许旺细胞移植促进大鼠脑胆碱能纤维损伤后的修复

目的:脑损伤大鼠于脑隔-海马通路植入许旺细胞,观察许旺细胞的存活状况和损伤区乙酰胆碱酯酶能纤维的再生,分析许旺细胞与中枢神经系统轴突再生的相关性。方法:实验于2002-05/2003-05在北京解放军总医院完成。①选取成年雄性Sprague-Dawley大鼠64只,随机数字表法分为许旺细胞移植组、模型对照组,32只/组。另取SD乳鼠30只作为许旺细胞的标本来源。②两组大鼠均建立脑隔-海马胆碱能纤维损伤模型。造模后许旺细胞移植组立即注射体外培养2～3代的许旺细胞悬液,注射部位为中线旁1.8mm,前囟后1.8mm和中线旁1.8mm,前囟后2.0mm两点,5μL/点。模型对照组仅注入RPMI1640培养液。③两组分别于许旺细胞植入后1,2,4,6周各处死8只大鼠,取脑组织制备石蜡切片。免疫荧光组织化学染色检测移植后许旺细胞低亲和力神经生长因子受体的表达情况;乙酰胆碱酯酶纤维染色检测损伤区乙酰胆碱酯酶能神经纤维再生情况;移植后第4周,采用网格测试系统对距损伤区分别为0.5mm,1.5mm,2.5mm层面(即海马的前、中、后部区域)乙酰胆碱酯酶纤维密度进行定量分析。结果:实验选取64只大鼠均进入结果分析。①移植后许旺细胞表达低亲和力神经生长因子受体的情况:许旺细胞移植组在移植后2周表达低亲和力神经生长因子受体,第4周达到高峰,6周时略有下降;而模型对照组未出现表达低亲和力神经生长因子受体的许旺细胞。②移植后脑损伤区乙酰胆碱酯酶能神经纤维再生情况:许旺细胞移植组于移植后第2周在损伤后的皮层下隔区内即可见再生的乙酰胆碱酯酶能神经纤维,主要分布在损伤后的皮层下隔区,呈束样向海马内延伸。模型对照组无明显乙酰胆碱酯酶纤维再生。③移植后第4周脑损伤区海马内不同层面乙酰胆碱酯酶纤维密度定量分析结果:许旺细胞移植组大鼠脑海马CA3区在0.5mm,1.5mm,2.5mm各层面的乙酰胆碱酯酶纤维密度均明显高于模型对照组(t=8.012,P<0.05)。结论:植入脑隔-海马通路后的许旺细胞可在受体内存活并表达低亲和力神经生长因子受体,促进损伤后乙酰胆碱酯酶能神经纤维的再生。     

聚四氟乙烯膜管内植入许旺细胞与神经生长因子桥接面神经的比较

背景：在周围神经修复领域中,神经营养与趋化理论得到普遍关注,随之各种神经再生室及许旺细胞营养因子应用的实验增多,但尚缺乏深入系统的报道。目的：以聚四氟乙烯膜管作为神经再生室,观察分别植入许旺细胞与神经生长因子后对桥接面神经缺损的修复效果。设计、时间及地点：随机对照动物实验,于2008-01在山东大学动物实验中心完成。材料：新西兰纯种白兔24只,随机分为许旺细胞组、神经生长因子组、模型对照组,8只/组。聚四氟乙烯膜由上海塑料研究所制备,厚度0.15mm,微孔径10～30μm。神经生长因子为烟台北方制药有限公司产品。方法：3组兔显露右侧面神经颊支,切除8mm建立面神经缺损模型。将造模时切下的神经段于镜下剥除外膜,胰蛋白酶与胶原蛋白酶联合消化,L-多聚赖氨酸纯化后获得纯度较高且具有活性的许旺细胞悬液。将聚四氟乙烯膜管套缝固定于各组缺损区神经的两断端上,使神经缺损两断端在管内相距10mm,许旺细胞组吸取自体许旺细胞悬液注入膜管内,组织黏接剂封闭膜管两端口;神经生长因子组吸取神经生长因子注入膜管内;膜管对照组不进行任何干预。主要观察指标：采用四导生理记录仪检查修复后面神经传导速度,苏木精-伊红染色观察神经纤维再生程度。结果：细胞修复后6,12周,许旺细胞组面神经传导速度〉神经生长因子组〉膜管对照组（F=72.319,F=106.134,P均〈0.01）。细胞修复后12周,许旺细胞组神经干粗而直,走向顺畅,可见于再生室膜的微孔结构中,许旺细胞包绕神经纤维;神经生长因子组新生神经纤维较少,可见发育成熟的许旺细胞增多;单纯膜管组再生室内神经纤维较少。结论：许旺细胞或神经生长因子植入聚四氟乙烯膜管内均可促进面神经恢复,但前者修复效果明显优于后者。     

许旺细胞-海藻酸钠凝胶移植修复大鼠脊髓损伤

目的:观察许旺细胞-海藻酸钠凝胶移植对大鼠脊髓损伤后细胞凋亡、Bcl-2表达及下肢运动功能恢复的影响.方法:清洁级SD大鼠随机分为4组:正常对照组、单纯损伤组、许旺细胞组、许旺细胞海藻酸钠凝胶组.后3组制作脊髓全横断损伤模型.正常对照组、单纯损伤组不进行移植处理,许旺细胞组植入吸附许旺细胞悬液的明胶海绵块、许旺细胞-海藻酸钠凝胶组植入许旺细胞-海藻酸钠凝胶.分别于12 h,1,3,7,21 d对动物进行BBB评分后处死,取损伤区脊髓节段制成石蜡切片进行TUNEL、Bcl-2染色,观察脊髓内凋亡细胞、Bcl-2细胞的数量及分布变化.结果:正常对照组仅有少量淡染Bcl-2阳性细胞;单纯损伤组神经元Bcl-2免疫反应阳性细胞表达的高峰在第3天,14 d时Bcl-2免疫反应阳性细胞表达接近正常水平.许旺细胞-海藻酸钠凝胶移植后损伤脊髓细胞Bcl-2免疫反应阳性细胞表达具有显著增高(P＜0.05),7 d高度表达并持续2周以上.单纯损伤组脊髓内细胞凋亡最多,并于损伤后1,7 d形成两个高峰,多分布于白质中.许旺细胞-海藻酸钠凝胶组BBB评分较单纯损伤组及许旺细胞组明显提高(P＜0.05).结论:许旺细胞-海藻酸钠凝胶移植能抑制大鼠脊髓损伤后脊髓细胞凋亡、促进Bcl-2的表达,提高了脊髓运动功能的恢复,但未达到正常水平.     

延迟植入嗅鞘细胞修复成鼠的胸髓损伤

背景:脊髓损伤后在一定的微环境中有再生的能力。嗅鞘细胞兼具星形胶质细胞和许旺细胞的特性,具有促进脊髓轴突再生的能力。目的:制作成鼠胸髓损伤模型,观察嗅鞘细胞对损伤脊髓轴突再生的作用。设计:观察性实验。单位:中山大学附属第二医院。材料:实验于2001-01/2002-11在中山大学附属第二医院完成。20只成年SD雄性大鼠,体质量(380±20)g,由中山大学实验动物中心提供(机构许可证号:SYXK(粤)2004-0020)。低糖的DMEM培养液(L-DMEM,GibcoBRL公司)、胎牛血清(Hyclone公司)、MBP(髓磷脂碱性蛋白,Sigma公司)、抗神经生长因子受体抗体(Sigma公司)。应用随机数字表完全随机化分为细胞移植组和对照组,每组10只。方法:将成年SD大鼠麻醉断颈处死,无菌条件下取出完整嗅球分嗅神经。采用改良Allen法打击脊髓建立胸髓损伤模型。细胞移植组于损伤脊髓处注入10μL嗅鞘细胞悬液(2.5×1010L-1),对照组仅注入相同剂量DMEM/F12(1∶1)培养液。移植后6周通过组织学和免疫组织化学方法观察嗅鞘细胞对脊髓轴突再生的影响。主要观察指标:①抗神经生长因子受体抗体染色鉴定嗅鞘细胞。②髓磷脂碱性蛋白染色观察髓鞘的修复。③嗜银染色观察神经轴突再生。结果:细胞移植组有2只动物死亡,对照组有3只死亡,共15只大鼠进入结果分析。①细胞移植组可见损伤脊膜完整,较正常脊髓稍变细。苏木精-伊红染色见损伤区有多极细胞,且与脊髓组织有移行过度现象,说明存活的嗅鞘细胞与宿主融合良好。新生的轴突多呈束状,周围有小圆淋巴细胞浸润。嗜银染色可见再生轴突长入损伤区组织中,多与束状排列的多极细胞伴行;对照组脊髓损伤处明显变细,脊膜尚完整。苏木精-伊红染色见脊髓损伤区未见新生轴突。嗜银染色未见再生轴突。②细胞移植组可见多极细胞,多呈束状排列,胞浆内有大量抗神经生长因子受体抗体阳性颗粒存在,进一步证明嗅鞘细胞移植6周后仍然存活,且与宿主融合良好。髓磷脂碱性蛋白染色见损伤区有呈线状髓磷脂碱性蛋白阳性纤维,提示损伤区两端均有髓鞘样物质产生,且互相靠拢。同时多极细胞中也发现有髓磷脂碱性蛋白阳性物质存在,说明移植的嗅鞘细胞有产生髓鞘样物质的作用。对照组未见轴突再生。结论:嗅鞘细胞延迟植入成鼠打击伤后脊髓后,可存活并产生髓鞘样物质,促进宿主脊髓轴突再生。     

许旺细胞联合C5a受体拮抗剂移植脊髓损伤大鼠的电生理及后肢功能变化

背景:C5a通过增强脊髓损伤后早期炎症反应参与了脊髓损伤后的继发性损伤,C5a受体拮抗剂能有效阻断这一过程.目的:观察许旺细胞移植联合C5a受体拮抗剂对脊髓损伤大鼠神经功能恢复的影响.方法:Wistar大鼠80只建立脊髓损伤动物模型后随机分成4组.①空白对照组尾静脉注射培养液组+腹腔注射生理盐水.②细胞移植组尾静脉注射许旺细胞.③C5a受体拮抗剂组腹腔注入C5a受体拮抗剂.④联合组尾静脉注射许旺细胞,同时腹腔注入C5a受体拮抗剂.结果与结论:下肢运动功能评价联合移植组优于细胞移植组和C5a受体拮抗剂组,细胞移植组和C5a受体拮抗剂组优于对照组.细胞移植组和联合组有SRY基因表达.HRP阳性神经纤维数:联合组>胞移植组与C5a受体拮抗剂组>空白对照组,且各组之间差异有显著性意义(P < 0.01).联合组大鼠体感诱发电位及运动诱发电位的潜伏期、波幅明显优于其他3组(P < 0.05或P < 0.01).提示许旺细胞移植和C5a受体拮抗剂联合应用可促进脊髓损伤大鼠神经突触的再生,改善其肢体运动功能和电生理功能.     

蛛网膜下腔移植自体激活许旺细胞治疗大鼠脊髓损伤

背景:许旺细胞能够分泌多种神经营养因子,促进脊髓损伤功能的恢复.但异体许旺细胞移植可引发自身免疫反应,且在移植方式上,局部移植无法避免二次损伤,静脉移植虽可以透过血脊髓屏障到达损伤局部,但不能达到有效的治疗浓度.目的:探讨经蛛网膜下腔移植自体激活许旺细胞对脊髓损伤大鼠功能恢复的影响.方法:66只大鼠均建立脊髓损伤模型,造模后随机分为3组,自体激活许旺细胞组通过结扎单侧隐神经从而激活许旺细胞,自体未激活许旺细胞组、模型对照组仅在相同部位手术但不结扎神经.切除各组手术远端1 cm神经,采用组织块法进行许旺细胞的体外分离培养及纯化.1周后,自体激活许旺细胞组、自体未激活许旺细胞组分别通过蛛网膜下腔注入经Hoechst33342标记的对应许旺细胞悬液,模型对照组仅注入等量DMEM.对脊髓损伤后肢体功能的恢复进行BBB运动功能评分及脚印分析,通过苏木精-伊红染色和GFAP染色从组织学角度评价脊髓损伤恢复情况.结果与结论:从术后第4周开始,自体激活许旺细胞组BBB后肢功能评分明显优于另两组(P＜0.05).移植后2周,可见迁移至大鼠脊髓损伤局部的许旺细胞.与自体未激活许旺细胞组比较,移植后5周自体激活许旺细胞组的前后足中心距离、后肢第3足趾外旋角度均显著减小(P＜0.05),移植后13周损伤区胶质瘢痕面积明显减小(P＜0.05),损伤区空洞面积明显减小(P＜0.05).证实经蛛网膜下腔移植自体激活许旺细胞可以促进脊髓损伤的恢复.     

大鼠自体嗅黏膜移植修复胸髓损伤:形态学和行为学的验证

目的:采用自体嗅黏膜作为组织供体修复脊髓损伤,从形态学和行为学角度验证嗅成鞘细胞移植治疗脊髓损伤的作用及效果,为应用自体嗅成鞘细胞移植治疗临床脊髓损伤提供实验依据。方法:实验于2002-06/2004-10在北京大学基础医学院解剖学与组织胚胎学系中枢神经发育与再生研究室完成。选取清洁级6周龄雄性SD大鼠18只,随机分为自体嗅黏膜移植组10只,冻融对照组8只。两组均建立脊髓损伤模型,自体嗅黏膜移植组取位于鼻中隔后上部的嗅黏膜移植于脊髓损伤处,冻融对照组将自体嗅黏膜冷冻于-20℃冰箱5min,取出后室温放置5min解冻,重复5次后将冻融自体嗅黏膜移植于脊髓损伤处。术后6周于脊髓损伤节段上下各5mm处取材,片厚20μm。然后两组分别以神经丝蛋白和神经生长因子受体蛋白免疫荧光双标染色、激光共聚焦显微镜检测移植效果。免疫组织化学染色观察移植嗅黏膜与周围组织的生长情况。通过BBB行为学评分对两组动物后肢恢复功能进行评估。结果:实验选取SD大鼠18只,全部进入结果分析。①免疫组织化学摄片观察移植细胞在脊髓组织中再生情况:自体嗅黏膜移植组有部分空洞形成,但有部分神经纤维穿过移植区,可见神经生长因子受体蛋白免疫反应阳性的嗅成鞘细胞呈束状排列。冻融对照组无再生纤维通过且形成较大空洞,神经生长因子受体蛋白p75免疫组化反应阴性。②两组大鼠的神经丝蛋白和神经生长因子受体蛋白免疫荧光双标染色结果:自体嗅黏膜移植组免疫荧光标记纤维中夹有神经生长因子受体蛋白p75标记的存活的嗅成鞘细胞,细胞随标记的神经丝蛋白纤维走行方向排列,与宿主组织愈合良好。冻融对照组未见神经生长因子受体蛋白p75标记的嗅成鞘细胞以及神经丝蛋白标记的再生纤维,且形成较大空洞。③两组大鼠手术前后行为学评分结果:与冻融对照组比较,术后2,3,4,5,6周自体嗅黏膜移植组BBB行为学评分显著升高[(3.8±0.7),(5.6±1.4);(4.1±0.6),(9.7±1.3);(4.6±1.7),(12.5±1.2);(5.8±0.9),(13.5±0.9);(6.3±0.9),(13.8±0.9)分;P<0.05或0.01]。结论:嗅黏膜移植以及其中的嗅成鞘细胞对大鼠脊髓损伤修复具有明显的促进作用,并可恢复损伤神经的部分功能。同时自体嗅黏膜移植还有助于脊髓损伤部位神经纤维的再生。     

许旺细胞修复大鼠脊髓损伤:静脉移植的可行性及优势

背景:目前细胞移植是修复脊髓损伤的研究热点之一,许旺细胞能够分泌多种神经营养因子,改善损伤局部微环境,大量相关文献证实了其能够促进脊髓损伤后功能的恢复.针对治疗脊髓损伤的细胞移植方法很多,其中静脉移植具有操作方便、能够避免传统移植方法造成的附加损伤等优点.目的:探讨许旺细胞尾静脉移植修复大鼠脊髓损伤的疗效.方法:体外分离Wistar大鼠双侧坐骨神经,植块法培养,S-100染色鉴定,Hoechst33342标记许旺细胞.Impactor model-Ⅱ打击仪制作 Wistar大鼠T10脊髓损伤模犁60只,随机分为3组,空白对照组术后未作处理,DMEM对照组、许旺细胞移植组术后1周分别尾静脉注射1 mL.DMEM或1 mL.许旺细胞.术前1 d,术后1,3 d,1周及以后每周进行BBB评分.移植后1,2,4周取材行冰冻切片观察移植许旺细胞的迁移.移植后8周取材行苏木精-伊红染色及免疫荧光染色观察损伤段胶质原纤维酸性蛋白、神经元特异性烯醇化酶的表达.结果与结论:经纯化鉴定获得纯度为95%的许旺细胞.移植后1,2,4周损伤段及邻近节段脊髓内可观察到Hoechst33342阳性细胞.术后4周,许旺细胞移植组与空白对照组、DMEM对照组BBB评分差异开始有显著性意义(P<0.05),且许旺细胞移植组高于空白对照组、DMEM对照组.苏木精-伊红染色示各组均有脊髓空洞形成,许旺细胞移植组空洞小于空白对照组、DMEM对照组.免疫组织化学染色示空白对照组、DMEM对照组胶质原纤维酸性蛋白反应较强,许旺细胞移植组胶质原纤维酸性蛋白阳性面积小于其他组(P<0.05);许旺细胞移植组神经元特异性烯醇化酶的阳性面积明显大于其他组(P<0.05).提示静脉移植许旺细胞修复大鼠脊髓损伤是可行的,操作简便,且有较好的疗效.     

许旺细胞联合C5a受体拮抗剂移植脊髓损伤大鼠的电生理及后肢功能变化

背景：C5a通过增强脊髓损伤后早期炎症反应参与了脊髓损伤后的继发性损伤,C5a受体拮抗剂能有效阻断这一过程。目的：观察许旺细胞移植联合C5a受体拮抗剂对脊髓损伤大鼠神经功能恢复的影响。方法：Wistar大鼠80只建立脊髓损伤动物模型后随机分成4组。①空白对照组尾静脉注射培养液组＋腹腔注射生理盐水。②细胞移植组尾静脉注射许旺细胞。③C5a受体拮抗剂组腹腔注入C5a受体拮抗剂。④联合组尾静脉注射许旺细胞,同时腹腔注入C5a受体拮抗剂。结果与结论：下肢运动功能评价联合移植组优于细胞移植组和C5a受体拮抗剂组,细胞移植组和C5a受体拮抗剂组优于对照组。细胞移植组和联合组有SRY基因表达。HRP阳性神经纤维数：联合组〉胞移植组与C5a受体拮抗剂组〉空白对照组,且各组之间差异有显著性意义（P〈0.01）。联合组大鼠体感诱发电位及运动诱发电位的潜伏期、波幅明显优于其他3组（P〈0.05或P〈0.01）。提示许旺细胞移植和C5a受体拮抗剂联合应用可促进脊髓损伤大鼠神经突触的再生,改善其肢体运动功能和电生理功能。     

微囊化兔许旺细胞移植脊髓损伤大鼠:碱性成纤维细胞生长因子表达和后肢运动功能的变化

背景:研究表明微囊化兔许旺细胞移植于大鼠损伤脊髓后,能减轻炎症反应,促进脊髓再生,但具体作用途径尚不完全清楚.目的:观察微囊化兔许旺细胞移植于损伤大鼠脊髓后,碱性成纤维细胞生长因子的表达以及后肢运动功能的恢复.方法:取家兔坐骨神经以双酶消化法制成许旺细胞悬液后,再用气体喷入法制成海藻酸钡-许旺细胞微囊.同法制备不包被许旺细胞的空囊.SD大鼠随机分为4组:细胞组、空囊组、微囊组建立脊髓半横断损伤模型,分别于损伤处植入明胶海绵吸附的10 μL许旺细胞悬液、10 μL空囊、10 μL海藻酸钡-许旺细胞微囊;正常组不做任何干预.采用BBB评分观察大鼠后肢运动功能恢复情况,制作脊髓标本切片通过苏木精-伊红染色和尼氏染色行病理学检查,免疫组织化学染色观察碱性成纤维细胞生长因子的表达变化.结果与结论:造模后即刻大鼠右后肢出现瘫痪;材料移植后7,14,28 d,微囊组大鼠后肢运动功能明显恢复,BBB评分明显优于细胞组、空囊组(P<0.05或P<0.01).碱性成纤维细胞生长因子阳性细胞主要见于神经元细胞的胞浆及胶质细胞的胞核内.材料移植后第1,3,7天,胶质细胞主要在脊髓损伤附近处表达,其中第3天表达量最大;第14天在神经元细胞的胞浆内可见碱性成纤维细胞生长因子表达,微囊组表达程度明显高于细胞组、空囊组;之后各组表达程度均明显下降.提示微囊化兔许旺细胞移植于损伤大鼠脊髓后,可以抑制异种移植后免疫排斥,减轻炎症反应,增加碱性成纤维细胞生长因子表达,促进后肢功能恢复和脊髓再生.