外泌体介导miR-106 a靶向Smad7调控间皮细胞MMT对胃癌腹膜转移的影响

目的 探讨肿瘤源性外泌体(tumor-derived exosomes,TDEs)通过miR-106a-Smad7调控间皮细胞间质性转化(mesotheli-al-to-mesenchymal transition,MMT)影响胃癌腹膜转移的机制.方法 人胃癌细胞系AGS分离外泌体,转染miR-106a mimic,与...     

MDA-MB-231细胞在乏氧条件下通过外泌体传递miR-221、miR-222增强乳腺癌细胞侵袭和迁移能力

目的探讨乳腺癌细胞MDA-MB-231在乏氧条件下分泌的外泌体对肿瘤细胞侵袭和迁移的影响。方法利用差速离心法分离外泌体,并通过动态光散射和透射电镜对外泌体的粒径、形态进行表征。通过对外泌体进行PKH26染色,进而观察肿瘤细胞对外泌体的摄取情况。应用qRT-PCR法检测肿瘤细胞及外泌体中miR-221、miR-222的含量。Transwell侵袭实验和细胞划痕实验检测MDA-MB-231细胞的侵袭和迁移能力。Western blot法检测MDA-MB-231细胞中上皮细胞-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)相关蛋白(E-cadherin、N-cadherin和vimentin)的表达。结果MDA-MB-231细胞经乏氧处理后,其侵袭和迁移能力增强,并且N-cadherin和vimentin的表达上调;乏氧处理的肿瘤细胞分泌的外泌体通过传递miR-221、miR-222,促进MDA-MB-231细胞的EMT进展。结论MDA-MB-231细胞在乏氧条件下,可以通过外泌体传递miR-221、miR-222增加癌细胞侵袭和迁移能力。     

miR-200c对乳腺癌BT549细胞迁移及Slug表达的作用

目的:结合对乳腺癌细胞系BT549迁移能力的研究,探讨转染miR-200c对Slug表达的作用。方法:设计miR-200c模拟物,转染具有高转移性的乳腺癌细胞系BT549,通过Transwell迁移试验、划痕实验,观察转染miR-200c后对乳腺癌细胞系BT549迁移能力的影响;利用Real-time PCR检测Slug和E-钙黏连蛋白mRNA的表达水平;利用Western blot检测Slug蛋白的表达水平。结果:Real-time PCR和Western blot结果显示,miR-200c转染组Slug表达水平被有效抑制(P0.05)。与对照组相比,miR-200c转染组的BT549细胞迁移能力明显下降(P0.05)。结论:在乳腺癌细胞系BT549中,miR-200c可以通过抑制Slug的表达进而抑制上皮间质转化,最终导致细胞迁移能力下降。     

肿瘤微环境中Lewis肺腺癌细胞调控巨噬细胞表型转换

目的探究Lewis肺腺癌细胞(LLC)与巨噬细胞之间的细胞通讯及其对巨噬细胞表型转换的可能调控机制。方法正常肺泡上皮细胞(nAECs)与LLCs分别与巨噬细胞在Transwell共培养,脂多糖LPS刺激下室巨噬细胞。免疫荧光检测两组巨噬细胞表型转化情况;ELISA检测上清液中炎性因子IL-1β、TGF-α、IL-10和TGF-β表达;电镜与Western blot鉴定外泌体;PKH26染色检测巨噬细胞吞噬外泌体情况;RT-qPCR检测microRNA表达差异;siRNA-550a、siRNA-182转染LLCs,ELISA试剂盒检测巨噬细胞炎性因子表达情况。结果对照组巨噬细胞多为M1型,癌细胞刺激组巨噬细胞转化为M2型(P0.05);LLCs刺激组促炎因子与nAECs相比, IL-1β与TGF-α高表达, LI-10与TGF-β低表达(P0.05);电镜、PKH26染色等证明巨噬细胞可主动吞噬nAECs和LLCs外泌体; LLCs外泌体中的miR-550a和miR-182含量高于nAECs外泌体(P0.05)。LLCs转染siRNA-550a后,外泌体刺激巨噬细胞分泌的IL-1β与TGF-α明显高于siRNA-182转染,而IL-10与TGF-β则更低(P0.05)。结论 LLC可通过分泌外泌体将肿瘤微环境中巨噬细胞表型转化为癌支持性细胞,其机制可能是外泌体中miR-550a可调控巨噬细胞转型。     

miR-26a下调COX-2的表达抑制胃癌AGS细胞增殖和侵袭

目的探讨miR-26a在胃癌组织和胃癌AGS细胞中表达量的改变及其对胃癌AGS细胞增殖和侵袭的影响。方法采用Real-time PCR法检测18例患者胃癌组织及对应的癌旁组织中miR-26a的表达。胃癌AGS细胞分别转染miR-NC和miR-26a,采用Western blot法检测转染前后细胞中COX-2的表达水平,同时采用CCK-8和克隆形成实验检测转染后AGS细胞的增殖和侵袭情况。结果 miR-26a在胃癌组织中的表达明显低于癌旁组织(P0.01);COX-2在乳腺癌组织和细胞中的表达明显高于癌旁组织(P0.01)。转染miR-26a后,胃癌AGS细胞内COX-2的表达量显著下调。CCK-8和克隆形成实验结果显示,过表达miR-26a能明显抑制胃癌AGS细胞的增殖和侵袭(P0.01)。结论 miR-26a抑制胃癌AGS细胞的增殖和侵袭可能与下调COX-2的表达相关。     

胰腺癌细胞外泌体通过激活线粒体凋亡途径促进β细胞凋亡

目的:探讨胰腺癌细胞分泌的外泌体(exosome)对胰岛β细胞存活率和功能的影响及作用机制。方法:采用外泌体提取试剂盒提取小鼠胰腺癌细胞Pan02和MPC-83上清液外泌体,经磷钨酸染色后于透射电镜下鉴定形态;外泌体经荧光标记后与小鼠胰岛瘤MIN6细胞共孵育48 h,检测外泌体分泌水平和MIN6细胞的摄取水平;MTT和葡萄糖刺激的胰岛素分泌(GSIS)实验分别检测各组细胞的存活率和胰岛素分泌功能;q PCR检测微小RNA-204(miR-204)和Bcl-2 mRNA的表达;Western blot检测线粒体凋亡信号通路相关蛋白Bcl-2、Bax、caspase-3和细胞色素C(Cyt-C)的表达。结果:透射电镜结果显示2种胰腺癌细胞均能分泌外泌体,且Pan02细胞分泌更多。荧光标记的外泌体与胰岛β细胞共孵育结果显示,β细胞能够大量摄取胰腺癌细胞分泌的外泌体。MTT和GSIS实验结果显示,外泌体处理组的MIN6细胞存活率和高糖刺激的胰岛素分泌量显著低于未处理组(P0.01)。q PCR结果显示胰腺癌细胞分泌的外泌体富含miR-204,且外泌体处理后的MIN6细胞内Bcl-2的mRNA表达显著下调(P0.01)。Western blot结果显示,外泌体处理的MIN6细胞内Bcl-2蛋白表达显著下调(P0.05),Bax、cleaved caspase-3和Cyt-C蛋白表达显著上调(P0.01)。结论:胰腺癌细胞能够分泌外泌体,且该外泌体能够被胰岛β细胞摄取。胰腺癌细胞分泌的外泌体可以降低β细胞存活率和β细胞胰岛素的分泌功能,其机制可能通过外源性上调β细胞内miR-204的表达,进而抑制Bcl-2的mRNA和蛋白表达,最终激活β细胞内线粒体凋亡信号通路。     

慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠肺泡巨噬细胞促进气道上皮细胞增殖及黏蛋白和炎症因子分泌的机制

目的 通过慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠模型探讨肺泡巨噬细胞对气道上皮细胞增殖和分泌的影响及其相关机制。方法 支气管肺泡灌洗术收集烟熏和脂多糖诱导造模的COPD大鼠肺泡巨噬细胞与16HBE气道上皮细胞共培养。使用外泌体分离试剂盒提取大鼠肺泡巨噬细胞外泌体，PCR检测外泌体差异表达的微小RNA(miRNA)。采用miR-380模拟物(miR-380 mimic)过表达miR-380,小干扰RNA(siRNA)敲低16HBE细胞囊性纤维化跨膜转导调节因子(CFTR)。CCK-8法检测细胞增殖，Transwell^TM迁移实验检测16HBE细胞迁移；Western blot法检测黏蛋白5AC(MUC5AC)、 MUC5B、 MUC2、 CFTR的表达，ELISA检测16HBE细胞上清液肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)含量。结果 COPD大鼠肺泡巨噬细胞促进16HBE细胞的增殖和迁移，上调16HBE细胞黏蛋白和TNF-α、 IL-6的表达。COPD组大鼠肺泡巨噬细胞外泌体中miR-380明显上调。过表达miR-380及敲低CFTR均可下调16HBE细...     

肝癌细胞自分泌外泌体通过TGF-β1调控自身细胞学行为北大核心CSCD

目的:研究肝癌Huh7细胞外泌体促进自身转移的机制。方法:培养肝癌Huh7细胞,分离提取外泌体并进行鉴定。将分离的外泌体与Huh7细胞共培养,Transwell比较细胞迁移和侵袭能力;检测外泌体中TGF-β1水平;实时荧光定量PCR和Western blot分别检测TGF-β1、SMAD2/3、EMT相关分子表达。结果:提取的外泌体经Western blot检出CD63、TSG101条带;透射电镜检测出双侧膜结构小体;纳米粒径分析显示颗粒大小集中在100 nm左右。外泌体中检出TGF-β1。外泌体与Huh7细胞共培养,免疫荧光显示外泌体成功进入Huh7细胞。与对照组相比,共培养组细胞迁移和侵袭大幅增加,TGF-β/Smad通路相关分子活化,上皮标志物E-钙黏蛋白、p-Smad7表达下降,间充质标志物-波形蛋白表达升高。结论:肝癌Huh7细胞自分泌的外泌体通过运输TGF-β1上调TGF/Smad通路进而影响肝癌转移,探明了肝癌发展机制,为肝细胞癌治疗提供了新思路。     

M1型巨噬细胞源外泌体增强卵泡膜细胞的活力

目的:探讨M1型巨噬细胞源外泌体对卵泡膜细胞活力的影响及其作用机制。方法:采用脂多糖(LPS)处理Raw264.7小鼠巨噬细胞,构建M1型巨噬细胞模型及巨噬细胞-卵泡膜细胞共培养体系。超速离心法分离巨噬细胞分泌的外泌体;通过电镜、Western blot和纳米流式检测仪鉴定外泌体。体外分离培养小鼠卵泡膜细胞,与PKH67荧光标记的外泌体共孵育,观察卵泡膜细胞摄取外泌体的情况。CCK-8法检测细胞活力,流式细胞术分析细胞周期分布,q PCR及Western blot检测细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子1B(CDKN1B)的表达。结果:在巨噬细胞-卵泡膜细胞共培养体系中,LPS诱导的M1型巨噬细胞通过外泌体增强卵泡膜细胞活力。电镜、Western blot及纳米流式检测结果显示,巨噬细胞源外泌体被成功分离。PKH67标记的外泌体与卵泡膜细胞共孵育实验证实卵泡膜细胞能摄取大量巨噬细胞源外泌体。这些外泌体可增强卵泡膜细胞的活力,使卵泡膜细胞G0/G1期比例下降,S期比例升高,且卵泡膜细胞CDKN1B的m RNA及蛋白相对表达量均明显低于对照组。结论:卵泡膜细胞能摄取巨噬细胞分泌的外泌体。M1型巨噬细胞源外泌体通过抑制CDKN1B的表达而增强卵泡膜细胞的活力。     

循环外泌体抑制弥漫大B细胞淋巴瘤细胞增殖及其可能机制研究

目的探讨循环外泌体对弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)细胞增殖的影响及其可能机制。方法选择2016年6月至2017年6月遂宁市中心医院血液科13例经病理诊断明确的DLBCL患者,其中男性8例,女性5例;年龄37~68岁,平均年龄55.6岁。同期14例体检中心的健康体检者,其中男性7例,女性7例;年龄44~69岁,平均年龄58.9岁。获得血浆外泌体。通过电子显微镜和qNano分析仪对体检者、DLBCL患者外泌体进行鉴定。设空白对照组(U2932细胞)、对照组(健康体检者外泌体+U2932细胞)、研究组(DLBCL患者外泌体+U2932细胞),用四甲基偶氮唑盐(MTT)法、流式细胞法和Western blot检测增殖相关蛋白增殖细胞核抗原(PCNA)、Ki-67,综合评估各组细胞的增殖情况;采用高通量技术检测4例DLBCL患者血浆和4例健康体检者血浆外泌体中miRNA表达谱;用实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)检测DLBCL患者和健康体检者血浆外泌体中miR-92b表达水平。结果电子显微镜观察到,健康体检者、DLBCL患者外泌体呈现典型的茶托样结构,qNano分析结果显示所提取的外泌体主要集中在20~100 nm;Western blot结果显示,相比于血浆,外泌体中CD63、CD9这两个外泌体标志蛋白均有明显的表达。流式细胞结果显示,相比于空白对照组,对照组细胞G0/G1期受到抑制(P 0.05);MTT结果显示,相比于空白对照组,对照组细胞增殖能力降低(t=17.3,P 0.05);Western blot结果显示,相比于空白对照组,对照组细胞中PCNA和Ki-67表达减少(t=33.5,P 0.05)。相比于对照组,miRNA芯片分析结果显示,研究组血浆外泌体中miR-92b表达减少,RT-PCR结果显示miR-92b表达减少(t=12.9,P 0.05)。结论循环外泌体通过介导miR-92b抑制DLBCL细胞增殖。     

黑色素瘤细胞来源的外泌体通过上调Treg的CXCR3促进其趋化

目的检测黑色素瘤细胞通过外泌体途径上调CD4+CD25+调节性T细胞(regulatory T cell,Treg)CXCR3(chemokine receptor 3)受体表达,提高Treg向肿瘤免疫抑制微环境趋化的能力。方法以超速离心法纯化小鼠黑色素瘤细胞B16上清中的外泌体,透射电镜检测外泌体形态,Western blot检测外泌体标记性蛋白的表达。B16细胞荷瘤小鼠。流式细胞术检测荷瘤小鼠(1、2、3周)和尾静脉注射外泌体后脾脏、肿瘤内Treg的频率。磁珠法分离纯化小鼠的Treg;Transwell实验检测Treg的趋化能力。Western blot检测Treg的CXCR3、p-Smad2的表达水平。结果电镜结果显示,B16细胞释放的外泌体为直径30～100 nm的圆形或类圆形结构;高表达标志性蛋白CD63和Alix,不表达Calnexin。在外泌体刺激下Treg的趋化能力显著增强,但可被抗CXCR3的单克隆抗体阻断。Western blot结果显示外泌体可提高Treg细胞内Smad2的磷酸化,并上调CXCR3的表达水平,Treg的趋化能力随之增强。结论 B16细胞来源的外泌体通过Smad2磷酸化途径提高了Treg细胞内CXCR3的表达,进而增强其趋化能力。     

miR-34a 调控PAX6 的表达增强视网膜母细胞瘤的侵袭和迁移

目的:miR-34a 靶向PAX6 调控JAK1/ STAT3 信号通路影响视网膜母细胞瘤的侵袭和迁移。方法:免疫组化检测PAX6 在视网膜母细胞瘤组织中的表达;PCR 检测miR-34a 在不同视网膜母细胞瘤细胞株和视网膜母细胞瘤组织中的表达;双荧光素酶报告基因系统检测miR-34a 对PAX6 转录活性的影响;Transwell 侵袭实验检测miR-34a 的表达对视网膜母细胞瘤细胞Rb44 的侵袭能力的影响;划痕实验检测miR-34a 的表达对视网膜母细胞瘤细胞Rb44 的迁移能力的影响;Western blot检测过表达miR-34a 后JAK1/ STAT3 信号通路的蛋白表达水平。结果:与正常组织比较,miR-34a 在视网膜母细胞瘤组织中表达明显降低,PAX6 在非视网膜母细胞瘤中表达较高;Western blot 检测在Rb44 视网膜母细胞瘤中表达水平最低;双荧光素酶报告基因系统检测结果显示,miR-34a 可以直接调控PAX6 的转录活性;过表达miR-34a 后,视网膜母细胞瘤细胞株Rb44 的侵袭和转移能力明显降低;过表达miR-34a 后,PAX6 的表达水平下调,p-JAK1 和p-STAT3 蛋白表达下调。结论:miR-34a 靶向PAX6 的表达,通过JAK1/ STAT3 通路调控视网膜母细胞瘤的侵袭和迁移能力。     

miR-34a 调控MSR1 蛋白对前列腺癌细胞迁移和侵袭的影响

目的:探讨miR-34a 通过MSR1 对前列腺细胞迁移和侵袭的影响。方法:Western blot 检测前列腺癌PC3 细胞中MSR1 表达情况;qPCR 检测前列腺癌PC3 细胞中miR-34a 的表达情况,使用双荧光素酶实验检测miR-34a 和MSR1 之间的相关性;Transwell 侵袭实验检测miR-34a 和MSR1 对前列腺癌细胞侵袭能力的影响;划痕愈合实验检测miR-34a 和MSR1 对前列腺癌细胞迁移能力的影响。结果:Western blot 检测前列腺癌PC3 细胞中MSR1 的表达水平相对较高;qPCR 检测前列腺癌PC3 细胞中miR-34a 的表达水平相对较低;双荧光素酶检测miR-34a 和MSR1 之间有直接的结合位点,miR-34a 可以调控MSR1 的表达水平,划痕愈合试验和Transwell 侵袭试验检测过表达miR-34a 后前列腺癌PC3 细胞的迁移和侵袭能力受到相应的抑制,过表达MSR1 后可以逆转miR-34a 对前列腺癌PC3 细胞的迁移和侵袭能力的抑制作用。结论:miR-34a 可以通过MSR1 蛋白来调控前列腺癌细胞的迁移和侵袭行为。     

肝癌细胞外泌体诱导巨噬细胞M2极化后促进肝癌细胞迁移及侵袭

目的：探讨外泌体在肝细胞癌（HCC）细胞与巨噬细胞间是否存在活性物质交通作用，分析肿瘤微环境中肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）与HCC细胞转移的关系及机制。方法：采用超速离心法从Huh-7和RAW264.7细胞的培养基中提取外泌体，Western blot和透射电镜进行外泌体鉴定；激光共聚焦显微镜对外泌体与受体细胞结合内化进行追踪；qRT-PCR及ELISA检测巨噬细胞表型变化；miRNA模拟物进行功能性实验验证其作用；细胞划痕及Transwell试验检测TAMs对HCC细胞迁移及侵袭能力的影响。结果：HCC细胞外泌体可被巨噬细胞内吞；肝癌细胞外泌体及miR-151模拟物处理的巨噬细胞M2型标志物CD206、Arg-1 mRNA表达及IL-10、TGF-β蛋白表达显著高于对照组（P<0.05）;TAMs外泌体处理组HCC细胞迁移及侵袭能力高于其他组（P<0.05）。结论：HCC细胞来源外泌体miR-151可诱导巨噬细胞极化为TAMs,TAMs对肝癌细胞迁移及侵袭有促进作用。     

miR-101通过抑制DNA甲基转移酶3a抑制乳腺癌细胞的增殖和迁移

目的研究miR-101对乳腺癌细胞增殖和迁移能力的影响,并分析miR-101影响乳腺癌细胞生物学行为的可能机制。方法采用实时荧光定量PCR检测miR-101和DNA甲基转移酶3a(DNMT3a)在乳腺癌组织和相对应的正常乳腺组织,正常乳腺细胞以及多种乳腺癌细胞系中的表达水平,应用慢病毒介导感染的方法分别将miR-101序列及shRNA-DNMT3a转至MDAMB-231人乳腺癌细胞,通过Western blot法检测DNMT3a以及上皮钙黏素(E-cadherin)的表达,分析miR-101影响乳腺癌细胞生物学行为的可能机制。通过MTT法检测乳腺癌细胞的增殖能力,划痕实验检测乳腺癌细胞的迁移能力。结果miR-101在MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-361、HCC70乳腺癌细胞系及乳腺癌组织中表达低于正常乳腺组织及MCF-10A乳腺细胞系,而DNMT3a表达则升高。Western blot实验结果显示过表达miR-101的MDA-MB-231细胞中,DNMT3a的表达明显下降,而E-cadherin的表达升高;应用shRNA-DNMT3a抑制DNMT3a表达后,E-cadherin的表达也明显升高,证实miR-101可能通过抑制DNMT3a而发挥作用。体外实验显示过表达miR-101可明显抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231的增殖和迁移能力。结论miR-101抑制乳腺癌细胞增殖和迁移能力可能是通过抑制DNMT3a进而恢复E-cadherin表达来实现。     

miR-34a通过Snail诱导肺癌EMT及促进其转移的分子机制北大核心CSCD

目的:探讨miR-34a在肺癌组织中的表达情况以及miR-34a在肺癌细胞侵袭和迁移过程中的作用及其机制。方法:q PCR检测肺癌和正常肺组织中miR-34a的表达情况;使用miR-34a-mimic和miR-34a-inhibitor过表达和沉默miR-34a,q PCR检测沉默和过表达效果;Western blot检测沉默和过表达miR-34a后Snail蛋白的表达情况;荧光素酶报告基因检测miR-34a与Snail的相互作用;Transwell侵袭实验检测miR-34a的表达对肺癌细胞侵袭能力的影响;划痕实验检测miR-34a的表达对肺癌细胞迁移能力的影响;Western blot检测E-Cadherin、Vimentin和Twist蛋白的表达情况。结果:与正常肺组织相比,肺癌组织中miR-34a表达明显降低;且晚期、低分化和有淋巴结转移的肺癌组织miR-34a表达明显较早期、高分化和无淋巴结转移的肺癌组织低;miR-34a-mimic和miR-34a-inhibitor可以有效抑制和过表达miR-34a的表达;miR-34a能与Snail的3'UTR特异性结合;miR-34a可以调控肺癌H1650细胞的侵袭迁移能力;过表达miR-34a上调E-Cadherin,同时下调Vimentin和Twist蛋白的表达,沉默miR-34a则相反。结论:miR-34a在肺癌中表达明显降低,且跟肺癌分期分级以及淋巴结转移与否密切相关,同时miR-34a可以通过上皮间质转化调节肺癌细胞侵袭和迁移能力。     

外泌体介导miR-335-5p通过靶向LKB1对胶质瘤细胞上皮-间质转化的影响

目的 探讨外泌体中microRNA-335-5p(miR-335-5p)被胶质瘤细胞摄取并作用于肝激酶B1(liver kinase B1, LKB1)影响胶质瘤细胞侵袭的分子机制。方法 通过外泌体提取试剂盒提取外泌体;运用透射电镜、粒度仪、Western blot法鉴定分离获取的外泌体;RT-PCR检测不同肿瘤细胞来源外泌体中miR-335-5p的表达量;外泌体摄取实验检测胶质瘤细胞对外泌体的摄取情况;Transwell实验检测加入外泌体后胶质瘤细胞的侵袭能力;双荧光素酶报告实验验证miR-335-5p是否靶向结合LKB1;Transwell实验检测转染miR-335-5p mimic后胶质瘤细胞的侵袭能力;Western blot法检测转染miR-335-5p mimic后胶质瘤细胞中LKB1和上皮-间质转化相关蛋白(E-cadherin、N-cadherin和vimentin)的表达水平。结果 LN229细胞来源的外泌体中miR-335-5p表达水平明显高于H4细胞来源的外泌体;过表达miR-335-5p后LN229细胞侵袭能力增强;miR-335-5p靶向结合LKB1 mRNA...     

上调miR-181a抑制香烟提取物诱导的支气管上皮细胞致炎因子生成与collagen IV、fibronectin和α-SMA表达

目的:探讨微小RNA-181a(miR-181a)对香烟提取物(cigarette smoke extract,CSE)诱导的人支气管上皮细胞(human bronchial epithelial cells, HBECs)致炎因子生成与IV型胶原蛋白(collagen IV)、纤连蛋白(fibronectin)和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达的影响,并分析其可能的机制。方法:RT-qPCR检测CSE诱导下HBECs中miR-181a的表达情况。转染miR-181a mimic后经ELISA检测肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)、IL-6和转化生长因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)的水平;Western blot检测collagen IV、fibronectin和α-SMA的表达;并进一步评估NF-κB/TGF-β1/Smad3信号通路的活性。结果:CSE可显著增加HBECs中致炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α和TGF-β1的生成,显著上调collagen IV、fibronectin和α-SMA的表达,同时细胞内miR-181a的表达明显降低(P0.05);转染miR-181a mimic可显著抑制CSE诱导的HBECs致炎因子生成及collagen IV、fibronectin和α-SMA表达(P0.05)。此外,Western blot的结果显示转染miR-181a mimic可抑制CSE诱导的NF-κB/TGF-β1/Smad3信号活性(P0.05)。结论:上调miR-181a表达可部分逆转CSE诱导的HBECs致炎因子的释放及collagen IV、fibronectin和α-SMA表达,其作用机制可能与抑制NF-κB/TGF-β1/Smad3信号通路的活化有关。     

小鼠骨髓间充质干细胞外泌体的分离与鉴定

目的探讨骨髓间充质干细胞的外泌体的分离与鉴定方法。方法通过全骨髓贴壁法培养间充质干细胞;用新兴试剂法收集外泌体,采用电镜、粒径检测、流式细胞仪和Western blot鉴定外泌体。结果第三代骨髓间充质干细胞表面CD45呈阴性表达,CD73和CD105呈阳性表达;骨髓间充质干细胞外泌体呈圆形或椭圆形,大小不均匀,直径30~100 nm,有完整的膜结构;粒径检测显示颗粒直径主峰为61.25 nm,直径为20~200 nm的颗粒占72.4%;外泌体CD63和CD81呈阳性表达;细胞培养上清液中可检测到外泌体CD9和CD63的蛋白表达。结论在培养间充质干细胞的培养基中可以收集到外泌体,可以通过透射电镜、粒径检测、流式细胞仪和Western blot对骨髓间充质干细胞的外泌体进行鉴定。     

miR-18a通过靶向调节SEMA5A影响喉癌Hep-2细胞的增殖与迁移

目的探讨miR-18a对喉癌HEP-2细胞增殖及迁移能力的影响及可能机制。方法 Real-time PCR法检测喉癌组织与癌旁组织miR-124的表达,免疫组织化学方法检测SEMA5A蛋白的表达。Lipofectamine2000将miR-18a抑制剂与miR-18a模拟物分别转染喉癌HEP-2细胞,real-time PCR法验证转染效率,采用CCK8法检测miR-18a对喉癌HEP-2细胞增殖的影响,采用Transwell迁移实验检测转染后HEP-2细胞的迁移能力变化。Real-time PCR与Western blot实验分别检测转染后SEMA5A mRNA和蛋白表达的变化。结果 miR-18a在喉癌组织中的表达明显高于癌旁正常组织(P0.01),但SEMA5A蛋白在喉癌组织中的表达明显低于癌旁正常组织(P0.01)。miR-18a抑制剂或miR-18a模拟物转染后,喉癌HEP-2细胞miR-18a的表达显著降低或升高,转染成功。转染miR-18a抑制剂能够显著降低喉癌HEP-2细胞增殖及迁移能力,并上调喉癌HEP-2细胞SEMA5A蛋白的表达;转染miR-18a模拟物后,作用则相反。结论 miR-18a在喉癌组织中表达上调,靶向调节SEMA5A的表达可能是其促进喉癌HEP-2细胞增殖和迁移的机制之一。