生物化学和分子生物学

人核受体Nurrl基因的克隆和表达及产物纯化；小鼠3T3-L1前脂肪细胞系的特异性标记；肿瘤-睾丸-脑抗原家族新成员PNMA5的克隆和表达谱分析；人yonWillebrand因子A1和A3功能结构域嵌合体的表达及生物学功能；p75NTR-Fc融合蛋白在毕赤酵母中的表达、鉴定和活性分析；微丝相关新基因hHBrk1的克隆及功能鉴定；人SDCT2基因的两种不同转录产物选择性转录机理分析；醛缩酶A可与人蛋白激酶CK2α’亚基发生特异相互作用；人Collectrin同源基因的分离克隆及其在人肾集合管和远曲小管的特异表达；两种人粒酶B嵌合基因的表达及对肿瘤的杀伤作用；切割Fas mRNA核酶的构建及其体内外切割活性的鉴定；甲氧基聚乙二醇（mPEG）修饰遮蔽人ABO血型抗原；白血病抑制因子受体细胞内区对HL-60细胞表达CD14和CD15的影响；Rho GTPases对肿瘤血管生成相关分子的作用；促凋亡蛋白Bid诱导肝细胞凋亡的机制；中心体异常在咖啡因增聋顾铂杀伤入肝癌细胞系中的作用；四氧嘧啶诱导糖尿病小鼠的胰岛素原基因治疗；HBx-siRNA快速筛选体系的建立和应用；Nelfinavir损害鼠胰岛素瘤INS-1细胞内IRS-2信号传导。     

生物化学和分子生物学

0500591 包含BTB锌指结构的新基因Bsg2结构特性及其在发育阶段的组织表达特异性，0500592 HeLa细胞中Skp2的表达调控p21^WAF/CIP1稳定性,0500593 登革病毒衣壳蛋白靶向核酸酶表达系统的建立及应用,0500594 转录因子XBP-1的融合表达、纯化及多克隆抗体的制备,0500595 N端缺失突变对核糖核酸酶抑制因子活性的影响.     

幽门螺杆菌对AGS细胞p53、p21WAF1/CIP1和p27KIP1基因转录的影响

细胞周期蛋白依赖性激酶抑制物(Cyclin-dependent kinase inhibitors，CDKIs)负调控CDKs活性，主要有p16^INK4a和p15^INK4b及p21^WAF1/CIP1和p27^KIP1等两类。p53基因亦可调控细胞周期及凋亡，异常的细胞凋亡与消化道等肿瘤密切相关。本文采用MP-RT-PCR检测了cag-A^ ／CagA^ 和cagA^-／CagA^- Hp菌株感染前后AGS细胞p53、p21^WAF1/CIP1和p27^KIP1转录水平的改变，以期了解肋诱导细胞癌变和细胞周期阻滞的关系及可能的机制。     

TGFβ 1和AT1R基因多态性与乙肝肝硬化遗传易感性及临床表型的关联研究

目的探讨与宿主肝纤维化及门脉高压形成相关的转化生长因子β1（transforming growth fac-tor beta1,TGFβ1）和Ⅰ型血管紧张素Ⅱ受体（angiotensinⅡ type 1 receptor,AT1R）基因多态性与乙肝肝硬化遗传易感性及临床表型的关系。方法应用PCR-RFLP对102例乙型肝炎后肝硬化患者和106名随机抽样的无亲缘关系的健康献血者分别检测TGFβ1启动子区-509C/T、AT1R1166A/C基因多态性。结果肝硬化组TGFβ1启动子区-509C/T纯合子CC的基因型频率明显高于对照组（P〈0.05）;肝硬化Child-PughC级组-509C/T位点CC基因型分布频率明显高于B级和A级组（P〈005）;AT1R1166A/C基因型和等位基因频率在对照组和肝硬化组之间差异均无统计学意义（P〉0.05）。结论TGFβ1启动子区-509C/T基因多态性与乙型肝炎后肝硬化遗传易感性有关,并与肝硬化严重程度密切相关,AT1R1166A/C基因多态性可能与乙型肝炎后肝硬化遗传易感性无关。     

去甲肾上腺素促进血管平滑肌增殖和细胞表型转化

目的:研究去甲肾上腺素(NE)对血管平滑肌细胞(VSMC)表型转化和增殖的影响及作用机制.方法:用NE分别作用体外培养和血清饥饿的血管平滑肌细胞,用5-BrdU标记VSMC的增殖、RT-PCR检测VSMC表型标志基因SM22a和增殖负性调控基因高血压相关基因-1(HRG-1)的表达.结果:NE和OX-LDL分别作用血清培养的VSMC后,SM22α和HRG-1表达下凋,5-BrdU标记的阳性增殖细胞增多;NE分别与α1-肾上腺素受体拮抗剂(α1-R-)和β1-肾上腺素受体拮抗剂(β1-R)共作用时,SM22α和HRG-1的表达明显上调.而当NE作用血清饥饿VSMC时,NE上调SM22α和HRG-1的表达.结论:NE对VSMC有促表型转化和增殖作用,且这种作用呈现像神经样的可逆性调节作用.其作用机制主要通过肾上腺索受体α1和β1来实现的.     

地塞米松促进卵巢癌细胞系p21／WAFl和TβR－Ⅱ的表达

探讨人工合成糖皮质激素地塞米松(Dex)抑制人卵巢癌细胞系HO-8910增殖的分子机理.采用RT-PCR测定细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂p21/WAF1,转化生长因子-β1(TGF-β1)及其I型受体(TβR-Ⅰ)和Ⅱ型受体(TβR-Ⅱ)的mRNA表达水平,免疫细胞化学方法分析TβR-Ⅱ的蛋白表达水平.发现Dex能够诱导HO-8910细胞p21/WAF1 mRNA的表达,10-7mol/L Dex处理细胞8 h组比对照组p21/WAF1 mRNA表达增加2.84倍(P＜0.01).并且证明Dex亦可上调TβR-Ⅱ mRNA的表达水平,10-7mol/L Dex处理8 h使TβR-Ⅱ mRNA的表达量比对照升高1.2倍(P＜0.01);Dex也引起TβR-Ⅱ蛋白表达的增加.这些效应均可被糖皮质激素受体(GR)拮抗剂RU486逆转.而TGF-β1和TβR-ⅠmRNA的表达不受Dex的影响.以上结果提示,Dex通过GR介导而促进p21/WAF1和TβR-Ⅱ的表达,可能参与其抑制人卵巢癌细胞HO-8910增殖过程.     

血管紧张素-（1-7）对转化生长因子β1诱导的大鼠肾小球系膜细胞增殖的影响

目的:研究血管紧张素-(1-7)[Ang-(1-7)]对转化生长因子β1(TGF-β1)诱导的大鼠肾小球系膜细胞(GMC)增殖的影响并初步探讨其机制.方法:采用WST法检测培养系膜细胞增殖;RT-PCR法检测细胞内信号传递分子Smad3/7基因mRNA的表达.结果:与对照组比较, Ang-(1-7)明显抑制TGF-β1诱导的GMC增殖(P＜0.05);同时, Ang-(1-7)对TGF-β1诱导的系膜细胞内Smad3, Smad7基因mRNA表达有明显的抑制作用(P＜0.05).结论:Ang-(1-7)对TGF-β1诱导的系膜细胞增殖有抑制作用, 其机制可能是通过下调细胞内信号传递分子Smad3/7的表达.     

内皮素-1对大鼠血管平滑肌表型转化和增殖的影响

目的:通过内皮素-1作用于大鼠血管平滑肌细胞(VSMC)及对内皮素-1受体信号的阻断,探讨内皮素-1对VSMC表型转化和增殖的影响及机制.方法:取大鼠主动脉贴块培养VSMC,用内皮素-1及其受体阻断剂BQ123分别作用于一般培养的VSMC和血清饥饿培养的VSMC.用BrdU标记细胞增殖;RT-PCR检测高血压相关基因-1(HRG-1)和SM22α表达变化.结果:内皮素-1作用后VSMC增殖显著增多,HRG-1和SM22α mRNA在一般培养和饥饿培养的VSMC中表达均明显减少;而加入阻断剂BQ123后增殖细胞大大减少,HRG-1和SM22α mRNA表达明显上调.结论:内皮素-1有促进VSMC增殖作用并可使VSMC从收缩型向合成型转化,并且内皮素-1对VSMC的作用是不可逆的;受体信号途径是内皮素-1对VSMC表型转化和增殖作用的机制之一.     

浓缩生长因子对兔骨膜细胞增殖与成血管化的影响

目的探讨浓缩生长因子(concentrated growth factor,CGF)对兔骨膜细胞增殖与成血管化的作用。方法无菌条件下取兔股骨并以胶原酶消化法分离兔骨膜细胞,取兔静脉血制备CGF并与兔骨膜细胞体外共培养。倒置显微镜观察细胞形态学改变;扫描电子显微镜观察CGF与细胞共培养的表面超微结构;CCK-8法检测细胞增殖活性;免疫组织化学检测CD34表达;采用Western blotting和qRT-PCR分别检测VEGF、TGF-β 1蛋白及基因表达水平。结果兔骨膜细胞呈梭形旋涡状或簇状生长,CGF的三维纤维网络结构有利于兔骨膜细胞黏附、伸展,并显著促进细胞增殖(P0.05),CGF与兔骨膜细胞共培养后CD34阳性表达。与对照组相比,CGF显著提高了兔骨膜细胞VEGF、TGF-β 1蛋白及基因的表达水平(P0.05)。结论 CGF促进兔骨膜细胞增殖和成血管化可能与VEGF、TGF-β 1表达上调相关。     

瘦素对大鼠气道平滑肌细胞TGF-β1及Ⅰ型胶原蛋白表达的影响北大核心CSCD

目的观察瘦素对大鼠气道平滑肌细胞(ASMC)转化生长因子-βl(TGF-β1)及Ⅰ型胶原蛋白表达的影响。方法贴壁法体外培养大鼠ASMC。不同浓度瘦素刺激体外培养的ASMC,分为空白对照组、不同浓度(50、100、200)μg/L干预组。各组干预24 h后RT-PCR法检测各组TGF-β1及Ⅰ型胶原蛋白mRNA表达。将ASMC按5×105接种于6孔板,经上述不同浓度瘦素干预48 h后,收集细胞上清液。各组干预48 h后采用ELISA测定各组上清中TGF-β1及Ⅰ型胶原蛋白水平。结果与对照组相比,各浓度瘦素处理的ASMC中TGF-β1及Ⅰ型胶原蛋白mRNA和蛋白的表达增加(P<0.05),并与瘦素浓度呈正相关。结论瘦素可以增加体外培养的ASMC中的TGF-β1和Ⅰ型胶原蛋白的表达。     

转化生长因子-β1的Smad4非依赖性途径对胰腺癌细胞生长的影响

目的探讨转化生长因子(TGF)-β1过表达对Smad4纯合性缺失的胰腺癌细胞生长的影响。方法将含TGF-β1的真核表达载体转染到人胰腺癌细胞BxPC3中,通过流式细胞仪、生长曲线以及细胞迁移试验观察其对BxPC3生物学行为的影响。用Western印迹法检测TGF-β1对BxPC3细胞中p21WAF/CLIP1表达的影响。结果转染TGF-β1基因的BxPC3细胞的形态发生明显改变,其生长速度自第4天开始较转染空载体pcDNA3的阴性对照组减慢。发现BxPC3细胞组S期细胞(27.53±0.02)%与pcDNA3组(26.32±0.01)%的比例均高于TGF-β1组(17.01±0.03)%,P<0.01,表明TGF-β1阻止细胞进入S期。细胞迁移试验表明转染的细胞运动能力明显增加。Western印迹法检测表明p21WAF/CLIP1的表达也相应增高。结论TGF-β1的Smad4非依赖性途径通过增强p21WAF/CLIP1的表达使细胞阻滞于G-G期,从而抑制细胞生长,并且该通路能诱导上皮细胞向间叶细胞转变。     

2型糖尿病肾病患者血浆ET、血清TGF-β1和VEGF检测的临床意义

目的：探讨2型糖尿病肾病（DN）患者血浆ET、血清TGF-β1和VEGF水平的变化及临床意义。方法：应用放射免疫分析和酶联免疫吸附法对44例糖尿病无肾病患者和32例2型糖尿病肾病患者进行了血浆ET、血清TGF-β1和VEGF测定,并与35名正常健康人作比较。结果：DN组血浆ET、血清TGF-β1和VEGF水平显著高于正常人组（P〈0.01）。NDN组与正常人组比较无显著性差异（P〉0.05）。结论：血浆ET、血清TGF-β1和VEGF含量随DN的发生以及严重程度逐渐增高,可作为早期诊断DN发生以及严重程度的指标,对监测早期DN的发生和病情发展程度有重要的临床价值。     

ERK1/2和TGF-β1在自发性高血压大鼠心脏中的表达上调

目的 探讨自发性高血压大鼠(SHR)心脏细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)和转化生长因子β1(TGF-β1)表达的意义.方法 采用免疫组化和Western blot方法检测心脏ERK1/2和TGF-β1的表达.结果 在SHR8、SHR16、SHR20三个周龄组中,心肌间小动脉内皮细胞中的ERK1/2阳性率分别为15.38%、76.97%和72.72%,SHR16和SHR20组心肌间血管平滑肌细胞(VSMC)ERK1/2染色阳性率为5.49%和6.83%,均显著高于对照组(P＜0.05).在SHR16和SHR20组中ERK1/2蛋白含量明显高于对照组(P＜0.05);心脏中TGF-β1含量明显高于同周龄的SD大鼠(P＜0.05).心脏中ERK1/2和TGF-β1表达量与平均动脉血压正相关(P＜0.05).结论 在SHR心脏组织中TGF-β1表达增加并与ERK1/2相互作用,可能参与了心脏病变的形成.     

生理学

胰岛素样生长因子-1对血管平滑肌细胞PI2K／PTEN信号通路的影响；血管紧张素Ⅱ1型受体短发夹环RNA对大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响；内皮素-1在神经源性肺水肿中的作用；去甲肾上腺素参与家兔脑室注射P物质的心血管效应；差异显示法对血管平滑肌细胞钙化过程中基因表达变化的研究；损毁大鼠杏仁中央核对不同味觉溶液摄人的影响；β-ME和BHA体外诱导人胎肝CD34^＋细胞向神经组织细胞分化研究；孤束核组胺受体参与大鼠脑室注射组胺对颈动脉赛反射的抑制；CGRP受体拮抗剂CGRP8-37对甲醛炎性痛大鼠自发痛反应及脊髓后角NOS表达和NO含量的影响；甲醛炎性痛及痛过敏诱导大鼠脊髓后角环氧化酶-2表达的变化；蛙皮素对大鼠IFN性发热反应及脑内AVP含量的影响；细胞外信号调节激酶1在大鼠胆汁性纤维化形成过程中的含量变化；手术截断小鼠尾末端诱发的痛觉过敏和吗啡镇痛效应；异丙酚对正常大鼠脊髓背角感觉神经元反应性的抑制作用。     

卡格列净改善自发性高血压大鼠主动脉重构的作用及其机制

目的：探索卡格列净通过调控血管平滑肌细胞（VSMCs）增殖迁移及肾素-血管紧张素-醛固酮系统（RAAS）/转化生长因子β1(TGF-β1)信号通路,改善自发性高血压大鼠（SHR）胸主动脉重构。方法 ：将大鼠分为正常血压大鼠对照组（WKY组）、SHR组和SHR+卡格列净组。尾袖血压计监测大鼠尾动脉血压,H-E染色评估胸主动脉血管壁中膜厚度及中膜厚度/管腔直径比值,Masson染色检测血管壁纤维化程度。体外分离培养WKY和SHR胸主动脉VSMCs,细胞分为WKY组、WKY+卡格列净组、SHR组和SHR+卡格列净组。CCK-8检测细胞增殖,划痕实验检测细胞迁移,RT-qPCR和免疫印迹检测α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、分泌型磷酸蛋白1(SPP1)、 I型胶原蛋白（Col1a）、Ⅲ型胶原蛋白（Col3a）、血管紧张素原（AGT）、血管紧张素Ⅱ受体1 (AGTR1)、TGF-β1mRNA与蛋白表达。结果 ：给予卡格列净灌胃8周后,与SHR组相比,SHR+卡格列净组大鼠尾动脉血压、胸主动脉中膜厚度、中膜厚度/管腔直径比值、胶原蛋白沉积程度降低。SHR组VSMCs增殖、迁移能力较WKY组明显增强...     

血管紧张素Ⅱ和血管紧张素-(1-7)对大鼠血管平滑肌细胞肾素(原)受体表达的影响

目的: 研究血管紧张素Ⅱ(Ang II)和血管紧张素-(1-7) 对大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)肾素(原)受体 表达的影响。方法: 将VSMCs按以下分组:(1)对照组:不加干预因素;(2)不同浓度AngⅡ组:分别加入AngⅡ10、100、1 000 nmol/L;(3)不同浓度Ang-(1-7)组:分别加入Ang-(1-7) 10、100、1 000 nmol/L; (4)AngⅡ+ losartan(AT₁受体拮抗剂)组:losartan 10^-6 mol/L预处理30 min后,再加入AngⅡ100 nmol/L; (5)AngⅡ+ PD123319(AT₂受体拮抗剂)组: 先用10^-5 mol/LPD123319预处理30 min后,再用终浓度为100 nmol/L AngⅡ;(6)CGP42112A(AT₂受体激动剂)组:加入10^-7 mol/L CGP42112A。各组用real-time PCR法和Western blotting法检测(P)RR的表达情况。结果: 与对照组比,不同浓度AngⅡ可以促进(P)RR mRNA和蛋白的表达,并且呈浓度依赖性(均P<0.01);不同浓度Ang-(1-7)可抑制 (P)RR mRNA和蛋白表达(均P<0.01),各浓度之间比较无显著差异(均P>0.05);加入CGP42112A可以促进(P)RR mRNA和蛋白的表达(均P<0.01),与AngⅡ处理组比较,加入PD123319可抑制(P)RR mRNA和蛋白表达(均P<0.01),加入losartan不能抑制(P)RR mRNA和蛋白表达(P>0.05)。结论: AngⅡ可通过AT₂受体促进(P)RR mRNA和蛋白表达,而Ang-(1-7) 可抑制(P)RR mRNA和蛋白的表达。     

腺病毒介导hRAMP1基因转染血管平滑肌细胞的增殖和凋亡

背景：外源性受体活性修饰蛋白1基因转染可能对血管平滑肌细胞增殖调控具有重要的作用。 目的：探讨腺病毒载体介导人受体活性修饰蛋白1基因对体外培养的兔血管平滑肌细胞增殖和凋亡的影响。 方法：分离培养获得兔主动脉血管平滑肌细胞,分别以携带人受体活性修饰蛋白1基因的腺病毒和空腺病毒转染后,分成人受体活性修饰蛋白1组、空病毒组和对照组。 结果与结论：腺病毒转染细胞后随时间延长,报告基因绿色荧光蛋白表达逐渐增加,72 h表达最强,感染率达80%,96 h时仍有绿色荧光蛋白表达。人受体活性修饰蛋白1组的受体活性修饰蛋白1蛋白表达增加,血管平滑肌细胞凋亡率增加,细胞增殖明显抑制,与空病毒组和对照组比较差异有显著性意义(P < 0.05)。提示人受体活性修饰蛋白1基因感染血管平滑肌细胞后明显抑制血管平滑肌细胞增殖,促进细胞凋亡。     

磷脂酰肌醇3激酶对TNF-α诱导的大鼠气道平滑肌细胞增殖、凋亡和转化生长因子β1表达的影响

目的 探讨磷脂酰肌醇3激酶（PI3-K）对TNF-α诱导的大鼠气道平滑肌细胞（ASMC）增殖、凋亡和转化生长因子β1（TGF-β1）表达的影响.方法 以肿瘤坏死因子-α（TNF-α）及PI3-K特异性抑制剂wortmannin作为工具药,分别将TNF-α、TNF-α＋wortmannin接种ASMC,置37℃,5%CO2培养箱中培养.逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）检测PI3-Kp85α、TGF-β1 mRNA表达,免疫细胞化学染色法检测PI3-Kp85α、PCNA、Bcl-2蛋白表达及定位,Sandwich ELISA检测NF-κB活性,四甲基偶氮唑蓝（MTT）微量比色法测定ASMC增殖,AnnexinV/PI双标记流式细胞仪分析法检测细胞凋亡,ELISA测定TGF-β1蛋白质含量.结果 （1）培养的ASMC PI3-K p85α的阳性定位在胞浆.TNF-α组ASMC PI3-Kp85α mRNA及蛋白表达水平均显著高于对照组及TNF-α＋wortmannin组（P＜0.01）;（2）TNF-α组ASMCNF-κB活性与对照组相比显著增高（P＜0.01）,TNF-α＋wortmannin组NF-κB活性与TNF-α组相比显著降低（P＜0.01）;（3）TNF-α组ASMC的增殖反应与对照组及TNF-α＋wortmannin组相比显著增加（P＜0.01）;TNF-α组细胞凋亡率与对照组相比差异无统计学意义（P＞0.05）,TNF-α＋wortmannin组细胞凋亡率显著高于TNF-α组及对照组（P＜0.01）.（4）TNF-α组ASMC的PCNA、Bcl-2蛋白表达量均显著高于对照组及TNF-α＋wortmannin组（P＜0.01）;（5）TNF-α组ASMC的TGF-β1的mRNA表达水平、培养液上清TGF-β1的蛋白质含量均显著高于对照组及TNF-α＋wortmannin组（P＜0.01）.结论 PI3-K可能参与调控TNF-α诱导的大鼠气道平滑肌细胞的增殖、凋亡及TGF-β1的表达和分泌,NF-κB作为PI3-K的下游信号参与此过程.     

非小细胞肺癌EGFR基因突变与ERCC1、RRM1、TUBB3 mRNA表达相关性研究

目的：探讨非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)患者表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)基因突变与切除修复交叉互补蛋白1(excision repair cross-complementation 1,ERCC1)、核苷酸还原酶亚单位M1(ribonucleotide reductase subunit M1,RRM1)及3型β-微管蛋白基因(classⅢβ-tubulin,TUBB3)表达的关系。方法：回顾性分析我院经病理诊断的69例NSCLC患者的手术切除的肿瘤标本,利用扩增受阻突变系统(amplification refractory mutation system,ARMS)进行EGFR基因突变检测,应用实时荧光定量PCR检测ERCC1、RRM1及TUBB3 mRNA的表达水平。结果：69例患者中,EGFR突变率为33.33%(23/69),在性别、吸烟史、病理类型组间突变率有显著性差异。ERCC1低、高表达率分别为59.42%(41/69)、40.58%(28/69),EGFR突变与ERCC1表达呈负相关性,EGFR无突变时ERCC1趋向于高表达(P=0.024);RRM1低、高表达率分别为31.88%(22/69)、68.12%(47/69),EGFR突变与RRM1表达无相关性(P>0.05);TUBB3低、高表达率分别为8.70%(6/69)、91.30%(63/69),EGFR突变与TUBB3表达无相关性(P>0.05)。ERCC1、RRM1、TUBB3三者间的基因表达均无相关性。结论：NSCLC患者肿瘤组织中EGFR突变患者ERCC1倾向低表达,这类患者可能更能从铂类化疗和靶向药物中受益。     

Th17细胞分化与调控的研究进展

Th17细胞是一种不同于Th1和Th2细胞的新型第三类效应性CD4+T细胞亚群,以特异性分泌高水平的IL-17为特征,后者作为一种炎症介质,通过与IL-17受体的结合,以及与IL-6、TGF-β等细胞因子和Th17细胞的特异性转录因子维甲酸相关孤儿受体-γt的相互作用,引发包括JAK/STAT等途径在内的一系列信号传递...