人胆囊上皮细胞炎症的PPAR-γ配体调控

目的 :探索内皮细胞生长因子对胆囊上皮细胞培养的影响及噻格列酮对人胆囊上皮细胞炎症的调控 .方法 :培养基中添加内皮细胞生长因子进行细胞培养 ,将培养成功的胆囊上皮细胞分为对照组A1 ,A2 和试验组B1 ,B2 ,B3 ,B4,试验组及对照组A2 以促炎因子HIL β(人白细胞介素 1 β)制作胆囊上皮细胞炎症 ,各组IL 6值进行统计学分析 ,比较PPAR γ配体噻格列酮对试验组IL 6值的影响 .结果 :内皮细胞生长因子明显促进胆囊上皮细胞生长、延长体外存活时间 .试验组IL 6较对照组明显低 ,差别最大达 1 79.85pn·L-1 (P <0 .0 1 ) .结论 :内皮细胞生长因子有明显的促胆囊上皮细胞生长作用 ,PPAR γ配体噻格列酮能抑制胆囊上皮细胞炎症 ,可能成为治疗急慢性胆囊炎的有效选择     

PPAR-γ配体对人胆囊上皮细胞炎症的调控

目的　探讨过氧化物酶体增殖物激活受体 (PPAR- γ)的配体——噻格列酮对人胆囊上皮细胞炎症的调控。方法　分离培养胆囊上皮细胞 ,建立胆囊上皮细胞炎症模型 ,检测对照组和噻格列酮组培养液中 IL- 6、TNF-α值及细胞形态学变化。结果　成功分离培养胆囊上皮细胞并建立胆囊上皮细胞炎症模型 ,细胞最长可存活 2 5 d。炎症对照组细胞肿胀、胞膜不清 ,胞浆混浊 ,添加噻格列酮后 ,细胞炎性水肿有不同程度减轻 ,以 5 0 μmol/ m l组最明显。噻格列酮组 IL- 6值明显低于对照组 (P<0 .0 1) ,差别最大达 179.85 pg/ m l,抑制效应与浓度呈正相关关系。结论　噻格列酮能抑制胆囊上皮细胞炎症 ,有可能成为治疗急慢性胆囊炎的有效选择     

人胆囊类器官培养体系的建立与鉴定

目的 构建人胆囊类器官的培养体系,实现人胆囊类器官体外稳定快速扩增,并鉴定其特性。方法 分离人来源胆囊组织上皮细胞,运用三维培养体系将细胞嵌入基质胶中进行3D培养。观察胆囊类器官生长过程中球囊样结构的面积、周长与形态,计算形状因子。利用细胞免疫荧光染色技术检测胆囊类器官的干性标志物CD133、富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体5(LGR5)以及胆管上皮细胞标志物肝细胞核因子1β(HNF1β)、上皮细胞黏附分子（Ep CAM）、细胞角蛋白7、细胞角蛋白19、性别决定区Y框9(SOX9)的表达情况。使用5-溴脱氧尿嘧啶核苷（Brd U）摄入实验检测小分子CHIR-99021和blebbistatin对类器官增殖特性的影响。结果 胆囊类器官在体外培养过程中,类器官形成的球囊面积逐渐增大,第7天的类器官面积与第1天比较差异有统计学意义（P<0.01）,第7天时其形状因子从第1天的0.80(0.75,0.84)增高至0.83(0.81,0.85)(P<0.01),表明类器官在体外稳定生长且形状逐渐趋于一个完美的圆。免疫荧光染色可见类器官表达胆管上皮细胞标志物。在培养基中加入小分子CH...     

内皮细胞生长因子对人胆囊上皮细胞培养的影响

目的 :探索内皮细胞生长因子 (EGF)对人胆囊上皮(HGBEC)细胞体外培养的影响 .方法 :培养基中添加EGF进行细胞培养 ,与培养基中未添加EGF组进行比较 .结果 :添加EGF组胆囊上皮细胞数目 (平均 4 .6× 1 0 7个 /孔 )较未添加组 (2 .6× 1 0 7个 /孔 )增多 (P <0 .0 5 ) ,存活时间明显延长 (从 8.3d增加到 1 8.6d) (P <0 .0 5 ) ,第 6～ 7日细胞数达最高值 ,可维持 1 0～ 1 2d ,细胞最长可存活 2 5d.结论 :培养基中添加EGF可明显延长胆囊上皮细胞体外培养的存活时间     

人胆囊上皮细胞的分离、培养及鉴定

目的　探索人胆囊上皮细胞的较佳分离方法和合适的生长条件 ,为研究胆囊的生理功能和相关疾病打下基础。方法采用IV型胶原酶及钝性擦刮法分离细胞 ,IV型胶原包被培养皿 ,DMEM/HamF12培养基联合培养。结果　每个胆囊可分离得到( 5～ 10 )× 10 7个胆囊上皮细胞 ,接种 1周内生长旺盛 ,第 3、4天达到峰值 ,呈现扁平多角形成片贴壁状态。结论　IV型胶原酶消化法可成功分离人胆囊上皮细胞 ,DMEM/HamF12培养基可提供较为满意的生长条件。     

人正常上皮细胞的原代培养

传统的人正常上皮细胞原代培养方法存在培养率低、培养出的细胞活性差、操作繁琐等缺点,为了解决 这些问题,近年来国内外的众多研究者对人正常上皮细胞的原代培养过程进行了大量研究和不断改进。笔者主要综 述人正常上皮细胞分离纯化的一些方法(如组织块分离法、酶消化分离法 、机械刷取法、红细胞裂解法、Percoll分层 液密度梯度分离法等)以及培养传代中可应用到的一些方法(如无血清培养基联合低浓度血清培养基培养法、鼠尾胶 原包被法、玻璃培养瓶联合塑料培养皿培养法);其次阐述了人正常上皮细胞的生物学特性及免疫细胞化学染色法、 台盼蓝拒染法等生物学性状检测的方法,并且对培养中无菌操作、培养时和分离时细胞外环境的条件、差速贴壁的 次数、添加剂的选择与用量等影响因素作了归纳。     

大肠杆菌脂多糖诱导人乳牙牙周膜干细胞炎症模型的建立

目的 体外培养人乳牙牙周膜干细胞,建立符合实验设计需要的人乳牙根尖周炎细胞模型.方法 采用酶解组织块法培养人乳牙牙周膜干细胞,连续梯度稀释法进行纯化,流式法鉴定细胞表面标记物,检测其多向诱导分化能力.在培养基中加入不同终浓度(0.1,0.075,0.05,0.025,0.01μg/ml)的大肠杆菌脂多糖,通过检测细胞活...     

人羊膜上皮细胞的分离、培养及鉴定

目的建立人羊膜上皮细胞分离、培养及鉴定方法。方法从足月分娩人胎盘剥离羊膜,采用胰蛋白酶消化法分离人羊膜上皮细胞（hAECs）,采用免疫细胞化学、免疫荧光染色及流式细胞术分析其表型特征,使用含表皮生长因子LG—DMEM培养基培养。结果采用低速旋转胰蛋白酶消化法从羊膜分离的hAECs数为（6．13±1．42）×10^7,份（n=12）,所分离的hAECs明显表达上皮细胞标志物角蛋白CK19,不表达间充质细胞标志物波形蛋白,不同程度地表达CD29、CD44和CD71。在表皮生长因子存在的条件下,hAECs生长增殖较快,培养至第6天细胞总数可增殖171倍。结论建立了人羊膜上皮细胞分离、培养及鉴定方法,hAECs具有上皮细胞的特异标志和间充质干细胞的某些表型特征。     

人胚胎视网膜色素上皮细胞的体外培养和吞噬作用

目的探讨人胚胎视网膜色素上皮（RPE）细胞分离培养的特性及其吞噬作用。方法取发育至13-15周的新鲜人胚胎眼球,显微解剖后采用机械胰酶消化法分离培养RPE细胞,应用免疫荧光法观察人胚胎RPE细胞吞噬视网膜光感受细胞外节膜盘。结果人胚胎发育至13-15周后,RPE细胞可应用标准的培养方法进行体外培养和传代。根据测定的人胚胎RPE细胞生长曲线,取2—6代细胞用于实验培养的人胚胎RPE细胞具备吞噬功能。结论改进了人胚胎RPE细胞的培养方法,证明人胚胎RPE细胞在体外具有吞噬能力。     

人正常子宫内膜原代腺上皮细胞的优化分离和培养

目的 优化人正常子宫内膜腺上皮细胞分离和原代培养的方法,提供子宫内膜相关疾病研究的体外细胞模型。方法 采用酶消化、筛网过滤、离心的方法体外分离和培养人子宫内膜腺上皮与间质细胞。腺上皮细胞鉴定采用光学显微镜下观察细胞形态;免疫细胞荧光及免疫细胞化学法检测上皮细胞角蛋白(CK)和间质细胞波形蛋白(Vim)的表达。结果 经诊刮获得的18份标本中有17份分离培养成功;细胞形态符合腺上皮细胞特征,CK免疫荧光及免疫化学染色阳性,Vim染色阴性,纯度达90%以上;正常原代人子宫内膜腺上皮细胞不能传代,培养5～6d后细胞逐渐衰老。结论 改良后的原代培养方法取材简单,克服了污染问题,可获得高纯度及足够数量的人正常子宫内膜腺上皮细胞作为体外实验模型。     

犬胆囊上皮细胞的分离及培养

目的　探讨胆囊上皮细胞的分离方法和生长条件 ,为研究胆囊的生理功能和相关疾病奠定基础。方法　采有Ⅳ型胶原酶分离细胞 ,Ⅳ型胶原和小牛血清包被培养皿 ,DMEM/HamF12培养基联合培养 ,观察细胞形态和生长曲线 ,并用胆囊上皮细胞特异性标记物角蛋白CK19鉴定细胞。结果　每个犬胆囊可分离得到 5 10× 10 6个胆囊上皮细胞 ,接种一周内生长旺盛 ,第 3 ,4d达到峰值 ,呈现扁平多角形成片贴壁状态。结论　Ⅳ型胶原酶消化法能成功分离家兔胆囊上皮细胞 ,Ⅳ型胶原 /小牛血清可促进细胞贴附 ,DMEM /HamF12培养基可提供较为满意的生长条件。     

人主动脉瓣间质细胞原代培养及体外钙化模型的建立

目的原代培养人主动脉瓣间质细胞并建立体外瓣膜细胞钙化模型,诱导人主动脉瓣间质细胞向成骨细胞分化,并观察其表型变化。方法采用胶原酶两次消化法原代培养人主动脉瓣间质细胞,取传代3～7代间质细胞,随机分为2组,实验组以钙化诱导培养基培养,对照组以标准培养基培养。1周后,行von Kossa染色观察钙化结节形成情况,分光光度计测定碱性磷酸酶活性,免疫荧光染色检测瓣膜间质细胞表型蛋白,real-time PCR及蛋白质印迹分析检测成骨相关因子的表达,评价模型建立情况。结果培养1周后实验组出现钙化结节,每孔钙化结节数量[(51.20±14.31)个]高于对照组[(3.60±1.82)个],差异有统计学意义(P<0.05),同时实验组碱性磷酸酶活性较对照组升高(约上升4倍,P<0.05),细胞收缩表型平滑肌肌动蛋白(α-SMA)增高。Real-time PCR及蛋白质印迹分析提示,实验组中成骨相关因子Runx2、osteocalcin及osteopontin在mRNA及蛋白水平均较对照组升高,磷酸化Smad1/5/8蛋白表达也同时升高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论成功建立了人主动脉瓣间质细胞体外诱导钙化模型,诱导后间质细胞呈现相对激活状态,表型向收缩表型和成骨表型转化,为今后实验提供了可靠的细胞模型。     

神经细胞的原代培养及缺血再灌注模型的建立

目的:建立良好的SD乳鼠神经细胞原代培养及缺血再灌注模型。方法:选用SD乳鼠大脑皮质进行细胞培养,采用机械研磨、过滤、胰酶消化、percoll(硅石胶态悬浮液)、密度梯度离心法分离纯化大脑皮质细胞后,选择含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基进行原代培养。利用分离纯化的幼鼠大脑皮质,制作细胞爬片,利用免疫组化进行鉴定。结果:大脑皮质细胞贴壁生长,4～7d基本达到融合,结合形态学及免疫细胞化学鉴定,原代细胞培养97%为神经细胞。而后采用国际上公认的氧糖剥夺发制作缺血再灌注模型。结论:采用机械研磨、过滤、胰酶消化结合percoll:密度梯度离心法分离培养的大脑皮层神经细胞数量多,均一性生长佳,采用国际上公认的氧糖剥夺发制作缺血再灌注模型。为以后实验打下基础。     

人卵巢上皮癌的体外培养及耐药株的诱导

目的研究人卵巢上皮癌体外培养的方法及其耐药株的诱导方法。方法取卵巢上皮癌患者的卵巢癌实体瘤、囊内液及腹水,分别用直接培养法,胰酶消化培养法和胶原酶消化培养法体外培养。检测细胞对顺铂和环磷酰胺的药物敏感性,选择适当的药物和浓度诱导卵巢上皮癌耐药株。并比较耐药株与诱导前的母株间克隆形成率和耐药蛋白表达的差异。结果腹水和囊内液直接培养较实体瘤培养易成功。实体瘤培养以胶原酶消化培养法获得细胞数最多,混杂细胞最少。取腹水来源的稳定传至30代的卵巢癌细胞用环磷酰胺诱导耐药株成功。检测其克隆形成率和耐药蛋白表达均高于诱导前。结论本实验探讨了人卵巢上皮癌体外培养的多种方法,成功培养一株卵巢黏液性囊腺癌细胞,达建系要求,并成功诱导其耐药株。可用于卵巢上皮癌发生及复发机制和治疗及预防方面的研究。     

子宫内膜间质细胞体外培养模型的建立

目的：探索在位子宫内膜间质细胞体外分离、纯化、培养的方法,从而建立研究子宫内膜异位症（EMs）的体外细胞模型。方法：选择因子宫肌瘤或子宫腺肌症行子宫（次）全切除术的病例38例,术中取其子宫内膜,通过酶解、过滤、贴壁纯化等技术,分离培养子宫内膜间质细胞并进行传代。结果：36例标本获得成功,分离纯化得到的子宫内膜间质细胞经角蛋白、波形蛋白染色证实纯度达95％以上,活性较强,可以有限传代,传代培养的细胞形态特征与原代细胞一致。结论：该方法可以高效简便地分离在位子宫内膜间质细胞,得到的间质细胞产量及纯度高,可以作为 EMs 的体外细胞模型之一。