SEMA3B基因真核表达载体的构建及对肺癌细胞恶性生物学行为的影响

目的构建抑癌基因SEMA3B真核表达载体pc DNA3.1-SEMA3B,并检测其对肺癌A549细胞恶性生物学行为的影响。方法应用PCR扩增SEMA3B全长c DNA片段,构建真核表达载体pc DNA3.1-SEMA3B。克隆PCR、双酶切法、基因测序验证过表达载体构建成功。将pc DNA3.1-SEMA3B真核表达载体和空载体pc DNA3.1分别转染入A549细胞中,应用qRT-PCR、Western blot检测SEMA3B mRNA、蛋白表达水平的变化;MTS法检测细胞增殖;流式细胞仪检测细胞凋亡、细胞周期;克隆形成实验检测细胞集落形成能力。结果 SEMA3B基因扩增片段与预测片段一致,克隆成功,且测序鉴定证实真核表达载体构建成功。转染pc DNA3.1-SEMA3B真核表达载体可上调SEMA3B mRNA、蛋白表达水平,且可抑制A549细胞的增殖,诱导凋细胞亡,细胞被阻滞在G1期,抑制细胞集落形成能力。结论成功构建了SEMA3B基因真核表达载体,抑癌基因SEMA3B在肺癌恶性生物学进程中可能发挥重要作用。     

脂氧素A4受体样蛋白基因的克隆与转染及其在Hela细胞的表达

目的：构建脂氧素A4受体样蛋白(LRLP)基因的真核表达载体，克隆后转染Hela细胞，观察LRLP基因在Hela细胞中的表达。方法：应用PCR方法．以小鼠睾丸cDNA为模板，扩增出LRLP基因片段，插入质粒pGEM—T中，转化人大肠杆菌JM109。扩增阳性重组质粒，经酶切后纯化并测序鉴定目的片段。构建含绿色荧光蛋白基因的真核表达载体pEGFP／LRLP，转化人大肠杆菌JM109扩增．酶切后再测序鉴定目的片段，抽提质粒后瞬时转染Hela细胞，置激光共聚焦显微镜下照像。结果：测序鉴定表明．克隆的LRLP序列与GenBank中LRLP原序列100％．符合，激光共聚焦显微镜下见Hela细胞中LRLP基因表达。结论：成功地构建了真核表达载体pEGFP／LRLP，并转染了Hela细胞。     

人可溶性肿瘤坏死因子受体1基因真核表达载体的构建

目的构建人可溶性肿瘤坏死因子受体1基因(sTNFR1)的真核表达载体,为进一步研究打下基础。方法以Hela细胞的总RNA为模板,用RT-PCR方法扩增人sTNFR1全编码区基因片段,构建含有目的片段的T载体克隆及真核表达载体pCDNA3.1(-)重组质粒亚克隆,并用酶切分析和序列测定进行鉴定。结果经酶切鉴定和测序证实,人sTNFR1基因被正确克隆入真核表达载体pCDNA3.1(-)。结论真核表达质粒pCDNA3.1(-)-sTNFR1的构建为今后的研究打下了基础。     

结核分支杆菌抗原85B真核表达质粒的构建

目的:构建结核分支杆菌分泌性抗原85B的真核重组表达质粒。方法:设计85B的特异引物,采用多聚酶链反应(PCR)技术从含85B基因质粒DNA中扩增85B基因片段,克隆至pMD18-T载体,经测序分析后,亚克隆至真核表达载体pVAX1,PCR和双酶切鉴定阳性菌株。结果:PCR扩增获得85B的基因片段,测序获得的正确片段被亚克隆至真核表达质粒pVAX1构建真核重组表达质粒pVAX1-85B。结论:成功构建了85B的真核重组表达质粒pVAX1-85B。     

梅毒螺旋体外膜蛋白Gpd在Hela细胞中的表达及鉴定

目的 构建梅毒螺旋体（Tp）外膜蛋白甘油磷酸二酯磷酸二酯酶基因（Gpd）的真核表达载体peDNA3．1（＋）-Gpd，鉴定其在Hela细胞的表达，为开展TpDNA疫苗动物实验打下基础。方法 用PCR从TpNichols株基因组中扩增Gpd基因，构建真核表达重组质粒pcDNA3．1（＋）-Gpd，脂质体介导转染入Hela细胞，以免疫组化及跳tern-blot检测在Hela细胞中的表达。结果 双酶切及DNA测序显示重组质粒含有1059bp的目的基因片段，读码框架正确，无突变。该重组质粒在Hela细胞能有效表达分子量为41kDa的目的蛋白，重组蛋白能-9梅毒螺旋体阳性血清反应。结论 构建的质粒peD-NA3．1（＋）-Gpd成功地在体外真核细胞中表达。     

VEGF111b的表达载体构建及抗体制备

目的克隆VEGF111b基因,构建真核表达载体pc DNA3.1-VEGF111b,并进行测序,制备VEGF111b多克隆抗体。方法丝裂霉素C诱导处理卵巢癌SKOV3细胞24 h,设计VEGF111b酶切引物,以SKOV3细胞的c DNA为模板,通过PCR得到VEGF111b特异性基因产物,克隆入真核表达载体pc DNA3.1中,获得重组真核表达载体pc DNA3.1-VEGF111b,测序验证。用KLH耦联VEGF111b特异性短肽,制备多克隆抗体,Western blot检测其特异性。结果成功扩增了VEGF111b基因,双酶切、测序鉴定证实目的基因成功克隆到真核表达载体pc DNA3.1中,测序结果与预测完全一致,成功制备了VEGF111b多克隆抗体,使用其多克隆抗体,Western blot能够检测到VEGF111b对应分子量的蛋白条带。结论本研究鉴定了pc DNA3.1-VEGF111b真核表达载体,并验证了VEGF111b多克隆抗体的特异性,为进一步研究VEGF111b蛋白的功能奠定了基础。     

弓形虫GRA7真核表达质粒的构建

目的:构建弓形虫致密颗粒抗原GRA7的真核重组表达质粒。方法:设计GRA7的特异引物,采用多聚酶链反应(PCR)技术从弓形虫RH株基因组DNA中扩增编码GRA7的基因片段,经克隆至pMD18-T载体后,亚克隆至真核表达载体pVAX1而构建真核重组表达质粒pVAX1-GRA7。结果:PCR扩增出GRA7基因的特异片段,所获克隆的序列正确,并被亚克隆到真核表达载体pVAX1,构建了真核重组表达质粒pVAX1-GRA8。结论:成功构建了GRA7的真核重组表达质粒pVAX1-GRA7。     

人乳腺癌细胞HYAL1基因真核表达载体的构建及其在MCF-7和ZR-75-30细胞中的表达

目的 构建人乳腺癌HYAL1基因的真核表达载体并稳定转染HYAL1基因低表达的乳腺癌MCF-7和ZR-75-30细胞株,为进一步探讨HYAL1基因在乳腺癌的侵袭和转移中的作用奠定基础.方法 采用RT-PCR技术从高表达HYAL1的人乳腺癌细胞株MDA-MB-435S中扩增透明质酸酶HYLAL1基因,并将其插入真核表达载体pcDNA3.1/V5-His-TOPO中,构建的重组表达质粒经脂质体介导转染HYAL1基因低表达的乳腺癌MCF-7和ZR-75-30细胞.结果 用RT-PCR成功地扩增出1条1 332 bp的DNA片段,经限制性内切酶酶切分析和DNA测序证明已经成功构建了人乳腺癌HY-AL1基因的真核表达载体.RT-PCR证明转染了重组质粒的乳腺癌MCF-7和ZR-75-30细胞可以高效稳定的表达HYAL1基因,且其穿透细胞外基质的能力增强.结论 成功构建了人乳腺癌HYAL1基因的真核表达载体,获得了稳定表达人HYAL1基因的MCF-7和ZR-75-30细胞克隆,且其侵袭能力增强.     

构建人血管内皮生长因子cDNA逆转录病毒表达质粒

目的 :构建人血管内皮生长因子 ( VEGF) c DNA逆转录病毒表达质粒。方法 :采用 PCR方法从 pc DNA- VEGF165质粒中扩增 VEGF165基因 ,在序列两端分别引入 Eco R 和 Bam H 限制性内切酶识别位点 ,并克隆到逆转录病毒表达载体 p LXSN质粒中。结果 :酶切鉴定、PCR扩增以及DNA序列分析表明已经将 VEGF165基因全长序列克隆到逆转录病毒表达载体 p LXSN质粒中 ,获得了 p LXSN- VEGF165重组质粒。结论 :成功地构建了人 VEGF c DNA逆转录病毒表达质粒 ,为进一步临床应用 VEGF c DNA转基因治疗奠定了基础     

Sjcb2 DNA疫苗的构建及其在真核细胞中的表达（英文）

目的 克隆日本血吸虫组织蛋白酶B基因，构建真核表达重组质粒，转染真核细胞，观察其表达情况。方法用PCR技术从已构建好的重组质粒pBCSK＋／Sjcb2中扩增出Sjcb2基因片段，重组入克隆载体pUCm-T。再将Sjcb2基因片段亚克隆入真核表达载体pcDNA3．1（＋）。进行PCR、双酶切和DNA序列鉴定后，运用电穿孔技术将重组体pcDNA3．1（＋）／Sjcb2转染HeLa细胞，间接免疫荧光技术观察目的基因的表达。结果成功扩增出Sjcb2基因片段并构建DNA疫苗；重组质粒在HeIJa细胞中获得表达。结论Sicb2基因能够在体外真核细胞中表达。     

弓形虫ROP2基因的体外扩增及真核表达重组质粒的构建

目的 构建弓形虫棒状体蛋白2（ROP2）基因真核表达重组质粒，方法 根据ROP2基因已知序列，设计合成一对引物，上，下游引物分别引入EcoRI,SalI酶切位点，用PCR方法从弓形虫RH株基因组DNA中扩增编码ROP2的基因片段，插入pGEX-4T-1质粒，构建原核表达重组质粒pGEX-4T-1-ROP2，而后经EcoRI,NotI双酶切除ROP2基因片段，再亚克隆到载体pcDNA3中构建真核表达重组质粒pcDNA3-ROP2。结果 ROP2基因体外扩增产物大小约1043bp，重组质粒经酶切及PCR鉴定表明获得正确重组子，克隆基因测序结果与已知序列基本吻合。结论 在国内首次克隆了弓形虫ROP2基因并构建了真核表达质粒pcDNA3-ROP2。为下一步弓形虫DNA疫苗研究打下了基础。     

重组Trx-ApoO融合蛋白的构建与表达

目的:构建人载脂蛋白O (apolipoprotein O, ApoO)表达质粒,用pET原核表达系统制备重组抗原Trx-ApoO融合蛋白.方法:以人类肝脏cDNA文库为模板,聚合酶链反应(PCR) 法扩增ApoO DNA,将测序正确的目的基因片段插入质粒pET-32a (+)相应位点构建重组质粒并转化E.coli B...     

人高迁移率族蛋白1基因的克隆和表达

目的：克隆人高迁移率族蛋白1(HMG—1)编码基因，构建重组表达载体并对其诱导表达．方法：通过RT—PCR方法扩增出人外周血单个核细胞中HMG—1的编码基因，克隆于载体pGEM—T easy，测序分析后亚克隆于表达载体pGEx—4T—2，测序证实序列正确后转化大肠杆菌DH5α，经IPTG诱导4h后可表达M，约56000的融合蛋白GST—HMGl．结果：克隆了人HMG—1的编码基因，构建了融合蛋白的重组表达质粒pGEx—HMGl，表达的融合蛋白产物经凝胶薄层扫描检测，占全菌总蛋白的0．23．结论：获得了人HMG—1编码基因及其原核表达产物，对研究人HMG—1的生物学功能及其mAb的制备具有重要意义．     

人FRNK重组腺病毒的构建

目的:应用AdEasy复制缺陷型腺病毒载体系统构建人FRNK基因重组腺病毒,并在HEK293细胞中扩增制备重组病毒。方法:把人FRNK基因克隆入腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV中,构建腺病毒质粒pAdTrack-CMV-hFRNK,经PmeⅠ内切酶酶切成线性化后,采用电穿孔转化将其转化到含有腺病毒骨架载体pAdEasy-1的感受态大肠杆菌BJ5183中,通过卡那霉素筛选获得阳性腺病毒重组质粒。再将获得的腺病毒重组质粒转染到HEK293细胞进行包装,获得人FRNK重组腺病毒pAdhFRNK。荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达。结果:经酶切和绿色荧光蛋白表达证明了hFRNK基因的重组腺病毒载体pAdhFRNK构建成功,并制备出高滴度的重组病毒。结论:成功构建携带人FRNK基因的重组腺病毒pAdhFRNK,为研究FRNK的基因治疗奠定了基础。     

重组sCR1在毕赤酵母细胞中的表达、纯化及鉴定

目的:酵母细胞SMD 1168表达人sCR1,并对重组蛋白进行纯化。方法:从人外周血中提取总RNA,应用RT-PCR获得人sCR1全长cDNA,将其克隆入真核表达载体pPIC9K,构建含人sCR1的重组质粒(pPIC9K-sCR1);经测序鉴定正确后,将重组质粒转化入毕赤酵母菌细胞SMD 1168中,经甲醇诱导,表达产物经SDS-PAGE分析及W estern b lot鉴定,并通过N i2+-NTA agarose亲和层析纯化。结果:经甲醇诱导的含pPIC9K-sCR1的酵母细胞表达出重组人sCR1的融合蛋白,48~72 h sCR1融合蛋白表达量最高。此蛋白在凝胶上表现为M r大于31 KDa的蛋白区带,在W estern b lot分析中可被sCR1的CD35单克隆抗体(mAb)识别。经N i2+-NTA agarose亲和层析纯化后得到较纯的sCR1融合蛋白。结论:人sCR1融合蛋白在酵母细胞表达系统中的高水平表达,并且有与人体天然蛋白相同的抗原活性。     

人重组pcDNA3人钠/碘同向转运体核表达质粒的构建

目的:获取、构建并鉴定携带人钠/碘同向转运体(hNIS)基因的pcDNA3.0质粒载体。方法:利用逆转录和聚合酶链反应获取Graves甲亢患者甲状腺NIS基因可编码区片段。与pUCm-T质粒载体连接、经转化、蓝白斑筛选、酶切鉴定,序列测定鉴定,获得pUCm-T-重组质粒。pUCm-T-重组质粒亚克隆得到pcDNA3-hNIS重组质粒。结果:所构建的pcDNA3-hNIS重组质粒中的hNIS基因序列与文献报道序列一致。结论:成功构建pcDNA3-hNIS重组质粒。     

携带人脂联素基因重组腺病毒的构建及表达

目的构建携带人脂联素基因的重组腺病毒载体,为进一步研究脂联素的功能提供实验基础。方法以带有人脂联素基因的质粒pINCY—APM1为模板,聚合酶链反应扩增人脂联素基因APM1,并将其定向克隆于真核表达载体pDC315-EGFP,与辅助质粒pBHGlox△E1,3Cre共转染HEK293细胞,经位点特异重组包装得到重组腺病毒Ad—APM1。通过Real—timePCR和Westernblot分别检测重组腺病毒Ad—APM1感染HEK293细胞后的表达。结果重组腺病毒Ad-APM1包装成功,病毒滴度〉6．3×10^12pfu／mL。Real—timePCR和Westernblot检测证实APM1在HEK293中表达。结论应用细胞内同源重组方法成功构建了携带人脂联素基因的重组腺病毒。     

人细小病毒B19 NS1片段全长的克隆及表达

目的 :克隆人细小病毒B1 9非结构蛋白 1 (NS1 )全长基因 ,构建重组表达载体并诱导表达。　方法 :利用聚合酶链反应 (PCR)和分子克隆技术 ,从我科保存的B1 9阳性标本XA2 0中扩增NS1片段全长 ,构建NS1 pGEM T easy克隆载体并测序分析 ,测序证实序列正确后亚克隆于pQE30表达载体中 ,并转化至M1 5感受态菌中 ,经IPTG诱导可表达 770 0 0的融合蛋白。　结果 :成功克隆了人细小病毒B1 9NS1全长基因 ,构建了融合蛋白NS1 pQE30的重组表达质粒 ,表达的融合蛋白经 1 2 %SDS PAGE电泳证实为 770 0 0。　结论 :获得人细小病毒B1 9NS1全长基因及原核表达产物 ,对进一步研究NS1的生物学活性及其单克隆抗体的制备有重要意义。     

PCR克隆EB病毒潜伏膜蛋白-1基因

目的：构建ＥＢ病毒潜伏膜蛋白－１重组表达质粒。方法：ＰＣＲ克隆技术,即用ＰＣＲ方法从Ｂ９５－８细胞中钓出ＥＢ病毒ＬＭＰ１基因ＤＮＡ序列,然后定向克隆到真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３．１中,以此构建成ｐｃＤＮＡ３．１－ＬＭＰ重组质粒。结果：经酶切鉴定,确定已获得重组质粒ｐｃＤＮＡ３．１ＬＭＰ１。结论：在真核表达质粒中已成功地克隆了ＥＢ病毒ＬＭＰ１基因。     

FUS1基因原核表达质粒构建与诱导表达

目的 构建FUS1基因原核表达质粒,在大肠杆菌[Rosetta(DE3)2 plys]中高效表达重组蛋白.方法 采用PCR技术从人脐带来源的间充质干细胞中扩增出FUS1基因,并将其接入pET-32a( ),经PCR、测序鉴定后,转化Rosetta(DE3)2 plys细菌,并用IPTG诱导表达.结果 经过PCR、测序鉴定,克隆了pET32a( )-FUS1重组子;在低浓度IPTG(25μmol/L)诱导3 h,Rosetta DE3可以高效地表达重组蛋白,约占细菌总蛋白的40%.结论 成功地克隆到FUS1基因,并使其在原核系统中高效表达.