咖啡酸苯乙酯对LPS诱导大鼠KC表达细胞因子的影响

目的 观察CAPE对LPS活化大鼠KC表达合成细胞因子IL-6和TNF-α的影响.方法 经在体灌流消化大鼠肝脏分离KC细胞,培养于RPMI-1640培养基中,用LPS活化KC细胞,经CAPE处理后,用实时定量RT-PCR检测KC细胞中IL-6和TNF-α基因表达,用ELISA方法检测培养基中IL-6和TNF-α蛋白含量.结果 对于LPS诱导活化的KC细胞,CAPE剂量依赖地降低KC细胞中IL-6和TNF-α mRNA表达,分别在10 μmol/L和20 μmol/L时差异具有统计学意义,KC合成IL-6和TNF-α蛋白也显著降低.结论 CAPE具有降低LPS活化KC表达合成IL-6和TNF-α作用.     

脂多糖对衰老大鼠肺泡巨噬细胞分泌细胞因子的影响

目的探讨脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)对衰老大鼠模型肺泡巨噬细胞(alveolar macrophage,AM)产生细胞因子的影响。方法①将24只Wistar大鼠随机均分为2组,任取其中1组用D-半乳糖[D-galac-tose,D-gal,20mg/(kg.d)]腹腔注射,连续6周制备衰老大鼠模型;另1组青年大鼠作为对照;②应用支气管肺泡灌洗和细胞贴壁的方法获取AM,用瑞氏染色鉴定纯度、台盼蓝染色测定活细胞数;③将各组获取的AM再随机均分为LPS刺激组及阴性对照组,其中LPS刺激组细胞在贴壁2h后加入含10mg/L LPS的1640培养液,24h后用酶联免疫吸附法(enzyma linked immunosorsent assay,ELISA)分别测定细胞上清液中肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis fac-tor-α,TNF-α)和内皮素(endolthelin,ET-1)的含量。结果(1)青年、老年大鼠LPS刺激组TNF-α、ET-1均高于对照组;(2)老年LPS刺激组肺泡灌洗液上清中TNF-α[(31.32±2.38)pg/ml]高于青年LPS刺激组[(25.48±3.52)pg/ml,P<0.05];老年LPS刺激组ET-1[(3.91±0.11)pg/ml]高于青年LPS刺激组[(3.17±0.11)pg/ml,P<0.05]。结论老年大鼠对LPS刺激的反应程度大于青年组,AM在炎症反应中起重要的作用。     

三种方法体外同步分离培养大鼠肝枯否细胞和星状细胞的比较

目的比较淋巴细胞分离液（LS）、Percoll液（PS）和Nycodenz液（NS）同步分离培养大鼠肝枯否细胞（KC）和星状细胞（HSC）的优缺点。方法①采用链酶蛋白酶E、胶原酶Ⅳ联合原位灌流消化，分别以LS、PS和NS的非连续密度梯度离心法同步分离培养大鼠KC和HSC。②碳素墨汁吞噬试验鉴定KC；α-SMA免疫细胞化学染色法鉴定HSC。③倒置相差显微镜下观测细胞形态，台盼蓝染色显示细胞活性，计数后计算细胞的得率、存活率和纯度。结果体外成功地同步分离培养了KC和HSC；培养的KC吞噬功能明显，而传代HSCα—SMA免疫细胞化学染色阳性者几乎达100％；采用PS或NS体外同步分离KC的细胞得率和纯度均显著高于采用LS分离细胞所得（P〈0．01），而采用NS体外同步分离肝KC的细胞存活率显著高于PS或LS分离细胞的存活率（P〈0．05）；分别采用LS、PS和NS同步分离HSC，三者的细胞存活率逐次升高（P〈0．05或P〈0．01），而使用LS同步分离的细胞虽然细胞得率比较高（P〈0．05），但其细胞纯度较使用PS和NS明显降低（P〈0．05），PS和NS分离获得的HSC得率和纯度均无明显统计学差异。结论采用Percoll液和Nycodenz液体外同步分离培养大鼠肝KC和HSC效果好，且后者的细胞存活率最高。     

原代培养大鼠肝星状细胞、枯否氏细胞及肝素的干预作用

目的同步分离培养大鼠肝星状细胞及枯否细胞,应用肝素进行干预,观察肝素在体外对肝星状细胞及枯否细胞的影响.方法应用Nycodenz一步密度梯度离心法一步分离肝纤维化大鼠的肝星状细胞及枯否细胞.分别将不同浓度的肝素加入肝星状细胞和枯否细胞培养板中,应用MTT比色法检测各组肝星状细胞和枯否细胞的增殖状况,免疫细胞化学检测各组肝星状细胞中α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、转化生长因子-β1(TGF-β1)、层连蛋白(LN)的表达.结果加入高浓度肝素、低浓度肝素及未用药的肝星状细胞0D值分别为0.0626±0.0137、0.0746±0.0131和0.1106±0.0198.加入高浓度肝素、低浓度肝素及未用药的枯否氏细胞0D值分别为0.1340±0.0270、0.1540±0.270和0.2120±0.0444.二肝素组肝星状细胞、枯否氏细胞0D值均显著低于未加药组.高浓度肝素组肝星状细胞及枯否氏细胞0D值较低浓度肝素组为低,但无显著性差异.加入肝素的肝星状细胞α-SMA、TGF-β1,LN的表达较未用药的肝星状细胞为弱.高浓度肝素组α-SMA、TGF-β1 LN的表达较低浓度肝素组弱.结论肝素可抑制肝星状细胞的增殖、活化及胶原的分泌,且对枯否氏细胞也具有抑制作用.     

姜黄素对内毒素脂多糖诱导的库普弗细胞分泌炎症细胞因子的抑制作用

[目的]观察姜黄素对内毒素脂多糖（LPS）诱导的库普弗细胞（KC）分泌炎症细胞因子的影响。[方法]分离并培养KC48h后，分设不同浓度姜黄素组，作用于KC3h，确立无毒性的剂量范围；分正常组、LPS组、LPS加姜黄素组（分3种浓度），在添加姜黄素1h后，加LPS（0．1μg／ml培养液）刺激2h。取上清用ELISA法测定肿瘤坏死因子α（TNF-α）、放免法测白细胞介素1β（IL-1β）和IL-6水平；并以细胞免疫荧光化学法观察细胞TNF-α蛋白的表达和分布。[结果]不同浓度组姜黄素均能显著降低TNF-α、IL-1β和IL-6的水平以及细胞TNF-α蛋白的表达，量效关系显著。[结论]姜黄素对LPS诱导的KC炎症细胞因子分泌有显著的抑制作用。     

Notch2分子对慢性乙型肝炎患者CD8~+T细胞功能的影响及意义

目的观察慢性乙型肝炎患者外周血CD8~+T细胞中Notch2分子的表达情况,并分析Notch2分子对CD8~+T细胞功能的影响。方法选择30例慢性乙型肝炎患者和15名健康对照者,应用密度梯度离心法分离外周血单个核细胞,应用免疫磁珠法分离CD8~+T细胞,应用反转录实时定量PCR法检测CD8~+T细胞中Notch2 mRNA的表达水平。将分离的CD8~+T细胞与HepG2.2.15细胞混合培养,并加入抗Notch2抗体,培养48 h后应用CCK-8法检测细胞增殖,应用ELISA法检测上清中IFN-γ、IL-2及TNF-α的表达水平。结果慢性乙型肝炎患者CD8~+T细胞中Notch2 mRNA的表达水平明显升高,较健康对照者升高超过5倍。应用抗Notch2抗体抑制Notch2分子信号通路后,混合培养细胞的增殖水平(8.88±1.56)×10~5较同型对照组(4.47±1.13)×105和空白对照组(4.39±0.95)×10~5均明显升高,培养上清中的IFN-γ:3815±807 pg/mL和TNF-α:346.3±77.3 pg/mL的表达水平也较同型对照组IFN-γ:1316±484 pg/mL;TNF-α:139.8±40.1 pg/mL及空白对照IFN-γ:1383±604 pg/mL;TNF-α:124.0±45.5 pg/mL组显著升高,差异均具有统计学意义。结论 HBV感染可能通过提高Notch2的表达抑制CD8~+T细胞的杀伤功能,诱导机体免疫耐受,导致感染慢性化。     

鲜生地对肝损伤模型大鼠枯否细胞功能的影响

目的探讨鲜生地在大鼠肝损伤时对肝脏枯否细胞功能的影响。方法取健康成年大鼠64只,随机分成4组:假手术组,肝损伤组,肝损伤+鲜生地组和肝损伤+乳果糖组。前两组以生理盐水灌胃,后两组分别以鲜生地和乳果糖灌胃。观察大鼠血浆内毒素(ET)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-1(IL-1)、谷丙转氨酶(ALT)以及枯否细胞表面CD68蛋白表达。结果与肝损伤组比较,鲜生地组和乳果糖组血浆ET、TNF-α、IL-1、ALT明显降低(P<0.05),CD68蛋白表达减少。结论鲜生地具有抑制肝脏枯否细胞吞噬及分泌作用,减少炎症因子释放,从而减轻肝细胞损伤。     

LPS对乙型肝炎肝功能衰竭患者PBMC分泌细胞因子功能的影响

目的 通过观察PBMC分泌细胞因子功能的变化,探索内毒素血症对乙型重型肝炎患者免疫状态的影响.方法 选择10例乙型肝炎肝功能衰竭、10例慢性乙型肝炎患者和10例健康人,分别抽取外周血10 mL,分离血浆和PBMC.采用鲎实验检测血浆中LPS的浓度.同时常规体外培养PBMC,分为LPS刺激组和LPS未刺激组两组,培养24 h后收集上清液,Luminex检测上清液中TNF-α、IFN-γ和IL-6的浓度.数据处理采用方差分析,t检验及LSD法.结果 1.乙型肝炎肝功能衰竭患者PBMC体外培养上清液中TNF-α为(2 729±778) pg/mL、IFN-γ为(33.97±14.33) pg/mL及IL-6为(30415±8 132) pg/mL,健康人组分别为(350±190)、(5.53±4.86)和(4532±538),慢性乙型肝炎组分别为(504±226)、(0.58±0.59)和(15 587±2 983),乙型肝炎肝功能衰竭组明显高于健康人及慢性乙型肝炎患者.2.乙型肝炎肝功能衰竭患者血浆LPS平均值为(31.16±20.15) pg/mL,明显高于健康人及慢性乙型肝炎患者.3.LPS刺激组PBMC培养24h后,在乙型肝炎肝功能衰竭患者组.PBMC分泌的TNF-α和IL-6刺激组与未刺激组相比有明显降低(P=0.015和P=0.004),差异有统计学意义.IFN-γ刺激组与未刺激组相比差异无统计学意义(P＞0.737).而健康对照组和慢性乙型肝炎患者无明显改变.结论 乙型肝炎肝功能衰竭患者存在明显的内毒血症,PBMC处于活化状态.长期内毒血症可能会引起患者出现内毒素耐受状态,加重患者免疫状态的紊乱,提示临床诊治过程中要积极关注并评估患者免疫状态.     

枯否细胞在高脂饮食致小鼠慢性肝损伤发生中的作用

目的探讨枯否细胞（Kupffer cell，KCs）在高脂饮食致小鼠慢性肝损伤发生中的作用。方法小鼠给予高脂饮食复制慢性肝损伤模型，实验动物随机分为对照组和模型组。12周后，小鼠腹主动脉采血测定血浆丙氨酸氨基转移酶（ALT）、内毒素（LPS）水平；肝组织用于组织病理切片的制备及肿瘤坏死因子α（TNF-α）水平检测。分离培养小鼠KCs，测定其吞噬聚苯乙烯乳珠的能力及在LPS刺激下TNF-α的分泌；采用Western blot方法检测KCs CD14的表达。结果模型组小鼠血清ALT、LPS及肝组织TNF-α水平均明显高与对照组（t=2．87～30．11，P〈0．01）。KCs分离培养表明，模型组小鼠KCs呈活化状态，吞噬聚苯乙烯乳珠能力降低（t：5．04，P〈0．01），LPS刺激后TNF-α的分泌明显增加（t=4．17，P〈0．01）。Westernblot结果显示，模型组小鼠KCsCD14受体表达上调。结论在高脂饮食所致小鼠慢性损伤时，虽KCs处于活化状态，但其吞噬功能降低而分泌TNF-α能力则增强。提示KCs功能紊乱与高脂饮食致小鼠慢性肝损伤发生密切相关。     

脂多糖诱导大鼠心肌细胞肿瘤坏死因子-α表达时活性氧调控的作用

目的 探讨在脂多糖(LPS)诱导大鼠心肌细胞肿瘤坏死因子-α(TNF-α)表达过程中活性氧(ROS)的作用及其信号分子机制.方法 以体外培养的新生SD(Sprague-Dawley)大鼠心肌细胞为实验模型,应用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和酶联免疫吸附实验(ELISA)检测TNF-α mRNA和蛋白表达水平;细胞内ROS水平采用ROS敏感的荧光探针二氯荧光素二乙酸(DCF-DA)测定.采用蛋白免疫印迹法测定心肌细胞内丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)亚型p38 MAPK的磷酸化水平来反映其活性.结果 (1)LPS组心肌细胞TNF-αmRNA和蛋白表达水平分别为(0.29±0.07)和(83.6±14.5)pg/mL,与对照组[(0.07±0.02)、(22.1±7.1)pg/mL]比较差异均有非常显著性意义(P＜0.01).在抗氧化剂氮乙酰半胱氨酸(NAC)干预后,TNF-α mRNA水平(0.13±0.03)和蛋白含量(39.1±10.2)pg/mL与LPS组比较差异均有非常显著意义(P＜0.01).(2)LPS组心肌细胞二氯荧光素(DCF)荧光强度为83±15,与对照组比较(34±9)差异有非常显著意义(P＜0.01).在NAC干预后,DCF荧光强度(19±4)与LPS组比较明显降低,差异有非常显著性意义(P＜0.01).(3)LPS组心肌细胞p38 MAPK相对活性为(0.34±0.07),与对照组(0.18±0.05)比较差异有非常显著意义(P＜0.01).NAC干预组p38 MAPK活性明显降低(0.24±0.03),与LPS组比较差异有非常显著意义(P＜0.01);p38MAPK抑制剂预处理组TNF-α蛋白含量为(46.8±11.6)pg/mL,与LPS组(85.5±22.4)pg/mL比较差异有非常显著意义(P＜0.01).结论 LPS可上调心肌细胞内ROS生成,ROS介导的信号通路至少部分参与了LPS诱导TNF-α表达的调控过程,p38 MAPK可能是该信号通路的重要下游分子之一.     

一种简便实用的大鼠Kupffer细胞的分离与鉴定方法

目的：研究一种简便实用的大鼠Kupffer细胞（KCs）的分离与鉴定方法.方法：原位两步灌流法对大鼠肝脏进行冲洗消化;利用Percoll液进行不连续密度梯度离心分离KCs;;选择性贴壁纯化KCs;台盼蓝染色法鉴定细胞存活率;吞噬实验鉴定细胞功能;ED1单克隆抗体免疫荧光细胞化学鉴定KCs;显微镜下观察KCs形态变化.结果：获取的KCs数量为（2.41±0.32）×107/只,其中活细胞数量占（92.3±2.12）％;吞噬实验显示（95.2±2.58）％的细胞内存在碳素颗粒;免疫荧光化学检测证明KCs纯度为（96.3±1.46）％;在显微镜下观察KCs形态,36h细胞形态变得不规则,3d后呈星形或多角形,体外培养可以存活7～10d.结论：此种KCs分离方法操作相对简便,获取的细胞数量、活性功能、纯度等方面均能达到进一步的实验要求,值得推广.     

脂多糖诱导大鼠心肌细胞肿瘤坏死因子-α表达时活性氧调控的作用

目的探讨在脂多糖(LPS)诱导大鼠心肌细胞肿瘤坏死因子α(TNF-α)表达过程中活性氧(ROS)的作用及其信号分子机制。方法以体外培养的新生SD(Sprague-Dawley)大鼠心肌细胞为实验模型,应用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和酶联免疫吸附实验(ELISA)检测TNF-αmRNA和蛋白表达水平;细胞内ROS水平采用ROS敏感的荧光探针二氯荧光素二乙酸(DCF-DA)测定。采用蛋白免疫印迹法测定心肌细胞内丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)亚型p38MAPK的磷酸化水平来反映其活性。结果(1)LPS组心肌细胞TNF-αmRNA和蛋白表达水平分别为(0·29±0·07)和(83·6±14·5)pg/mL,与对照组[(0·07±0·02)、(22·1±7·1)pg/mL]比较差异均有非常显著性意义(P<0·01)。在抗氧化剂氮乙酰半胱氨酸(NAC)干预后,TNF-αmRNA水平(0·13±0·03)和蛋白含量(39·1±10·2)pg/mL与LPS组比较差异均有非常显著意义(P<0·01)。(2)LPS组心肌细胞二氯荧光素(DCF)荧光强度为83±15,与对照组比较(34±9)差异有非常显著意义(P<0·01)。在NAC干预后,DCF荧光强度(19±4)与LPS组比较明显降低,差异有非常显著性意义(P<0·01)。(3)LPS组心肌细胞p38MAPK相对活性为(0·34±0·07),与对照组(0·18±0·05)比较差异有非常显著意义(P<0·01)。NAC干预组p38MAPK活性明显降低(0·24±0·03),与LPS组比较差异有非常显著意义(P<0·01);p38MAPK抑制剂预处理组TNF-α蛋白含量为(46·8±11·6)pg/mL,与LPS组(85·5±22·4)pg/mL比较差异有非常显著意义(P<0·01)。结论LPS可上调心肌细胞内ROS生成,ROS介导的信号通路至少部分参与了LPS诱导TNF-α表达的调控过程,p38MAPK可能是该信号通路的重要下游分子之一。     

枯否细胞前列腺素E2的分泌与肝脏再生

本文用大鼠从体内、外观察了前列腺素E_2(PGE_2)对肝再生的作用。重点集中在肝部分切除后所分离的离体枯否细胞(KC)在大肠杆菌脂多糖(LPS)的刺激下合成及分泌PGE_2的能力。结果显示,给大鼠体内注射消炎痛(5mg/kg)抑制KC的PGE_2产生,从而显著地阻碍了肝脏的再生。其DNA合成率明显低于未使用组(P<0.01)。而在DNA合成高峰期(术后24h)所分离的再生肝之KC,其合成PGE_2的能力明显强于假手术组对等数量的KC(PGE_2浓度分别为15ng/ml及6.5ng/ml,P<0.01)。据此我们得出结论,KC通过其内源性PGE_2的产生从而启动肝细胞的再生。     

体外灌注法分离大鼠肝脏Kupffer细胞及原代培养

目的:探讨一种简便、高效的大鼠离体肝脏分离Kupffer细胞(KCs)及原代培养的方法.方法:采用大鼠肝脏离体Ⅳ型胶原酶灌注,剪碎肝脏,37℃消化30 min,低速离心去除肝细胞,Pcrcoll不连续密度梯度离心和选择性贴壁的方法分离KCs.通过墨汁吞噬实验和ED2免疫细胞化学来鉴定KCs.结果:分离的KCs的得率在细胞贴壁前(2.1±0.3)×106/g肝脏、贴壁后(1.5±0.1)×106/g肝脏,用0.4%台盼蓝染色,活率大于92%,ED2染色阳性的细胞达90%以上,分离的细胞培养后功能完整并延伸呈不规则型.结论:本实验建立的大鼠肝脏KCs的分离培养方法简便、高效、稳定,培养的细胞具有良好的生物学性状,为进一步研究提供基础.     

CCK-8对LPS刺激大鼠肺泡巨噬细胞p38 MAPK、STAT3表达及TNF-α活性的影响

目的本实验在细胞水平,观察了八肽胆囊收缩素(CCK-8)及其受体非特异性抑制剂丙谷胺(proglumide,Pro)对LPS引起的大鼠肺泡巨噬细胞(AM)分泌TNF-α的影响,并进一步观察了p38MAPK和STAT3的表达。方法分离正常大鼠肺泡巨噬细胞,调节细胞浓度为1×106/ml,分组如下:①对照组;②LPS组:LPS终浓度5μg/ml;③CCK-8+LPS组:CCK-8终浓度10-10mol/L、10-8mol/L或10-6mol/L,LPS剂量同前;④CCK-8组:10-10、10-8和10-6mol/L;⑤Pro+LPS+CCK-8组:2μg/ml丙谷胺,10min后加入5μg/mlLPS及10-8mol/LCCK-8。收集刺激4h的细胞培养上清,应用L929细胞株进行TNF-α活性的生物学检测。刺激30min后,采用免疫细胞化学法观察p38MAPK和STAT3表达的变化。结果与对照组(6.76±1.39)pg/ml相比,LPS组TNF-α活性显著增加(1091.14±67.35)pg/ml(P<0.01)。10-10mol/L、10-8mol/L和10-6mol/L的CCK-8均显著抑制LPS诱导的AM释放TNF-α,且呈剂量依赖性,依次为(970.67±111.53)pg/ml、(583.48±62.03)pg/ml和(484.24±72.01)pg/ml(P均<0.01)。CCK-8本身不影响TNF-α产生。CCK受体非特异性拮抗剂丙谷胺可逆转CCK-8的抑制作用。免疫细胞化学结果显示CCK-8可增强LPS引起的AM中磷酸化的p38MAPK和STAT3的表达。结论p38MAPK为多种信号转导途径的交汇点。CCK-8可能通过激活p38MAPK途径及激活STAT3来调节AM的功能。     

糖皮质激素联合生长激素对大鼠急性肝衰竭的保护作用及其机制初步探讨

目的研究糖皮质激素（氢化考的松琥珀酸钠,HCSS）联合生长激素（GH）对大鼠急性肝衰竭的影响.方法采用Wistar大鼠注射脂多糖（LPS）和D氨基半乳糖（D-GalN）制备急性肝衰竭模型,随机分为正常对照组、模型对照组、药物干预组及造模后4 h干预组,各组于末次给药6 h后处死大鼠,常规H-E染色观察大鼠肝脏病理变化,检测肝功能和血清TNF-α,IL-8,IL-6水平;分离培养大鼠库普否细胞（KC）,经LPS（10μg/ml）刺激,于刺激开始（0 h）和4 h后分别给药,并于0、2、4、8和24 h后收集上清,测定TNF-α.结果HCSS或HCSS联合GH预防给药可显著降低急性肝衰竭大鼠血清TBIL、ALT、AST和TNF-α、IL-8、IL-6水平,药物干预组较模型组肝细胞坏死有明显改善.LPS刺激2 h后,KC培养上清中TNF-α浓度开始上升并在4 h达高峰.在培养开始加用HCSS可明显降低TNF-α水平,而培养4 h后加用HCSS不能明显降低TNF-α水平.在培养开始加用GH可进一步升高TNF-α水平,而联合给予HCSS后可降低TNF-α水平.结论预防性给予大鼠药物干预可明显减轻肝损伤,而在造模4 h后使用HCSS则无明显效果.联合使用合理剂量的HCSS和GH仍能较好的减轻肝损伤.     

两种蠕虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂对小鼠腹腔渗出细胞一氧化氮产生及细胞因子分泌的影响

目的观察两种蠕虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂(cystatin)体外对小鼠腹腔渗出细胞(PEC)一氧化氮(NO)的产生及细胞因子分泌的影响。方法无痛处死BALB/c小鼠10只,收集腹腔内液体,制备渗出细胞(PEC),主要为巨噬细胞。将源自旋毛虫(Trichinella spiralis)及广州管圆线虫(Angiostrongylus cantonensis)的cystatin(Tscystatin,Accystatin)与脂多糖(LPS)刺激的小鼠PEC共孵育,实验分为RPMI组、LPS组、Accystatin+LPS组和Tscystatin+LPS组,除RPMI组外,其余3组均提前2 h用LPS(2μg/ml)刺激贴壁细胞制备炎症模型,Accystatin+LPS组和Tscystatin+LPS组分别用2μg/ml Accystatin或Tscystatin与LPS刺激后的细胞共孵育,每组6孔,培养24 h后,收集上清,用ELISA和硝酸还原酶法检测上清中α肿瘤坏死因子(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、IL-10等细胞因子和NO的水平。采用SPSS11.5统计学软件处理实验数据。结果ELISA检测结果显示:Accystatin+LPS组细胞上清中促炎因子TNF-α和IL-6分别为(507.50±66.32)和(1 440.49±77.25)pg/ml,较LPS组的(454.15±53.11)和(1 016.2±115.10)pg/ml明显升高(P0.05)。Tscystatin+LPS组分别为(296.35±55.30)和(793.54±86.61)pg/ml,较LPS组和Accystatin+LPS组明显降低(P0.05)。RPMI组和LPS组的IL-10分别为(38.80±6.71)和(53.66±7.72)pg/ml,差异无统计学意义(P0.05),Accystatin+LPS组和Tscystatin+LPS组的IL-10分别为(149.74±26.01)和(158.76±19.67)pg/ml,较LPS组均明显升高(P0.05)。Accystatin+LPS组和Tscystatin+LPS组NO水平分别为(12.54±2.12)和(7.95±1.40)μmol/L,较LPS组的(20.18±3.99)μmol/L均明显降低(P0.05),且Tscystatin+LPS组NO水平低于Accystatin+LPS组(P0.05)。结论旋毛虫和广州管圆线虫的cystatin均可抑制小鼠腹腔渗出细胞NO释放、上调IL-10的水平,Accystatin明显促进TNF-α及IL-6的分泌,Tscystatin则明显抑制两种细胞因子的水平。     

应用载体介导小干扰RNA抑制小鼠巨噬细胞表达肿瘤坏死因子α

目的 研究特异性载体介导的小干扰RNA(siRNA)对小鼠巨噬细胞株表达肿瘤坏死因子(TNF)-α基因的抑制作用.方法 设计两段靶向TNF-α基因的特异性siRNA,合成相应寡核苷酸,插入载体H1启动子下游,构建表达干扰性发夹状RNA(shRNA)载体pHS-A和pHS-B,转染小鼠巨噬细胞株(RAW264.7),用实时荧光定量PCR和酶联免疫吸附法检测siRNA对TNF-α mRNA和蛋白表达的抑制作用.结果 内毒素脂多糖(LPS)刺激后6 h,巨噬细胞表达TNF-α mRNA和合成的TNF-α量均增加,于9～12 h达高峰.pHS-A转染后,LPS刺激巨噬细胞的TNF-α mRNA为0.003 56±0.001 87,TNF-α蛋白表达为(149.93±21.02)pg/ml,比未转染组[分别为0.021 34±0.009 60、(1922.30±149.05)pg/ml]显著减少(P＜0.01),抑制率达83.3%.pHS-B及阴性对照组对基因及蛋白表达均无影响.结论 LPS可刺激小鼠巨噬细胞合成TNF-α.pHS-A可抑制小鼠巨噬细胞TNF-α表达.     

胆汁内、外引流术对梗阻性黄疸大鼠血清肿瘤坏死因子和肝脏库普弗细胞诱导型一氧化氮合酶表达的影响

目的 研究胆汁内、外引流术对梗阻性黄疸大鼠血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平和肝脏库普弗细胞诱导型一氧化氮合酶(iNOS)表达的影响.方法 采用成年雄性Sprague-Dawley大鼠48只,分成梗阻性黄疸、胆汁外引流、内引流和假手术四组,每组12只.采用原位灌注消化肝脏及贴壁培养方法 分离并纯化库普弗细胞,采用逆转录(RT)-PCR方法 检测库普弗细胞iNOS mRNA表达.用ELlSA方法 测定血清TNF-α含量.结果 梗阻性黄疸组血清TNF-α水平为(110.8±26.3)pg/ml,与假手术组的(88.4±17.9)pg/ml比较,差异有统计学意义(P=0.045).内引流组解除胆道梗阻后,血清TNF-α水平受到抑制,为(89.84±28.3)pg/ml,而胆汁外引流组却无此作用,为(118.6±22.7)Pg/ml,后者与梗阻性黄疸组比较差异无统计学意义(P=0.059).胆道梗阻形成后,梗阻性黄疸组库普弗细胞iNOSmRNA表达增强(0.82±0.24),显著高于假手术组(0.38±0.35,P=0.005).胆汁内引流术解除黄疸后,内引流术组的库普弗细胞iNOS mRNA表达受到抑制(0.59±0.35),但与梗阻性黄疸组比较差异无统计学意义(P=0.139),外引流组iNOSmRNA表达并未受抑制(0.974±0.48),与梗阻性黄疸组比较差异无统计学意义(P=0.321),但显著高于胆汁内引流组(P=0.016).结论 胆汁内引流术在逆转梗阻性黄疸大鼠升高的血清TNF-α水平和肝脏库普弗细胞iNOS mRNA的表达方面优于胆汁外引流术.     

胆汁内外引流术对梗阻性黄疸大鼠肺肿瘤坏死因子α、中性粒细胞弹性蛋白酶的影响

目的研究胆汁内外引流方法对梗阻性黄疸大鼠肺肿瘤坏死因子α(TNF-α)、中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)水平的影响。方法将64只成年SD雄性大鼠随机分为4组,分别建立梗阻性黄疸(OJ)、胆汁内引流术(ID)、胆汁外引流术(ED)及假手术(SH)4组模型。于2次术后第14天留取肺组织匀浆液标本。采用双抗体夹心酶联免疫吸附法(ELISA)检测10%肺匀浆液TNF-α水平,生化法检测10%肺匀浆液NE水平。结果成功建立了大鼠梗阻性黄疸及内外引流术模型。梗阻性黄疸时大鼠肺TNF-α、NE水平较假手术对照组明显升高(100.893 pg/mL±21.271 pg/mL vs 64.091 pg/mL±13.034 pg/mL,P<0.01;50.396μg/mL±17.388μg/mL vs 39.718μg/mL±9.625μg/mL,P<0.05)。通过胆汁内引流术解除黄疸后,大鼠肺TNF-α浓度(75.141 pg/mL±15.849 pg/mL)与梗阻性黄疸组相比下降明显(P<0.01);而通过胆汁外引流术解除黄疸后,大鼠肺TNF-α浓度仍较高(112.129 pg/mL±36.886 pg/mL),与梗阻性黄疸组相比无差异(P>0.05)。行胆汁内、外引流术后,大鼠肺NE水平均降低(39.390μg/mL±12.410μg/mL、44.790μg/mL±16.681μg/mL),但与梗阻性黄疸组相比内引流明显(P<0.05)、外引流无差异(P>0.05),且内引流恢复至正常水平,与假手术对照组相比无差异(P>0.05)。结论梗阻性黄疸可导致肺组织炎症细胞因子升高,胆汁内引流术可明显改善梗阻性黄疸时肺组织炎症细胞因子水平、甚至接近正常,而胆汁外引流术没有改善肺炎症细胞因子水平,提示术前利用胆汁内引流术解除梗阻性黄疸缓解肺部炎症反应优于外引流术。