激活素A对RAW264.7巨噬细胞活性的调节作用

目的探讨激活素A对参与炎症反应的小鼠巨噬细胞活性调节作用。方法以LPS刺激活化的小鼠巨噬细胞系RAW264．7细胞作为阳性参照，ELISA法检测激活素A及LPS刺激的小鼠腹腔巨噬细胞系RAW264．7细胞IL-1β分泌水平，还原酶法分析NO分泌水平，RT-PCR检测IL-1β和iNOS mRNA的表达，瑞氏染色检测RAW264．7细胞吞噬活性。结果在激活素A刺激下RAW264．7细胞IL-1β和NO分泌水平均明显升高，IL-1β和iNOS mRNA表达亦增加，巨噬细胞吞噬活性增强；激活素A和LPS共刺激RAW264．7细胞时，激活素A明显抑制LPS刺激的RAW264．7细胞IL-1β和NO产生水平，以及IL-1β和iNOS mRNA表达，巨噬细胞吞噬活性也明显低于LPS单独刺激组。结论激活素对巨噬细胞的活性调节具有双重作用，这种作用与巨噬细胞的激活状态有关。     

ARIP2在小鼠巨噬细胞系RAW264.7中对IL-1β分泌的抑制作用

研究ARIP2在巨噬细胞中对IL-1β分泌的调节作用,探讨激活素A与巨噬细胞活化的可能关系及其作用机制。为了分析ARIP2在小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞中的表达及其生物学作用,实验采用RT-PCR方法检测RAW264.7细胞中ARIP2 mRNA的表达,ELISA方法观察过表达ARIP2对RAW264.7细胞分泌IL-1β的影响。RAW264.7细胞能够表达特异性ARIP2 mRNA,其RNA表达受激活素A刺激呈剂量依赖性增加。ELISA检测结果显示过表达ARIP2可以抑制RAW264.7细胞分泌IL-1β。上述资料提示ARIP2不仅具有抑制激活素诱导的特异基因转录活性,其自身也具有多种生物学活性,可能在激活素A抑制LPS活化巨噬细胞分泌IL-1方面,发挥关键性信号转导调控作用。     

链球菌蛋白对RAW264.7小鼠巨噬细胞免疫学活性的调节作用

目的:探讨链球菌蛋白对RAW264.7小鼠巨噬细胞免疫活性调节及其相关作用机制.方法:不同浓度的链球菌蛋白与RAW264.7小鼠巨噬细胞共同作用后,采用MTT 法检测细胞的增殖活化;吞噬中性红试验观察巨噬细胞的吞噬功能;生物化学法检测巨噬细胞上清液中TNF-α和IL-6 的含量;RT-PCR法检测细胞中TNF-α、IL-6和Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)的mRNA表达情况;流式细胞术检测细胞表面TLR2和TLR4的表达强度.结果:链球菌蛋白对巨噬细胞的生长增殖和吞噬功能有较强的刺激作用(P<0.05),促进TNF-α和IL-6的表达和分泌(P<0.05),并可上调巨噬细胞表面模式识别受体TLR2和TLR4的表达(P<0.05).结论:链球菌蛋白通过刺激RAW264.7小鼠巨噬细胞的增殖,增强细胞吞噬活性以及诱导细胞因子的产生等发挥其免疫调节作用.     

中药饮片鹿血晶对巨噬细胞的免疫调节作用研究

目的:探讨鹿血晶(DBC)对小鼠巨噬细胞系RAW 264.7的免疫调节作用及其可能机制。方法:CCK-8法检测细胞活力;流式细胞术及免疫荧光法检测巨噬细胞对大肠杆菌的吞噬能力;qRT-PCR法检测炎症因子iNOS、IL-1β、IL-6的mRNA表达水平;ELISA法检测培养基上清中iNOS、IL-1β、IL-6含量;Western blot法检测转染NF-κB信号通路蛋白表达。结果:鹿血晶能够提高LPS刺激下的RAW 264.7细胞活力(P0.05);鹿血晶能抑制LPS刺激下RAW 264.7细胞的炎症因子表达和释放(P0.05);鹿血晶能够抑制LPS刺激下RAW 264.7细胞内磷酸化IKK-α/β和磷酸化P65蛋白的表达;鹿血晶促进RAW 264.7细胞对大肠杆菌的吞噬能力(P0.05)。结论:鹿血晶能够增强巨噬细胞吞噬大肠杆菌的能力,并且在不影响细胞活力的同时作用于NF-κB信号通路,抑制炎症状态下巨噬细胞炎症因子的表达与释放。     

全蝎水提物对巨噬细胞活化作用研究

目的:观察全蝎水提物(Buthus martensii water extract,BMWE)在体外对小鼠巨噬细胞株RAW264.7的活化作用。方法:MTT法测定细胞活性;采用FITC标记的酵母测定吞噬活性;利用Griess试剂和ELISA方法测定细胞上清NO、TNF-α和IL-6释放量。结果:BMWE在不影响细胞活力的剂量范围内可增强正常及免疫抑制的RAW264.7细胞吞噬荧光酵母能力(P0.01),增加RAW264.7细胞NO释放量(P0.01),促进RAW264.7细胞TNF-α和IL-6产生(P0.01),均具有良好的量效关系。结论:BMWE可明显提高巨噬细胞吞噬功能与分泌能力,活化巨噬细胞,此作用与全蝎传统用于治疗疮疡、瘰疬,现代用于肿瘤的临床应用相关。     

三百棒通过调控TLR4/NF-κB信号通路对脂多糖诱导的RAW264.7细胞极化的影响

目的：探讨三百棒醇提物(TAAE)对脂多糖(LPS)诱导的小鼠单核-巨噬细胞RAW264.7极化趋向以及其对炎症反应的影响。方法：用LPS诱导RAW264.7细胞建立炎症模型。CCK-8法检测细胞活力;ELISA检测细胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10)的水平;Griess法检测细胞培养上清液中一氧化氮(NO)的分泌情况;荧光染色双标法观察巨噬细胞的极化状态;免疫荧光染色检测NF-κB定位及表达;Transwell检测TAAE对RAW264.7细胞迁移和趋化性的影响;RT-qPCR检测TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10、Arg-1、NF-κB和TLR4的mRNA水平;Western blot检测iNOS、COX-2、TLR4、NF-κB、p-NF-κB、IκBα和p-IκBα蛋白水平。使用TLR4通路抑制剂TAK-242进一步验证TAAE对TLR4/NF-κB信号通路的影响。结果：与模型组相比较,TAAE降低LPS诱导的炎症模型RAW264.7细胞中M1型促炎因子(TNF-α、IL-1β和IL-6)及NO水平,促使M2型抑炎因子(IL-10和Arg-1)分泌...     

Aβ1-42通过TLR4影响小鼠巨噬细胞RAW264.7炎症因子IL-1β和IL-6释放

目的探讨Aβ1-42对小鼠巨噬细胞RAW264.7向炎症性细胞转变的影响及机制。方法 RAW264.7细胞分别经过LPS与Aβ1-42刺激,RT-PCR和Western blot检测GM-CSF受体CSF2RA和CSF2RB的表达水平,ELISA检测在Aβ1-42刺激下的炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α水平;采用TLR4抑制剂分别干预LPS和Aβ1-42处理后的RAW264.7,检测CSF2RA与CSF2RB受体的表达变化,炎症因子IL-1β、IL-6的释放。结果 RAW264.7细胞表面GM-CSF受体CSF2RB在LPS与Aβ1-42处理后表达水平均比对照组升高(P0.05),而CSF2RA表达没有显著性改变;炎症因子IL-6与IL-1β在Aβ1-42刺激后分泌增加,同时TLR4抑制剂抑制LPS和Aβ1-42对细胞的刺激。结论 Aβ1-42通过TLR4促进小鼠RAW264.7细胞炎症因子IL-6、IL-1β的分泌。     

小鼠ACADL对巨噬细胞表达炎症因子的影响

目的探讨长链酰基辅酶A脱氢酶(Acyl-CoA dehydrogenase,long chain,ACADL)对巨噬细胞分泌炎症因子的影响。方法在体外诱导的小鼠骨髓来源巨噬细胞中加入脂多糖(LPS)以及白细胞介素4(IL-4)分别诱导M1和M2极化,在极化0、12、24、36、48 h时用Western blot检测ACADL在M1和M2极化中的蛋白表达量。构建ACADL-pEGFP-N1质粒,使用G418筛选和鉴定过表达ACADL的RAW264.7细胞稳定株。LPS刺激过表达ACADL稳定株和对照组细胞4 h后,通过ELISA和qRTPCR检测TNF-α、IL-6、IL-10的表达情况。在RAW264.7细胞中加入beta氧化抑制因子etomoxir预处理,ELISA检测TNF-α、IL-6、IL-10的表达情况。结果在巨噬细胞极化过程中ACADL蛋白量先减少再增加;过表达ACADL的细胞中,IL-6和IL-10分泌量及mRNA水平均显著高于对照组(P0.001):beta氧化抑制因子etomoxir能够减少RAW264.7细胞分泌炎症因子。结论 ACADL能增强巨噬细胞IL-6和IL-10的分泌,其作用机制可能是通过beta氧化影响炎性细胞因子的表达。     

川续断皂苷Ⅵ对M1/M2型巨噬细胞极化的调节作用及机制

目的：研究川续断皂苷Ⅵ对M1/M2型巨噬细胞极化的调节作用及机制。方法：MTT法检测川续断皂苷Ⅵ对RAW264.7细胞活力的影响。ELISA检测脂多糖（LPS）诱导状态下RAW264.7细胞上清中TNF-α和IL-6的分泌量；Griess法检测LPS诱导状态下RAW264.7细胞上清中一氧化氮（NO）含量；荧光定量PCR检测TNF-α、IL-6、精氨酸酶-1(Arg-1)、血红素加氧酶1(HO-1)和细胞因子信号转导抑制蛋白-2(SOCS2)基因表达水平。Western blot检测一氧化氮合酶（iNOS）和p-p65蛋白表达。结果：在LPS诱导的RAW264.7细胞中，川续断皂苷Ⅵ抑制TNF-α、IL-6、iNOS和p-p65蛋白或基因表达水平，同时增加HO-1基因表达。川续断皂苷Ⅵ能抑制LPS诱导下RAW264.7细胞分泌的NO。川续断皂苷Ⅵ增加IL-4诱导下M2型巨噬细胞标志物Arg1和SOCS2基因表达。结论：川续断皂苷Ⅵ可以抑制RAW264.7巨噬细胞向M1型极化，同时促进其向M2型极化，可通过调节M1/M2型巨噬细胞极化发挥其抗炎免疫调节作用。     

GW4064 对LPS 诱导的RAW264.7 细胞中炎症反应的影响

目的:研究FXR激动剂GW4064对脂多糖(LPS)诱导的RAW264.7巨噬细胞炎症因子TNF-α、MCP-1和NO的分泌及IL-1β、TNF-α的表达,以及诱导型一氧化氮合酶(iNOS)表达的影响。方法:通过流式高通量多因子检测技术和Griess法检测炎症因子TNF-α、MCP-1和NO分泌的影响;采用qPCR技术检测炎症因子IL-1β、TNF-α和iNOS的mRNA的表达;Western blot检测iNOS及NF-κB蛋白的表达的水平。结果:GW4064能抑制LPS诱导的细胞促炎因子IL-1β、TNF-α和iNOS的mRNA的表达(P0.05),同时能不同程度的抑制细胞上清中TNF-α,MCP-1中的分泌量(P0.05);并且呈剂量依赖性的抑制NO的释放(P0.05);除此之外,GW4064(10、20μmol/L)可显著抑制LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞iNOS蛋白的产生(P0.01),经过GW4064处理后,LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞NF-κB的活性也显著下调(P0.01)。结论:FXR激动剂GW4064在巨噬细胞中具有一定的抗炎作用,抑制iNOS的表达及下调NF-κB的活性是其发挥抗炎作用的机制之一。     

香菇茯苓银耳复合多糖对小鼠巨噬细胞功能的作用研究

目的：研究香菇茯苓银耳复合多糖对不同状态下巨噬细胞功能的调节作用。方法：将巨噬细胞株RAW264.7细胞分别与复合多糖（CP）、复合多糖联合LPS（CP+LPS）、复合多糖预孵育后联合LPS（Pre-CP+LPS）共孵育,采用荧光显微镜和流式细胞仪检测RAW264.7细胞吞噬荧光微球情况;采用Griess试剂检测RAW264.7细胞分泌NO水平;采用流式细胞术检测巨噬细胞表面活化标志物CD40、CD80和CD86的表达水平。结果：RAW264.7细胞与复合多糖共孵育条件下,复合多糖可以增强RAW264.7细胞对荧光微球的吞噬作用,且随着时间的延长愈加明显;复合多糖低浓度对RAW264.7细胞分泌NO无影响,当浓度达1 000 μg/ml时才能促进其显著分泌NO;复合多糖可以提高RAW264.7细胞CD40、CD80和CD86分子表达水平。在LPS刺激条件下,复合多糖联合LPS与复合多糖预孵育后联合LPS两种处理都可以减轻LPS导致的CD40、CD80和CD86活化标志过表达现象。结论：复合多糖对不同状态下巨噬细胞功能具有调节作用,即可以促进静息状态下巨噬细胞活化和吞噬作用,而对活化状态的巨噬细胞功能具有抑制作用。     

NOD8对LPS诱导巨噬细胞释放NO、TNF-α和IL-1β的影响

 目的： 探讨NOD8对脂多糖（LPS）诱导巨噬细胞释放一氧化氮（NO）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）和白细胞介素1β（IL-1β）的影响。方法： pEGFP-C2及pEGFP-NOD8重组质粒分别转染小鼠巨噬细胞RAW264.7,以LPS刺激RAW264.7细胞0、6、12、24 h后,采用Griess reagent法测定观察细胞分泌的NO水平;ELISA法检测IL-1β 和 TNF-α 的含量;荧光法测定活化的caspase-1水平; Western blotting检测NOD8蛋白表达及NF-κB  p65亚基的核转位情况。结果： (1)与转染pEGFP-C2空质粒组比较,转染pEGFP-NOD8质粒组NOD8蛋白表达明显增加。(2) LPS刺激6、12、24 h后,RAW264.7细胞释放NO、IL-1β及TNF-α均明显增加;而在pEGFP-NOD8+LPS组RAW264.7细胞, NO于12、24 h 的释放显著降低,IL-1β于6、12、24 h的释放也明显降低,TNF-α的释放则无明显变化。（3）在LPS刺激6、12、24 h后, RAW264.7细胞caspase-1活化水平均明显升高,胞浆NF-κB p65亚基表达明显减少,表明p65核转位增加;而pEGFP-NOD8+LPS组可显著抑制caspase-1的活化以及NF-κB p65亚基的核转位,差异有统计学意义。结论： NOD8可抑制LPS诱导的巨噬细胞NO与IL-1β释放,其作用机制可能与NOD8抑制caspase-1及NF-κB 的活化有关。     

Expolysaccharides from Bifidobacterium animalis RH activates RAW 264.7 macrophages through toll-like receptor 4

A water-soluble expolysaccharide (EPS) was prepared from Bifidobacterium animalis RH by enzymatic hydrolysis, ethanol precipitation and Sepharose CL-6B column chromatography. Its immunomodulating activity was evaluated using murine macrophage cell line RAW 264.7. The data obtained showed that the EPS promoted proliferation and phagocytosis activity of RAW 264.7 cells. In addition, the EPS promoted RAW 264.7 cells to produce NO, IL-6, TNF-α, MCP-1 and MIP-1α in a dose-dependent manner. Further work revealed that the EPS activated RAW 264.7 cells majorly through TLR4.     

Rab7负向调控巨噬细胞中CpG诱导的细胞因子的表达

目的:研究Rab7过表达及失活突变(Rab7T22N)对CpG刺激的RAW264.7巨噬细胞中分泌细胞因子的影响。方法:采用RT-PCR和Real-time PCR检测RAW264.7细胞中Rab7在CpG刺激下表达模式。将Rab7真核表达质粒及失活突变质粒Rab7T22N通过脂质体法转染RAW264.7细胞,G418稳定筛选,Western法鉴定表达效果。用CpG刺激稳定表达Rab7的RAW264.7细胞系,RT-PCR和Real-time PCR检测细胞因子IL-6、IL-1β、IFN-β的表达量变化。结果:CpG刺激RAW264.7后,Rab7 mRNA表达水平逐渐增高,在8小时达到高峰,表达增高近4倍。Rab7过表达后,CpG刺激后产生的IL-6、IL-1β、IFN-β显著降低。巨噬细胞中Rab7失活突变后,在CpG刺激后IL-6、IL-1β、IFN-β的表达又显著增加。结论:CpG促进RAW264.7巨噬细胞中Rab7 mRNA的表达,Rab7抑制了CpG刺激的巨噬细胞中IL-6、IL-1β、IFN-β的表达,该抑制作用的发挥与其酶活性的GTP结合有关。该研究为进一步阐明Rab7在CpG/TLR9信号通路中的作用奠定了基础。     

核仁素对LPS诱导的白细胞介素1β释放的影响

目的: 探讨核仁素在脂多糖(LPS)所致炎症模型中的表达及其对LPS所致的白细胞介素1β(IL-1β)释放的影响。方法: 小鼠腹腔注射LPS(15 mg/kg)建立内毒素血症模型,LPS(500 μg/L)处理建立RAW264.7细胞炎症模型,采用免疫印迹观察核仁素在炎症模型中的表达。利用瞬时转染技术抑制或增加RAW264.7细胞内核仁素表达后,LPS处理,酶联免疫吸附实验(ELISA)检测细胞培养基中IL-1β的含量。结果: 在内毒素血症小鼠的肺组织和RAW264.7细胞炎症模型中,110 kD核仁素表达上调,80 kD核仁素片段表达减少。与转空载体对照组比较,核仁素过表达组LPS所致的IL-1β释放明显增加(P<0.05);与正常细胞组和随机寡核苷酸组比较,核仁素低表达组LPS所致的IL-1β释放明显减少(P<0.05)。结论: 在LPS所致的炎症模型中,110 kD核仁素表达上调, 80 kD核仁素片段表达减少;核仁素促进LPS所致的IL-1β释放。     

黄连乙醇提取物与盐酸小檗碱体外抗炎对比研究

目的:比较黄连乙醇提取物与盐酸小檗碱体外抗炎活性,探索体外抗炎机制。方法:通过脂多糖体外刺激小鼠单核巨噬细胞建立细胞炎症模型,给药干预后,LPS 长时间刺激RAW264.7 细胞,MTT 比色法分析黄连乙醇提取物及盐酸小檗碱对RAW264.7 细胞生长活性的影响。酶联免疫吸附法检测细胞上清液中IL-β、IL-6、TNF-α、NO、前列腺素E2 (PGE2)含量。实时荧光定量RT-PCR 法检测iNos、HO-1、TNF-αmRNA 表达。结果:在5 ~80 mg/ L 范围内,黄连乙醇提取物及盐酸小檗碱对RAW264.7 细胞无抑制作用;各浓度给药组IL-6、IL-1β、TNF-α、NO、前列腺素E2 (PGE2 )含量与LPS 刺激模型组比较均有显著性(P<0.01),且浓度与剂量无效应相关。实时荧光定量RT-PCR 结果显示,各浓度给药组均明显降低iNos、HO-1、TNF-αmRNA 表达(P<0.05,P<0.05,P<0.01),且与浓度不呈效应关系。结论:黄连乙醇提取物具有体外抗炎作用,抗炎活性优于盐酸小檗碱,其作用机制可能与抑制TNF-α、NO 等炎症因子的活化,进而影响花生四烯酸(AA)代谢有关。     

Caspase-1 inhibition attenuates activation of BV2 microglia induced by LPS-treated RAW264.7 macrophages

Neuroinflammation has been recognized as a factor in the pathogenesis of neurodegenerative diseases. Emerging evidence suggests that peripheral inflammation, besides neuroinflammation, functions as a modulator of disease progression and neuropathology in several neurodegenerative diseases. However, detailed correlations among peripheral inflammation, neuroinflammation and neurodegeneration remain unknown. In the present study, we prepared a peripheral inflammation model with lipopolysaccharides (LPS)-stimulated RAW264.7 macrophages to explore its activation on BV2 microglia. We found that LPS induced the production of IL-1β, IL-6 and TNF-α in the culture medium of RAW264.7 macrophages. We further showed that LPS plus ATP activated inflammasome, evidenced by the upregulation of caspase-1 and IL-1β, which was suppressed by ZYVAD, a caspase-1 inhibitor. Furthermore, the conditioned medium obtained from LPS-treated RAW264.7 macrophages activated BV2 microglia, stimulating the release of IL-1β, IL-6 and TNF-α from BV2 cells. ZYVAD pretreatment markedly suppressed BV2 microglia activation induced by RAW264.7 cells conditioned medium. Taken together, our study indicates that macrophage-mediated peripheral inflammation subsequently evokes neuroinflammation and may aggravate neural damage. Inflammasome and caspase-1 may be potential targets for modulating systemic inflammatory responses in neurodegenerative diseases.     

β-sitosteryl-3-O-β-glucopyranoside isolated from the bark of Sorbus commixta ameliorates pro-inflammatory mediators in RAW 264.7 macrophages

The bark of Sorbus commixta has been used in Asian traditional medicine for treatment of cough, asthma, bronchial disorders, gastritis and dropsy. However, the anti-inflammatory effect of β-sitosteryl-3- O -β-glucopyranoside, a major compound of the bark of S. commixta, is poorly understood. In this study, we investigated the anti-inflammatory effect and the underlying molecular mechanisms of β-sitosteryl-3-O-β-glucopyranoside in lipopolysaccharide (LPS)-induced RAW 264.7 cells. Prostaglandin E₂ (PGE₂) and cytokines released from cells were measured using EIA assay kit. The expression of inducible NO synthase (iNOS) and cyclooxygenase (COX)-2, Tumor necrosis factor-alpha (TNF-α), interleukin-1β (IL-1β), and interleukin-6 (IL-6) was measured by real-time polymerase chain reaction (RT-PCR) and/or Western blot analysis. β-sitosteryl-3-O-β-glucopyranoside inhibited the production of nitric oxide (NO) and PGE₂ along with the expression of iNOS and COX-2 in LPS-stimulated RAW264.7 cells. In addition, β-sitosteryl-3-O-β-glucopyranoside reduced the release of pro-inflammatory cytokines, such as TNF-α, IL-1β and IL-6. Moreover, β-sitosteryl-3-O-β-glucopyranoside inhibited the NF-κB activation induced by LPS, which was associated with the abrogation of IκBα degradation and subsequent decreases in nuclear p65 levels. The result suggested that the β-sitosteryl-3-O-β-glucopyranoside inhibited NO and pro-inflammatory productions by down-regulating the gene expression of pro-inflammatory mediators via the negative regulation of the NF-кB pathway in LPS-stimulated RAW 264.7 cells.