于正常肺组织 [(2 42 2 7± 434 9)对 (1485 4± 46 2 1) ](P <0 0 0 1) ;(3)正常肺组织在 5 6 0nm及 6 0 0nm处有 2个次峰 ,而肺癌组织平滑下降 ,正常肺组织在 5 80nm与 6 0 0nm的荧光强度比为 0 831± 0 178;肺癌为 1 2 6 9± 0 147(P <0 0 0 1)。结论　正常肺组织和肺癌组织的激光诱发自体荧光光谱有明显区别 ,可用于区分二者。     

荧光探针法研究阳离子多聚物基因载体Polybrene与DNA的相互作用

目的:用荧光探针法研究海美溴铵(PB)和DNA之间的相互作用。方法:将一定量的PB溶液逐渐加入到DNA/溴化乙锭(EB)复合物的水溶液中,在535nm处激发,测定595nm的荧光强度,观察体系荧光强度随PB浓度变化而发生的改变。用同样的方法观察PB对Hoe-DNA和4,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)-DNA体系荧光强度的影响,Hoe的激发和发射波长分别设置为350nm和460nm,DAPI为340nm和450nm。通过荧光Scatchard分析法获得PB对DNA的结合常数。结果:随着PB浓度的增加,EB与DNA的结合减弱。通过对PB存在下EB-DNA体系的荧光分析,获得了PB与DNA之间的结合常数为1.8×105/mol。PB的加入大大提高了Hoe-DNA体系的荧光强度,同时Hoe的最大发射波长由最初的490nm蓝移至460nm。Hoe-DNA体系和DAPI-DNA体系的荧光强度均随着聚合物单体的浓度与DNA磷酸基团的浓度比值(N∶P比值)的增加而增加,并且在N∶P比值等于或接近1.0时达到最大。结论:DNA与PB之间复合物的形成减弱了DNA与嵌入剂的结合,但却能增强DNA和沟区结合探针之间的相互作用。提示PB与DNA的结合可能特异性地影响了DNA的二级结构。     

聚酰胺-胺型树状聚合物介导基因转染的实验研究

目的 探讨聚酰胺-胺型树状聚合物(PAMAM)作为基因载体,体外转染成纤维细胞的可行性.方法 ①将pEGFP与PAMAM按不同电荷比混合,通过原子力显微镜(AFM)对PAMAM和PAMAM-pEGFP复合物进行粒径、形态的表征;凝胶电泳实验和Zeta电位实验检验PAMAM与pEGFP质粒在不同电荷比时形成复合物的能力;通过DNA共沉淀试验检测不同电荷比下PAMAM对质粒pEGFP的包封率.②将不同电荷比的PAMAM-pEGFP复合物转染至小鼠胚胎成纤维细胞系,48 h后荧光显微镜下观察转染情况.③CCK-8实验检测转染后细胞的增殖活性.结果 PAMAMpDNA复合物的粒径约10 nm.PAMAM在电荷比大于2时就能有效包裹质粒.随电荷比的增加,复合物的Zeta电位增加,在溶液中的稳定性和分散性也提高.包封率在电荷比为4∶1时达95％.转染效率随电荷比的增加呈增高趋势,其中在4∶1和6∶1时转染效率达到最高.细胞毒性与电荷比有关,电荷比大于6∶1时,PAMAM对细胞生长有毒性作用.结论 PAMAM纳米载体可安全有效地介导基因转染,是一种理想的基因递送系统.     

不同粒径的5-FU乙醇脂质体的制备及透瘢痕研究

目的 研究不同粒径的5-氟尿嘧啶(5-FU)乙醇脂质体的包封率及对体外透瘢痕的影响,对瘢痕组织经皮给药的吸收规律和机制进行初步观察.方法 将来源于增生性瘢痕患者切除的瘢痕组织,去除皮下脂肪后分成A、B两组,A组表皮完整,B组去除表皮层.制备不同粒径的5-FU乙醇脂质体,其平均粒径分别为(216±19)、(107±13)、(65±10)nm.采用透析法检测5-FU乙醇脂质体的包封率,使用Franz扩散池行体外透瘢痕测试,用荧光显微镜观察载有罗丹明660的5-FU乙醇脂质体在瘢痕的真皮层和表皮层的分布及其强度.结果 用TEM检测多分散性指数小于0.2的乙醇脂质体,其扩散性好,大小均一;5-Fu乙醇脂质体的包封率随粒径的逐渐增大而增加,分别为12.17%、34.64%、41.02%;荧光显示,透瘢痕的深度和荧光强度则随粒径的减小而增大和增强;经Image-Pro Plus6.0图像分析软件计算得出,对应单位长度的像素灰度值分别为21.80、31.71、113.33.而A、B两组比较,其差异具有统计学意义(P<0.05).结论 乙醇脂质体是一种很有效的药物载体,可将5-FU大量地载入瘢痕组织的真皮层;本实验结果可为瘢痕的局部给药提供一些实验数据.     

聚乳酸羟基乙酸-泊洛沙姆纳米微粒作为siRNA载体的可行性

目的 探讨聚乳酸羟基乙酸-泊洛沙姆(PLGA-Poloxamer)纳米微粒作为siRNA载体的可行性.方法 乳剂溶解扩散法制备PLGA-Poloxarner纳米微粒,观察纳米微粒的物理特征,探讨不同制备条件对纳米微粒物理特征的影响,测定其对含siRNA片段的质粒DNA的包裹效率,检测释放的质粒DNA的结构稳定性,验证纳米微粒对质粒DNA的保护作用,测定其作为载体的基因转染效率.结果 PLGA-Poloxamer纳米微粒呈球形,粒径约为(210.1±24.3)nm,zeta电位为(-0.43 ±1.43)mV,包裹效率为31%.该微粒对质粒DNA有保护作用,释放的质粒DNA结构稳定,转染效率达28%.结论 PLGA-Poloxamer纳米微粒有望成为较理想的siRNA载体.     

携带超抗原SEA基因的白蛋白纳米载体的构建及其治疗膀胱癌潜能研究

目的 构建一种非病毒载体基因投递系统-携带超抗原葡萄球菌肠毒素A(SEA)基因的白蛋白纳米载体,观察白蛋白纳米粒表征并探讨其潜在的靶向基因投递作用和强大的抗瘤机制.方法 采用去溶剂化法制备白蛋白纳米粒,平均粒径(253.1±11.9)nm,Zeta电位(-34.0±4.5)mV,PDI 0.43±0.04;抽提SEA基因质粒(pSEA)260/280:1.84±0.02,pSEA浓度:(85.54±1.43)mg/L;经生物活性及基因测序鉴定后耦合SEA基因质粒和白蛋白纳米载体,并观察耦合物的稳定性及白蛋白纳米载体对SEA基因的保护作用.结果 成功构建携带超抗原SFA基因的白蛋白纳米载体,平均粒径(118.9±4.8)nm,Zeta电位(-43.9±10.5)mV,PDI 0.19±0.02,基因转载率为(97.61±0.06)%,性质稳定、分散性较好,体外实验表明白蛋白纳米载体能保护SEA基因免受DNase Ⅰ的降解.结论 获得符合超抗原SEA基因转染要求的白蛋白纳米载体.

Abstract：

Objective To assess the characteristics of human serum albumin nanoparticles (HSA-NP) as a nonviral vector system for delivery staphylococcal enterotoxin A (SEA) gene and probe into its potential targeted antitumor mechanism.Methods HSA-NP and plasmid containing SEA gene (pSEA)encapsulated in HSA (pSEA-HSA-NP) were prepared by a desolvation-crosslinking method.HSA-NP had a mean size of (253.1 ± 11.9) nm,zeta potential of ( -34.0 ±4.5) mV,polydispersity index of 0.43 ±0.04.The superantigen SEA gene was extracted by the Endo-Free Plasmid Maxi Kit,260/280 of pSEA was 1.84 ±0.02 and the concentration of pSEA was ( 85.54 ± 1.43 ) mg/L.pSEA was verified by sequencing and biological activity survey,the stability of pSEA-HSA-NP was investigated by laying for 10 days at room temperature,and the size and zeta potential were remeasured and contrasted with the samples 10 days before.HSA-NP protecting pSEA from degradation of DNase I was detected by gel electrophoresis.Results Electrophoretic mobility analysis and fluorescent labeling revealed that pSEA-HSA-NP was successfully constructed.PSEA-HSA-NP had a mean size of ( 118.9 ±4.8) nm,zeta potential of ( -43.9 ± 10.5 ) mV,polydispersity index of 0.19 ±0.02 and pSEA encapsulation efficiency of (97.61 ±0.06)%.The characteristics of pSEA-HSA-NP solution laying for 10 days at room temperature indicated a better stability and polydispersity.HSA-NP stabilizing pSEA against DNase I in vitro was also testified by gel electrophoresis.Conclusion pPSEA-HSA-NP served the transfecting needs of superantigen SEA gene.     

肝靶向性Gal-PEG-PEI纳米载体介导psiRNA转染HepG2细胞效率的检测

目的 检测肝细胞靶向性Gal-PEG-PEI纳米基因载体介导psiRNA转染HepG2细胞的效率.方法 纳米粒径仪和透射电镜测定Gal-PEG-PEI/psiRNA复合物的粒径和形态,转染HepG2细胞,48 h后用流式细胞仪测定转染效率.转染前加入1 mg半乳糖观察其半乳糖竞争拮抗结果.结果 Gal-PEG-PEI/psiRNA复合物的粒径随N/P的增大而减小,最小粒径为81.1 nm;Gal-PEG-PEI载体的转染效率为(37.34±2.50)%,明显高于PEG-PEI、LipofectamineTM 2000及裸psiR-NA;加入竞争拮抗剂半乳糖后Gal-PEG-PEI的转染效率下降至3.60%.结论 Gal-PEG-PEI纳米基因载体对HepG2细胞有较高的转染效率,具有良好的肝细胞靶向性.     

靶向VEGFR2光声/超声双模态造影剂的制备及体外寻靶实验研究

目的制备一种特异性靶向新生血管内皮细胞的光声/超声双模态造影剂,探讨其体外寻靶能力及双模态显影效果。方法采用多步乳化法制备载有印度墨水和液态氟碳的高分子造影剂,用碳二亚胺法将造影剂与抗血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)单克隆抗体相偶联,制备出靶向VEGFR2高分子造影剂(Vi-PFH-PLGA)。检测该造影剂的一般特性、体外寻靶能力及双模态显影效果,并与非靶向高分子造影剂进行比较。结果所制备的靶向高分子造影剂的平均粒径为(565.5±15.6)nm,间接免疫荧光法观察到抗体成功的连接到造影剂表面,流式细胞仪测得抗体微球连接率为99.72%,体外寻靶能力实验显示较多的靶向造影剂呈花环状牢固的聚集在人脐静脉内皮细胞HUVEC表面,而非靶向组和抗体干预组未见造影剂与HUVEC的特异性结合。体外光声/超声显影实验显示,经脉冲激光辐照后,靶向造影剂组可检测到明显的光声信号和超声信号,与非靶向造影剂相比差异无统计学意义(P均0.05)。结论成功制备出靶向VEGFR2的光声/超声双模态造影剂,该造影剂在体外与HUVEC细胞具有较强的靶向结合能力且具备较好的光声/超声双模态显影效果。