PCR-RFLP和PCR-SSCP技术在肠杆菌科食源性感染致病菌鉴定中的应用

目的 探讨运用PCR-RFLP和PCR-SSCP技术建立肠杆菌科食源性感染常见致病菌快速鉴定方法的可行性。方法 选取肠杆菌科食源性感染14种常见致病菌的23SrRNA基因作为鉴别靶基因，采用通用引物PCR（UP-PCR）进行扩增，并对PCR产物的酶切片段进行限制性酶切片段长度多态性分析（RFLP）和单链构象多态性分析（SSCP）。结果 针对23SrRNA基因片段的Hpa Ⅱ酶切产物的RFLP分析表明，不同种属的致病菌表现出相似的RFLP图谱。SSCP分析显示，14种肠杆菌科常见致病菌SSCP图谱变异性很大，有利于进行细菌鉴定。结论 运用PCR-SSCP技术可进行肠杆菌科食源性感染致病菌的快速鉴定。     

运用23S rDNA芯片技术进行食源性感染常见致病菌的快速鉴定

[目的]应用23S rDNA芯片技术，建立食源性感染常见致病菌的快速鉴定方法。[方法]利用带正电荷尼龙膜为芯片载体，合成寡核苷酸探针，点样于载体制成寡核苷酸芯片，对食源性感染常见致病菌23S rDNA基因片段扩增产物进行杂交检测。[结果]获得扩增食源性感染常见致病菌23S rDNA基因片段的特异性引物，并在同一条件下扩增出14种细菌目标片段。在均一的杂交条件下与寡核苷酸芯片杂交，用地高辛酶联免疫法进行显色。结果表明，10种细菌杂交结果显示很好的灵敏度和特异性，4种细菌由于探针因素或杂交条件不合适未能显示预期的种(属)杂交结果。对于食源性感染模拟标本，本方法也可以获得预期的结果。[结论]建立的23S rDNA芯片技术在食源性感染常见致病菌鉴定上快速准确的优点，为食源性感染的诊治与预防提供了有效的技术手段和方法依据。     

5种食源致病菌16SrRNA基因单链构象多态性分析

目的：对5种常见食物中毒致病菌16SrRNA基因单链构象多态性（Single-strand-conformation polymorphism,SSCP）进行分析，探讨该技术在食物中毒致病菌快速鉴别诊断中的可能作用。方法：5种常见食源性致病菌标准株增菌后，提取DNA，通过特异引物对菌株的16SrRNA 序列的可变区进行扩增，扩增产物进行SSCP分析。结果：各菌株均分离出两条或以上特异性条带，条带间距离及相对位置差异明显，并有良好的重复性。该方法的灵敏度可达10－15个鼠伤寒沙门菌细胞。结论：5种常见食物中毒致病菌16SrRNA基因单链构象多态性具有种属特异性，PCR－SSCP分析法有助于快速、准确的从基因水平上对食物中毒致病菌进行分析检测。     

新型液相芯片系统在食源性致病菌快速检测中的应用研究

目的:评估一种新型液相芯片系统应用于食源性致病菌进行快速检测的可行性。方法:使用荧光多重PCR技术以及液相芯片检测系统对食源性致病菌进行快速检测。结果:荧光多重PCR技术结合液相芯片检测系统能够对多种食源性致病菌在8 h内实现定性和半定量检测,其灵敏度、特异性、抗干扰能力明显优于传统方法。结论:基于荧光多重PCR技术的液相芯片系统操作简便、干扰少、检测结果准确可靠,能够应用于食源性致病菌快速检测。     

食源性致病菌96微孔板DNA诊断芯片的研制

目的:建立一种能同时检测12种常见食源性致病菌的基于微孔板阵列技术的检测平台,以满足食物中毒处置中能快速、准确提供实验室结果的要求。方法:针对12种最常见的食源性致病菌,设计种特异性的PCR引物和寡核苷酸探针,按照5×5的阵列格式将探针点制到96微孔板的微孔内,建立稳定的微孔杂交体系,采用链霉亲和素碱性磷酸酶和化学显色底物NBT/BCIP来检测特异性的PCR杂交产物。结果:经标准菌株验证已建立的食源性致病菌微孔板DNA诊断芯片,获得比较敏感、特异和稳定的实验结果;同时经食物中毒样品检测应用,与传统的细菌分离培养和生化鉴定的结果相符。结论:本研究建立的能同时检测12种常见食源性致病菌的基于微孔板阵列技术的检测平台具有快速、准确、自动化和高通量等特点,作为应对食物中毒等突发公共卫生事件的实用检测技术具有重要意义。     

寡核苷酸微阵列快速检测常见食源性致病菌初步研究

目的:探索运用寡核苷酸微阵列技术建立一种快速、简便的检测食源性致病菌方法。方法:基于细菌16s rDNA序列设计并合成寡核苷酸探针,制备寡核苷酸微阵列,对7种常见细菌进行检测。同时,采用培养和微阵列对40份腹泻患者粪便进行了检测。结果:7种食源性致病菌用细菌16s rDNA序列通用引物扩增后,均得到900 bp左右的PCR产物,产物分别在寡核苷酸微阵列上进行杂交时,均只和相对应的检测探针产生明显的杂交信号。在模板为1.0 pg/ml时,PCR未能扩增出明显的条带,然而该产物经微阵列杂交后可见较明显的检测信号。40份腹泻患者粪便采用培养法结合血清凝集试验和寡核苷酸微阵列进行检测比较,发现大肠埃希菌与志贺菌属检测探针也能杂交,霍乱弧菌与副溶血性弧菌检测探针也能杂交,其余5种细菌检测符合率为为100%。结论:基于细菌16s rDNA序列的寡核苷酸微阵列技术检测食源性致病菌,方法简单、实用、快速、高通量,并可以直接检测标本而不需培养,但是采用该技术部分细菌只能实现初步快速鉴定,仍需要结合培养等才能最后鉴定。     

应用液相芯片技术快速检测常见食源性致病菌的研究

目的建立一种基于多重PCR技术联合液相芯片技术快速、准确同时检测沙门菌、副溶血性弧菌、霍乱弧菌、单核细胞增生李斯特菌、金黄色葡萄球菌的方法。方法针对5种食源性致病菌的目标基因设计特异性的引物探针,建立5种食源性致病菌的多重PCR检测方法,将PCR产品与偶联核酸探针的微球混合物进行杂交,利用液相芯片检测仪来检测杂交结果,并对检测方法的重复性、灵敏度、特异性进行评价,以及使用实际样本对该方法进行初步验证。结果该方法检测5种食源性致病菌,重复性良好,变异系数均2%;沙门菌inv A与霍乱弧菌hly A的检测灵敏度为50 cfu/ml,单核细胞增生李斯特菌Hly、金黄色葡萄球菌Sa442、副溶血性弧菌toxR的检测灵敏度为100 cfu/ml;检测的特异度为100%。结论本研究建立的液相芯片检测方法能快速、准确、特异地同时检测沙门菌、副溶血性弧菌、霍乱弧菌、单核细胞增生李斯特菌、金黄色葡萄球菌5种常见的食源性致病菌。     

常见食源性致病菌基质辅助电离解析飞行时间质谱技术方法的建立

目的建立食源性致病菌基质辅助电离解析飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)快速检测方法。方法建立副溶血性弧菌、创伤弧菌、霍乱弧菌、沙门菌、单核细胞增生李斯特菌、金黄色葡萄球菌、变形杆菌、蜡样芽胞杆菌、阪崎肠杆菌、大肠杆菌、志贺菌等常见食源性致病菌的本地质谱库,探索不同的检测条件对鉴定结果的影响,并与传统的生化方法和PCR方法进行比较,探讨最佳的实验室检测方法。结果应用MALDI-TOF-MS鉴定常见的食源性致病菌,鉴定结果不随培养条件和时间的改变而变化;用甲酸提取法提取核糖体蛋白进行鉴定的效果最佳,自建的谱库特异性好,除了沙门菌鉴定外,其余致病菌的匹配度均较仪器自带的谱库高;MALDI-TOF-MS鉴定结果较传统生化方法的准确性高。结论 MALDI-TOF-MS可作为一种快速、廉价、准确性高的检测方法应用于食源性致病菌的快速检测。     

食源性致病菌96微孔板芯片在一起食物中毒检测中的应用

目的利用微孔板芯片技术对一起食物中毒进行检测,评价其在食物中毒事件中的应用效果。方法用食源性致病菌96微孔板芯片对一起食物中毒样品进行检测,同时采用传统的病原分离方法和细菌生化鉴定仪对分离菌株进行鉴定。结果食源性致病菌96微孔板芯片对食物中毒样品的检测结果与病原分离培养结果完全一致。结论食源性致病菌96微孔板芯片具有快速、准确、自动化和高通量等特点,作为应对食物中毒等突发公共卫生事件的快速检测具有重要意义。     

多重寡核苷酸连接-聚合酶链式反应-通用基因芯片检测食源性致病菌方法的建立

目的建立一种基于多重寡核苷酸连接-聚合酶链式反应(MOL-PCR)的食源性致病菌通用基因芯片检测方法。方法针对细菌性食物中毒8种常见致病菌,在各自特异性引物之间设计一对首尾相接的上、下游检测探针。采用多重PCR富集靶序列并作为模板,通过多重连接酶检测反应及通用不对称PCR标记,获得大量含标签互补序列(Anti-tag)的荧光标记单链产物,可与芯片上固定的标签序列(Tag)进行杂交检测。结果该方法能特异性地鉴别单一和多重目标菌感染。纯培养物的检测灵敏度为(1.1~8.5)×10~2CFU/mL。对96份食物中毒和临床腹泻样本检测,芯片结果与常规分离与生化鉴定及荧光定量PCR结果一致。结论该方法为快速、准确、灵敏、高通量地鉴定食源性疾病的病原菌提供了一种新型检测平台。     

基于16S和23S rDNA基因芯片检测和鉴定七种临床常见病原菌

目的 以细菌16S rDNA和23S rDNA基因为靶序列建立可检测临床七种常见病原菌寡核苷酸芯片系统.方法 采用双重PCR扩增标本中靶细菌16S和23S rDNA基因片段.构建能同时检测肠出血性大肠埃希菌O157:H7、副溶血性弧菌、沙门菌、霍乱弧菌、单核细胞增生李斯特菌、空肠弯曲菌和志贺菌的寡核苷酸芯片,并考核芯片的检测特异性、灵敏度和重复性.采用所建立的寡核苷酸芯片检测81例腹泻患者粪便样本.结果 双重PCR可同时扩增上述七种病原菌的16S和23SrDNA基因靶序列.所研制的寡核苷酸芯片检测灵敏度可达103 cfu/ml,非靶细菌无阳性结果 ,不同批间和批内芯片的变异系数为3.89%～5.81%.寡核苷酸芯片检测粪便样本的阳性率为39.5%(32/81),与常规细菌学检查法检测结果 的符合率达到96.3%(78/81),菌种鉴定结果 符合率为96.8%(31132).结论 研究建立的寡核苷酸芯片法在检测七种病原菌时具有简便、快速、准确、高通量等优点,适合于临床样本检测及流行病学现场调查.     

Rapid identification of Enterobacteriaceae using a novel 23S rRNA-targeted oligonucleotide probe

The aim of this study was to rapidly identify bacteria of the family of Enterobacteriaceae using fluorescent in situ hybridization (FISH). A comparative sequence analysis was carried out and a 23S rRNA signature sequence for Enterobacteriaceae was identified. A 23S rRNA-targeted oligonucleotide probe (EBAC1790) was constructed and subsequently tested against 40 reference strains. Nearly all of the Enterobacteriaceae used in this study yielded positive results with EBAC1790, except for Edwardsiella tarda (ATCC 15947). None of the non-Enterobacteriaceae reference strains gave positive signals with the probe. The possibility of a rapid detection of Enterobacteriaceae in groundwater was demonstrated using colony hybridization.     

双位点保守基因特异性PCR-CE-RFLP快速鉴定病原菌的实验与临床研究

[目的]初步建立一个临床常见病原菌的标准PCR-CE-RFLP数据库,为临床快速鉴定病原菌奠定基础。[方法]选取临床分离的病原菌共167株,筛选16S rRNA基因和16S-23S rRNA间区基因的合适引物,分别用FAM和JOE两种荧光素标记,调整PCR反应条件,让两种引物能同时在同一条件下反应,所得产物先用普通琼脂糖凝胶电泳,再分别用限制性内切酶HaeIII进行不完全酶切,酶切产物50倍稀释后进行毛细管电泳(PCR-CE-RFLP),测定酶切片段长度差异。[结果]针对16S rRNA基因的RFLP谱数据只能将病原菌鉴定到"科"的程度,而单纯应用16S-23S rRNA间区基因的RFLP谱数据虽能区分绝大多数细菌,但个别种属内仍然出现相似的谱型。经过双位点PCR-CE-RFLP分析后,则可将所有细菌鉴定到"种"的程度。[结论]利用16S rRNA基因和16S-23S rRNA间区基因PCR-CE-RFLP进行细菌鉴定简便快捷,能将传统方法需要十几个小时甚至几十小时的鉴定工作缩短到几个小时,是一种极有临床应用价值的快速诊断方法。     

16S rRNA基因测序分析技术在食品污染菌监测中的应用

目的 将16S rRNA基因测序分析技术应用于食品安全风险监测中非目标(相似、少见或非典型)致病菌的鉴定,为食源性疾病防控提供更多病原学证据。方法 采集18份畜类、18份禽类和9份鱼类共45份生鲜样品,目标致病菌按照GB4789标准检测,非目标菌进行16S rRNA基因测序,将全长序列在GenBank中比对确定细菌种属,通过MEGA6构建细菌16S rRNA基因进化树,判定细菌种属间的亲缘关系。结果 45份生鲜样品中检出19株目标致病菌,包括沙门氏菌、空肠弯曲菌、单增李斯特菌和副溶血弧菌,而34株非目标菌16S rRNA基因全长序列能分别比对出13种细菌,其中8种19株菌属于致病或条件致病菌,包括霍乱弧菌、溶藻弧菌、结肠弯曲菌、奇异变形杆菌、粪肠球菌和铜绿假单胞菌,以及在深圳乃至省内首次报道的布氏弓形菌和海藻希瓦氏菌。结论 深圳市售生鲜食品受到多种食源性致病菌污染,特别是非目标检出的致病菌,对此认为16S rRNA基因测序分析技术是一套有效的细菌监测适宜技术,能提高食源性疾病和食物中毒的防控水平。     

肠道常见病原菌检测基因芯片的制备与评价

目的建立并评价快速准确地检测肠道致病菌的基因芯片检测方法。方法在基因芯片制备基础上，通过对靶基因的扩增、杂交和对杂交结果的分析，对常见肠道致病菌的检测和鉴定效果进行评价。结果应用包含38种特异性探针的基因芯片，对涉及沙门菌、志贺菌、霍乱弧菌、致泻性大肠埃希菌、空肠弯曲菌、小肠结肠炎耶尔森菌、副溶血弧菌和单核细胞李斯特菌等8个菌属的16株致病菌进行检测，均得到特异性杂交图谱。结论制备的基因芯片能够同时检测多种重要的肠道致病菌，为肠道致病菌感染的快速诊断提供了准确、快速、灵敏的方法。     

软腐白菜根系土壤中香味类香味菌的分离与鉴定

目的 鉴定软腐白菜根系土壤中分离的条件致病菌--香味类香味菌.方法 采用选择性培养基,从软腐白菜根系土壤中分离出15株产生芳香气味的细菌,通过对菌株进行形态学观察、生理生化试验以及16S rRNA基因序列测定、比对分析和系统发育树构建,对该类群菌株进行初步分类鉴定.结果 软腐白菜根系土壤中分离获得的15株产生芳香气味的...     

肠道致病菌16S rRNA基因的快速检测和鉴定

[目的]建立快速检测及鉴定常见肠道致病菌细菌种属的分子生物学方法。[方法]选择痢疾杆菌、霍乱弧菌、大肠杆菌等细菌的纯培养物进行培养,设计16S rRNA基因通用引物进行PCR扩增,对PCR产物经两种方法处理:一是PCR产物与质粒连接,克隆后进行DNA测序;二是对PCR产物纯化后直接测序;对两种方法的测序结果均与核酸基因库进行BLAST比对,鉴定细菌种类,并比较两种方法所得测序结果的差别。[结果]从几种细菌的纯培养物中均成功扩增出特异性目的产物,克隆后测序与PCR产物直接测序,两种方法均可鉴定出细菌类别。[结论]16S rRNA基因PCR产物的克隆后测序或直接测序,可用于常见致病菌的快速检测和鉴定,但PCR产物直接测序更方便、省时、省力。     

贵州省死亡病例1型猪链球菌的分离及分子生物学特征分析

目的 对来自贵州省1例疑似人感染猪链球菌患者的血液标本进行细菌分离鉴定,了解该菌株的分子生物学特征,为病例的快速确诊提供病原学依据。方法 采用血培养法对疑似感染猪链球菌患者的血液进行细菌分离培养,对分离菌株采用细菌16S rRNA 基因通用引物进行PCR扩增和DNA序列测定,将测序结果通过GenBank数据库的BLAST程序进行在线比对,再用猪链球菌种特异的16S rRNA 基因进行猪链球菌种的鉴定,进一步分别采用PCR检测常见强致病性血清型1、2、7和9型特异的cps 1j、cps 2j、cps 7h和cps9h基因以鉴定其血清型,并对菌株毒力基因gapdh、mrp、sly和ef进行检测。结果 血培养分离出1株链球菌可疑菌株,序列比对结果显示该分离菌株16S rRNA基因与猪链球菌的同源性最高,进一步的猪链球菌特异性PCR检测显示分离菌株16S rRNA基因为阳性,血清型特异PCR检测结果显示cps 1j基因为阳性,而cps 2j、cps 7h和cps 9h基因为阴性,毒力基因检测结果显示分离菌株gapdh,sly和ef毒力基因为阳性,而mrp为阴性。结论 本次从疑似感染猪链球菌死亡病例分离的菌株为猪链球菌1型,其毒力特征为gapdh、sly和ef基因阳性,mrp基因阴性,该病例为1型猪链球菌感染所致,且菌株毒力较强。     

核酸检测及相关技术在食源性致病菌快速检测中的研究

传统的细菌分离、培养与鉴定由于需时较长,难以适应食源性疾病预防控制的需要。近年来,伴随着核酸检测技术的迅猛发展,各种能够快速检测食源性致病菌的方法相继诞生。本文就聚合酶链式反应及其衍生技术、核酸恒温扩增技术、寡核苷酸微阵列技术、免疫磁性细胞分离技术及DNA生物传感器技术在沙门菌、金黄色葡萄球菌、肠出血性大肠埃希菌等食源性致病菌快速检测中的应用研究进行综述。