嗅鞘细胞联合神经干细胞脑内移植改善Parkinson病大鼠行为的观察

为了观察嗅鞘细胞(OECs)联合神经干细胞(NSCs)脑内移植对Parkinson病(PD)的治疗作用,首先将6-OHDA注射至左侧黑质致密部和腹侧被盖区制备PD大鼠。将成功制备的PD大鼠随机分为5组,即0.9%生理盐水对照组、单纯移植NSCs或OECs组、OECs+NSCs共移植组和PD模型对照组。将培养并传至第3代的NSCs、OECs和OECs+NSCs分别移植到PD大鼠的纹状体内,于移植后7、14、30、60d检测PD大鼠旋转行为变化后处死,取脑做冰冻切片,行BrdU、酪氨酸羟化酶(TH)、p75免疫荧光和TH免疫组织化学检测。移植后21d以内,各组大鼠的旋转行为无明显变化;30d和60d时,单纯移植NSCs或OECs组和OECs+NSCs共移植组与生理盐水和模型对照组相比,旋转行为有较明显的改善(P<0.05),其中OECs+NSCs共移植组的旋转行为改善更为显著。在移植后30d和60d,单纯移植NSCs或OECs组在移植区可见少数TH阳性神经元,而OECs+NSCs共移植组的TH阳性神经元明显多于单纯移植NSCs或OECs组(P<0.05)。上述结果表明:OECs能促进胚鼠中脑来源的NSCs向TH阳性神经元分化;单纯移植NSCs或OECs和OECs+NSCs共移植,均能不同程度地改善PD大鼠的旋转行为,但联合移植优于单纯移植。     

大鼠胚胎中脑腹侧细胞和大脑皮质神经干细胞移植治疗帕金森病大鼠的比较

体外培养的大鼠胚胎中脑腹侧(VM)细胞和大脑皮质神经干细胞(NSCs)分别移植入帕金森病(PD)模型大鼠毁损侧纹状体。移植后2,4,8周采用脑微透析术结合高效液相色谱(HPLC)动态监测毁损侧纹状体内多巴胺水平,同期观察大鼠的旋转行为。移植后8周采用免疫组化法检测植入细胞的存活及分化情况。结果显示:移植后4,8周VM移植组多巴胺水平明显高于NSCs移植组或对照组,同期VM移植组较其余两组旋转行为有显著改善,而NSCs移植组与对照组多巴胺水平及旋转行为无显著差异。VM移植组较NSCs移植组植入的细胞易存活和分化。以上结果提示,大鼠胚胎VM细胞移植治疗PD模型的疗效明显优于胚胎大脑皮质NSCs。     

核受体相关因子1基因转染神经干细胞移植治疗帕金森病

目的 探讨转染核受体相关因子1(Nurr1)基因的神经干细胞(NSCs)移植至帕金森病(PD)大鼠纹状体后向多巴胺能神经元的分化及对PD大鼠行为的影响.方法 应用脑立体定位技术构建单侧PD大鼠模型.将PD大鼠随机分为3组,每组8只.假手术组注射生理盐水,NSCs组移植未转染的NSCs,Nurr1组先将重组质粒载体pEGFP-N1-Nurr1转染NSCs,用RT-PCR方法及免疫荧光染色检测Nurr1基因的表达效果,然后用转染Nurr1 基因的NSCs进行移植.细胞用DIL标记后移植至PD大鼠右侧纹状体中,术后2周起用阿朴吗啡诱发旋转试验观测移植后大鼠行为改善情况,12周后用免疫荧光技术检测移植细胞中酪氨酸羟化酶(TH)的表达.结果 重组质粒转染后Nurr1基因能在NSCs中过表达.移植后假手术组和NSCs组PD大鼠的旋转圈数均无下降趋势,两者差异无统计学意义(P＞0.05);NSCs组移植区可见DIL阳性细胞,但TH免疫阳性细胞较少,平均每视野为(3.21±0.40)个;Nurr1组移植后PD大鼠的旋转圈数从第6周开始下降,移植区DIL/TH双标神经元每视野达(9.28±1.09)个.结论 Nurr1基因过表达能诱导NSCs在PD大鼠纹状体内分化为TH阳性的多巴胺能神经元,并在一定程度上改善大鼠的行为功能.     

大鼠胚脑皮质和中脑神经干细胞移植治疗PD模型鼠的比较研究

为比较大鼠胚胎大脑皮质和中脑神经干细胞(NSCs)移植入Parkinson病(PD)模型鼠后动物行为的改善和植入细胞分化为酪氨酸羟化酶(TH)阳性神经元的情况,本研究将大鼠胚胎大脑皮质和中脑NSCs在体外分离、扩增、BrdU标记后,添加或不加白细胞介素-1α(IL-1α)、白细胞介素-11(IL-11)、白血病抑制因子(LIF)和胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)等因子,分别移植入PD模型鼠病侧纹状体中。术后每隔2周进行动物旋转行为的检测,第12周时用免疫荧光双重标记方法检测BrdU和TH双标神经元。结果显示:中脑NSCs+因子移植组,动物的旋转行为得到明显改善;单纯中脑NSCs移植组次之;而单纯皮质NSCs移植组、皮质NSCs+因子移植组及生理盐水对照组动物的行为无明显改善。免疫荧光双重染色结果显示,中脑NSCs+因子组和单纯中脑NSCs组BrdU和TH双标神经元的数量明显多于其它组,而中脑NSCs+因子组又多于单纯中脑NSCs组。以上结果提示,大鼠胚胎中脑NSCs移植治疗PD模型的疗效明显优于胚胎皮质NSCs,IL-1α、IL-11、LIF和GDNF等因子能促进移植的中脑NSCs分化为TH阳性神经元。     

GDNF转基因成纤维细胞脑内移植治疗帕金森病大鼠模型

为了观察表达胶质细胞系源性神经营养因子 (GDNF)的基因工程细胞在脑内移植后对帕金森病大鼠的治疗作用 ,将 6-羟基多巴胺脑内定位单侧 (损伤侧 )注射制备大鼠帕金森病模型。随机将动物分为实验组 (2 0只 )和对照组 (15只 ) ,分别植入GDNF和 Lac Z转基因的原代培养大鼠成纤维细胞于损伤侧纹状体内 ,动态观察动物单侧旋转行为以及多巴胺及其代谢产物 3 ,4-二羟苯乙酸和高香草酸含量的变化。结果表明 :实验组帕金森病大鼠单侧旋转行为明显减少 ,为移植前旋转圈数的 (64 .8± 5 .8) % (P<0 .0 5 ) ;其纹状体内多巴胺含量显著提高 ,恢复至移植前水平的 (14 .5± 2 .2 ) % (P<0 .0 5 ) ,而对照组仅为 (1.92± 0 .15 ) % ;转基因细胞在脑内可存活 1年以上。本研究结果提示 GDNF基因治疗对大鼠帕金森病具有潜在的临床应用价值。     

神经干细胞移植对帕金森病样模型大鼠的治疗作用

目的 观察大鼠神经干细胞(NSC)植入帕金森病(PD)模型大鼠的脑纹状体后的存活、分化及功能状态.方法 体外分离培养NSC,单克隆培养,免疫细胞化学检测多向分化潜能和特异性标记nestin.建立PD大鼠模型,纹状体内植入DAPI标记的NSC,检测6-羟基多巴胺(6-HHDA)诱发的旋转行为,荧光检测标记细胞的分布情况,免疫细胞化学和高效液相色谱检测细胞分化和神经递质含量.结果 培养的NSC表达nestin,具有自我更新和多向分化能力;NSC植入PD模型大鼠纹状体后大鼠诱导旋转行为显著改善(P＜0.05);NSC在脑内迁移,并在纹状体内形成少量酪胺酸羟化酶(TH)阳性细胞、纤维;植入后纹状体内多巴胺(DA)及其代谢产物含量上升,2个月时分别增加3.6倍和2.8倍,4个月时增加3.4倍和2.4倍(P＜0.01).结论 神经干细胞在体外大量扩增后植入PD脑内能长期存活并分化、分泌神经递质,从而部分改善PD症状.     

损毁Parkinson病大鼠腹侧苍白球对纹状体内多巴胺的影响

应用6羟基多巴胺(6OHDA)制备Parkinson病(PD)大鼠模型,插入电极通过直流电毁损腹侧苍白球(VP),观察毁损术后PD大鼠旋转行为的变化,并应用高压液相色谱检测纹状体内多巴胺(DA)及3,4二羟甲基苯丙氨酸(DOPAC)和去甲肾上腺素(NA)的含量。结果显示:直流电毁损VP可使PD模型大鼠的旋转行为明显减少;毁损侧纹状体内DA的含量减少,DOPAC和NA的含量增加。上述结果提示VP毁损可明显改善PD大鼠的旋转行为,此效应可能与抑制VP的异常兴奋有关。     

鼠胚神经干细胞移植对帕金森模型大鼠的治疗作用

背景：干细胞移植是治疗帕金森的有潜力的方法之一。 目的：观察神经干细胞纹状体移植对帕金森模型大鼠旋转行为及脑内多巴胺含量的影响。 方法：采用6-羟基多巴胺定点注射毁损黑质纹状体的方法构建帕金森大鼠模型;向造模成功的大鼠纹状体内分别移植1×106(共计20 μL)的第3代胚鼠神经干细胞或等量生理盐水。 结果与结论：神经干细胞移植后,帕金森大鼠的旋转行为明显改善。干细胞移植后3周,免疫组化检测发现移植干细胞的帕金森大鼠脑黑质部位酪氨酸羟化酶阳性细胞数增多,纹状体内可见酪氨酸羟化酶阳性细胞;荧光显微镜下观察发现Hoechst 33324d标记神经干细胞在移植针道附近最为密集,并向远隔部位迁徙。干细胞移植后8周,高效液相色谱检测显示移植干细胞的帕金森大鼠纹状体内多巴胺含量明显增高(P < 0.01)。说明神经干细胞脑内移植能够减轻6-羟基多巴胺引起的大鼠中脑黑质多巴胺能神经元的损伤,改善大鼠的旋转行为。     

环孢菌素A结合神经干细胞移植对6-OHDA大鼠PD模型的作用

目的:观察环孢菌素A(cyclosporine A,CsA)结合神经干细胞(neural stem cells,NSCs)移植对于6-OHDA大鼠PD模型的作用。方法:SD大鼠随机分为四组:(1)正常组;(2)模型组;(3)NSCs组;(4)NSCs+CsA组。APO诱导旋转测试、悬挂实验、自发实验观察行为学改变,高效液相色谱(HPLC)检测纹状体多巴胺(dopamine,DA)含量。移植术后1、2、4周,ELISA检测纹状体TNF-α、IL-1β、IFN-γ、IL-4的含量,免疫组化观察移植部位细胞的变化。结果:与模型组相比,移植组大鼠的旋转次数减少(P0.05),悬挂评分提高(P0.05),自发总活动度增加(P0.05),纹状体DA含量升高(P0.05),且NSCs+CsA组优于NSCs组(P0.05)。移植组的TNF-α、IL-1β三个时间点均低于模型组,且NSCs+CsA组抑制TNF-α、IL-1β的作用强于NSCs组(P0.05);移植组的IL-4、IFN-γ三个时间点均高于模型组(P0.05),但NSCs+CsA组的IFN-γ低于NSCs组(P0.05)。细胞的存活增殖迁移状态在2周时较好,4周时较差。与NSCs组相比,NSCs+CsA组的迁移细胞形态瘦长,4周时EGFP活细胞较多(P0.05)。GFAP+细胞数:NSCs+CsA组NSCs组;小胶质细胞数:模型组NSCs组NSCs+CsA组。结论:NSCs移植可改善PD大鼠行为障碍,增加纹状体DA含量,有利于营造良好的脑内微环境,加用CsA可提高其疗效。     

胚胎嗅鞘细胞和中脑腹侧细胞移植对帕金森病SD大鼠纹状体神经元存活和分化的影响

目的观察胚胎嗅球嗅鞘细胞(OECs)和胚胎中脑腹侧细胞(VMCs)联合移植对帕金森病(PD)SD大鼠纹状体神经元存活及分化的影响。方法 12只PD模型SD大鼠随机平均分成两组:单独VMCs组(在脑立体定位仪下将VMCs植入PD大鼠模型毁损侧纹状体内)和联合移植组(在脑立体定位仪下将OECs和VMCs植入PD大鼠模型毁损侧纹状体内)。OECs来源于5～7d绿荧光鼠的嗅球嗅鞘,VMCs来源于孕13～14d绿荧光胎鼠中脑腹侧的脑组织。于移植后4、14周灌注取脑,切片后做酪氨酸羟化酶(TH)免疫组织化学染色,检测胚胎中脑腹侧细胞的存活及分化状况。结果移植4周后单独VMCs组及联合移植组纹状体区都可检测到TH免疫阳性神经元,数量无统计学差异(P0.05)。移植14周后联合移植组纹状体区TH免疫阳性神经元数量比单独VMCs组明显增多(P0.05)。结论胚胎中脑腹侧细胞联合嗅鞘细胞移植入帕金森病大鼠纹状体促使纹状体神经元分化为多巴胺能神经元。     

GDNF-pretreatment enhances the survival of neural stem cells following transplantation in a rat model of Parkinson's disease

Cell transplantation has been shown to be an effective therapy for central nervous system disorders in animal models. Improving the efficacy of cell transplantation depends critically on improving grafted cell survival. We investigated whether glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF)-pretreatment of neural stem cells (NSCs) enhanced grafted cell survival in a rat model of Parkinson's disease (PD). We first examined the neuroprotective effects of GDNF on oxygen-glucose deprivation (OGD) in NSCs. Cells were pretreated with GDNF for 3 days before subjecting them to OGD. After 12 h of OGD, GDNF-pretreated NSCs showed significant increases in survival rates compared with PBS-pretreated NSCs. An apoptosis assay showed that the number of apoptotic cells was significantly decreased in GDNF-pretreated NSCs at 1 h and 6 h after OGD. A PD rat model was then established by unilateral injection of 6-hydroxydopamine (6-OHDA, 9 μg) into the medial forebrain bundle. Two weeks after 6-OHDA injection, GDNF-pretreated NSCs, PBS-pretreated NSCs, or PBS were injected into PD rat striatum. The survival of grafted cells in the striatum was significantly increased in the GDNF-pretreated NSC group compared with the control groups. GDNF pretreatment increased survival of NSCs following transplantation, at least partly through suppression of cell apoptosis.     

NGF/GDNF基因修饰神经干细胞移植对AD模型鼠行为学的疗效

目的　观察NGF GDNF基因修饰神经干细胞 (NSC)单独和联合移植对AD模型鼠的学习记忆改善作用。　方法　单侧切断SD大鼠穹窿海马伞 (FF)制备AD模型鼠。术后 8～ 10d ,侧脑室移植基因修饰及未修饰的NSC。移植后 2周 ,进行Morris水迷宫行为学检测。　结果　NGF组和NGF GDNF组的后 3个时间段的平均逃避潜伏期较损伤组和NSC组明显缩短 (P <0 0 1) ;平台象限游泳距离百分比明显增高 (P <0 0 1) ;GDNF组的平台象限游泳距离百分比高于NSC组 (P <0 0 1) ,但平均逃避潜伏期与NSC组无明显差异。　结论　NGF GDNF基因修饰NSC单独和联合移植对AD模型鼠的行为学有不同程度的疗效 ,其中NGF组和NGF GDNF组疗效较好 ,但后者并未优于前者 ,GDNF组疗效较差     

NGF/GDNF基因修饰神经干细胞移植对AD模型鼠前脑胆碱能神经元的保护作用

目的　观察NGF GDNF基因修饰神经干细胞 (NSC)单独和联合移植对穹窿海马伞 (FF)切断后胆碱能神经元的保护作用。　方法　将两种基因修饰的NSC单独和联合移植入FF切断的大鼠侧脑室。移植后 3周取脑行ChAT免疫组织化学染色 ,用Student NewmanKaels方法对内侧隔核 (MS)和斜角带垂直支 (VDB)的ChAT阳性细胞数 (损伤侧与正常侧的百分比 )进行计数分析。　结果　NGF组伤侧MS的ChAT阳性神经元数为 81% ,明显高于损伤组 (34% )、NSC组 (36 % )和GDNF组 (5 0 % ) ,P <0 0 1;NGF GDNF组为 6 8% ,明显高于损伤组和NSC组 (P <0 0 1) ,亦高于GDNF组 (P <0 0 5 ) ;GDNF组与损伤组和NSC组相比 ,有统计学意义 (P <0 0 5 )。NGF组和NGF GD NF组伤侧VDB的ChAT阳性神经元数分别为 80 %和 72 % ,明显高于损伤组 (5 6 % )和NSC组 (5 2 % ) ,P <0 0 1,亦高于GDNF组 (5 9% ) ,P <0 0 5 ;GDNF组与损害组和NSC组相比无明显差异 (P >0 0 5 )。　结论　NGF GDNF基因修饰NSC单独和联合移植均能不同程度地保护损伤的ChAT阳性神经元 ,NGF组和NGF GDNF组作用较大 ,GDNF组作用较小。     

微囊化牛视网膜色素上皮细胞移植治疗帕金森大鼠的研究

目的： 观察微囊化牛视网膜色素上皮细胞（RPE）移植治疗帕金森病（PD）大鼠的疗效。方法： 酶消化法原代培养牛RPE细胞，纯化、传代后用高压静电微胶囊成型装置制作海藻酸钠-多聚赖氨酸微囊化细胞，将其立体定向移植入6-OHDA大鼠PD模型的右侧纹状体，移植分为NS组、RPE组、空微囊组（APA组）和微囊化RPE组（RPE-APA组）。观察移植后：阿朴吗啡诱导的旋转行为变化、移植侧纹状体中多巴胺和高香草酸含量的变化、移植区HE染色及TH免疫组化染色。结果： RPE-APA组阿朴吗啡诱发的旋转次数在移植后第2周开始减少，减少幅度为39.29％（与APA组相比，P<0.05），至第4周减少更加明显，减少幅度为：56.89％（与第2周相比，P<0.05），改善现象一直持续到第14周。行为学出现改善的大鼠纹状体多巴胺和高香草酸含量的增加同其阿朴吗啡诱发的旋转次数的减少相符合。行为学有改善的大鼠囊内细胞TH染色呈弱阳性，微囊周边的纹状体可见TH阳性纤维密度较APA组高。结论： 微囊化牛RPE细胞对6-OHDA大鼠PD模型有治疗作用，是一种前景良好的新型供体。     

GDNF基因修饰的NSCs移植对暂时性缺血性脑卒中大鼠的神经保护作用研究

目的　探讨移植胶质细胞源性神经营养因子（glial cell line derived neurotrophic factor,GDNF）基因修饰的神经干细胞（neural stem cells,NSCs）对暂时性缺血性脑卒中大鼠的神经保护。 方法　用GDNF重组腺病毒载体转染新生大鼠NSCs（GDNF/NSCs）,分化培养7 d后,行免疫细胞化学染色检测微管相关蛋白2（MAP2）。采用改良的插线法制作暂时性脑缺血再灌注模型,3 d后经脑室分别移植生理盐水、NSCs和GDNF/NSCs。于再灌注后1、2、3、5、7周末处死大鼠,行免疫组织化学染色观察移植细胞在脑内的神经元分化及星形胶质细胞在缺血区形成胶质界膜情况,行Luxol fast blue（LFB）染色显示神经纤维损伤情况。 结果　GDNF/NSCs体外分化为MAP2+细胞的比例显著高于NSCs的分化。移植细胞在脑内分化为MAP2+细胞,于再灌注第5周分化达高峰,GDNF/NSCs组于再灌注第3~7周,其MAP2+细胞显著高于NSCs组。各组缺血区由星形胶质细胞形成的血管胶质界膜存在不同程度的破坏,其连续性中断。对照组在各个时间点,血管胶质界膜损伤严重,完整性差,两细胞移植组,其胶质界膜随时间延长逐渐完整,GDNF/NSCs组早于NSCs组完善对胶质界膜的修复。此外,GDNF/NSCs组的神经纤维损伤修复优于NSCs组。 结论　GDNF/NSCs比NSCs对暂时性缺血性脑卒中大鼠模型有更好的神经保护作用,可能是与GDNF提高了NSCs在脑内的神经元分化,增强了NSCs对胶质界膜及神经纤维修复有关。     

过表达Nurr1基因的骨髓间充质干细胞的诱导及移植治疗帕金森病的研究

目的:探讨Nurr1基因修饰大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymalstemcells,rMSCs)脑内移植对帕金森病(parkinsondiseasePD)大鼠的治疗作用。方法:用脂质体转染法转染PcDNA3.1(+)-Nurr1入rMSCs并稳定表达.然后移植大鼠PD模型纹状体内;观察行为学变化并用免疫组化、RT-PCR等方法检测移植细胞的Nurr1、DAT和TH表达;利用高效液相色谱检测多巴胺(DA)、二羟苯乙酸(DOPAC)和高香草酸(HVA)含量。结果:Nurr1-rMSCs组和rMSCs组移植治疗8周内PD大鼠旋转行为均得到一定的改善(P<0.05);移植后2～4周Nurr1-rMSCs组较rMSCs组改善程度更为显著(P<0.05),但第8周时二组行为学差异无统计学意义(P>0.05)。免疫组化显示Nurr1-rMSCs能够稳定表达Nurr1且少量细胞表达DAT,但未发现TH阳性细胞。而rMSCs组和对照组则均未发现有Nurr1、DAT、TH表达;RT-PCR检测显示移植后2～8周,Nurr1-rMSCs组移植区有Nurr1和DATmRNA表达,但未发现THmRNA表达;两治疗组DA、DOPAC和HVA含量均较对照组增高(P<0.05)。结论:Nurr1基因转染大鼠骨髓间充质干细胞移植大鼠纹状体可以在一定时期内存活并有效表达,同时可提高纹状体DA含量,改善模型鼠症状,为治疗PD的研究提供了实验依据。