RNA干扰HPV E6下调eIF4E转录表达抑制宫颈癌Hela细胞增殖并影响细胞周期进程研究

目的探讨宫颈癌Hella细胞中干扰HPV E6对eIF4E表达的调控,探寻HPV E6促癌的新途径,为宫颈癌诊断和治疗提供新靶点。方法构建高效的靶向HPV18 E6的shRNA质粒(shE6)并测序,而后转染人宫颈癌Hela细胞,荧光显微镜及流式细胞术检测转染效率。而后以Real-time PCR检测E6及eIF4E的mRNA水平,采用CCK-8法检测Hela细胞增殖能力的改变,流式细胞术检测细胞周期。结果测序结果显示成功构建shE6质粒。shE6-3转染人宫颈癌Hela细胞后48 h,E6及eIF4E mRNA表达的抑制率分别约为80%,76%。shE6-3对Hela细胞的增殖活性在48 h的抑制效果最明显,增殖抑制率约为21%;相对于NC组,shE6组G0/G1期细胞比例显著增高,而S期比例减少,G2/M期未见明显变化。结论 RNA干扰HPV E6能够下调eIF4E转录表达,抑制宫颈癌Hela细胞增殖,并阻滞细胞周期于G0/G1期。eIF4E有望成为宫颈癌防治的潜在靶点。     

eIF4E和VEGF在宫颈癌中的表达及意义

目的 探讨宫颈癌组织中真核细胞翻译起始因子4E(eIF4E)和血管内皮生长因子(VEGF)的表达及意义.方法 应用免疫组织化学技术检测51例宫颈癌及10例慢性宫颈炎组织中eIF4E和VEGF的表达,同时结合患者的临床病理资料进行分析.结果 51例宫颈癌组织中eIF4E和VEGF的表达阳性率分别为100%和66.7%,二者的表达具有正相关(r=0.365,P=0.008),而慢性宫颈炎组织无eIF4E和VEGF表达.eIF4E的表达与宫颈癌患者年龄和病理类型无明显相关性,但与肿瘤组织分化程度、有无浸润转移、临床期别明显相关.VEGF的表达与患者年龄、病理类型、肿瘤组织分化程度无明显相关,但与有无浸润转移及临床期别明显相关.结论 过度表达的eIF4E和VEGF是宫颈癌恶变及判断其恶性程度的分子标志,并在宫颈癌的侵袭和转移机制中发挥着重要作用.     

eIF4E与磷酸化eIF4E结合蛋白1在甲状腺乳头状癌中的表达及意义

目的 观察真核细胞翻译起始因子4E(eIF4E)及磷酸化eIF4E结合蛋白1(p-4EBP1)在甲状腺乳头状癌组织中的表达,并探讨其与甲状腺乳头状癌的侵袭、转移等临床病理特征间的关系.方法 采用免疫组化EnVinsion法检测66例乳头状癌(经典型乳头状癌37例,滤泡型乳头状癌29例)、20例结节性甲状腺肿伴乳头状增生及上述病例的肿瘤旁正常甲状腺组织中eIF4E与p-4EBP1的表达.结果 在肿瘤旁正常甲状腺组织、甲状腺肿伴乳头状增生及乳头状癌中,eIF4E的阳性率分别为11.6%(10/86)、50.0%(10/20)和84.8%(56/66)(P＜0.01);p-4EBP1的阳性率分别为8.1%(7/86)、40.0%(8/20)和66.7%(44/66)(P＜0.01),并且p-4EBP1在滤泡型乳头状癌中的表达显著高于其在经典型乳头状癌中的表达(P＜0.01).eIF4E在有腺外侵袭和淋巴结转移的病例中的阳性率分别为96.7%(29/30)和100.0%(29/29),分别高于无腺外侵袭和无淋巴结转移的病例,后者阳性率分别为75.0%(27/36)和73.0%(27/37)(P＜0.05).而p-4EBP1在这两组病例中的表达差异则无显著性意义(P＞0.05).结论 和正常甲状腺及甲状腺良性病变相比,eIF4E和p-4EBP1在乳头状癌中存在过表达;eIF4E的过表达与乳头状癌的侵袭与转移关系密切,在乳头状癌的进展中可能发挥了重要作用.     

RNA干扰对MCF-7细胞eIF4E表达的影响

目的:探讨RNA干扰(RNAi)对人乳癌MCF-7细胞真核起始因子4E(eIF4E)表达的影响.方法:针对eIF4E基因的寡核苷酸序列设计并体外转录合成小干扰RNA(siRNA),分别以100、150和200 mg/L转染MCF-7细胞24、48及72 h后,采用免疫细胞化学及原位杂交方法检测MCF-7细胞中eIF4E...     

RNA干扰HPV16 E6基因表达对宫颈癌SiHa细胞增殖的影响

目的：探讨HPV16 E6小干扰RNA（siRNA）对宫颈癌SiHa细胞增殖的影响。方法：利用化学合成的方法,合成针对HPV16 E6的siRNA,借脂质体转染SiHa细胞。应用荧光定量RT—PCR和Western—blot检测HPV16 E6mRNA及其蛋白水平的表达。MTT法绘制细胞生长曲线。流式细胞术评价HPV16 E6siRNA对细胞周期的影响。结果：HPV16 E6siRNA转染细胞48h及72h后,细胞内HPV16 E6mRNA及蛋白表达量明显下调,与HPV16 E6阴性对照组及空白组比较[48h（1．85±0．15）vs（2．14±0．13）,（2．29±0．11）;72h（1．82±0．06）vs（2．32±0．14）,（2．35±0．23）],差异有显著性意义（P〈0．01）;MTT显示细胞生长明显受到抑制;流式细胞术‘检测显示,E6siRNA可将细胞阻滞在G1期。结论：HPV16 E6siRNA能抑制SiHa细胞增殖。     

RNA干涉抑制宫颈癌HPV16 E6基因的研究

目的采用RNA干涉（RNAi）技术干扰宫颈癌HPV16 E6基因转录,通过体外和体内实验了解其特异性抑制HPV16 E6基因的效率。方法设计合成针对HPV16 E6的小干扰RNA（siRNA）,借脂质体转染宫颈癌CaSki细胞,通过测定转染后不同时间点的细胞凋亡率、HPV16 E6mRNA及蛋白表达变化了解基因抑制的效率。体内实验中建立子宫颈癌荷瘤裸鼠模型,将E6 siRNA直接注入瘤体,观察肿瘤体积的变化,肿瘤切片HPV16 E6免疫组化染色,观察肿瘤坏死和细胞的凋亡。结果HPV16 E6siRNA转染细胞后24h、48h、5d和9d时凋亡率分别为7．7％、11．8％、37．4％和12．6％。RT-PCR显示转染后24h、48h、5d和9d HPV16 E6 mRNA量减少了77％、83％、59％和41％。Western blot显示转染后的HPV16 E6蛋白表达在24h、48h、5d明显减少,9d时有所恢复;流式细胞仪HPV16 E6蛋白定量测定结果显示,转染后24h、48h、5d和9d蛋白表达抑制率分别为79．7％、80．4％、71．3％和57．4％。体内实验瘤内注射HPV16 E6 siRNA明显抑制肿瘤的生长,HPV16 E6蛋白表达明显受抑,肿瘤组织坏死和细胞凋亡增加,重复给药较单次给药效果更好。结论体内和体外实验均表明RNA干涉HPV16 E6基因的效果具有特异性和高效性。     

eIF4E与肿瘤研究进展

真核细胞翻译起始因子4E(eIF4E)是最重要的翻译起始因子,在真核细胞蛋白质合成中起重要作用。近年来研究显示,eIF4E过表达与肿瘤的发生发展关系密切。与正常组织及良性肿瘤相比较,发现很多恶性肿瘤和肿瘤旁组织中eIF4E过度表达,并与肿瘤的侵袭转移能力呈正相关。研究发现,eIF4E通过多方面调控恶性肿瘤相关mRNAs的翻译,包含细胞有丝分裂过程、激活原癌基因、血管形成、增强自分泌、细胞存活、侵袭及与细胞外环境的交通。eIF4E与肿瘤的密切关系为临床治疗肿瘤提供了新思路,更有可能成为肿瘤治疗的共同靶点和肿瘤发展与预后的预测因子。     

RNA干扰技术抑制HPV16 E6基因表达对宫颈癌细胞株CaSki增殖的影响

目的观察HPV16 E6小干扰RNA(siRNA)能否抑制宫颈癌细胞生长,并探讨其作用机理。方法化学合成针对HPV16 E6的siRNA,借脂质体转染宫颈癌CaSki细胞,应用细胞计数的方法测定细胞生长曲线、活细胞率及细胞生长抑制率。运用实时荧光定量RT-PCR、流式细胞术检测转染后不同时间点细胞周期、HPV16 E6、p53、p21 mRNA及蛋白表达的变化。结果转染HPV16 E6 siRNA后,细胞生长明显受到抑制。流式细胞术结果显示并未将细胞阻滞在G1期。实时荧光定量RT-PCR显示,转染24h,E6 mRNA的表达比空白组降低了20.11倍(P<0.05),而p53、p21 mRNA的表达无明显变化。转染48h,E6蛋白表达明显下调,Pp53、P21蛋白表达相应地升高。结论HPV16 E6 siRNA可通过特异、高效地沉默宫颈癌细胞E6mRNA的表达,减少对野生型p53的降解,恢复P53蛋白的功能活性而发挥抑制宫颈癌细胞生长的作用。     

eIF4E基因下调对人乳腺癌Bcap37细胞凋亡的影响

目的应用化学合成的siRNA干扰乳腺癌Bcap37细胞真核细胞翻译起始因子4E(eukaryotic translation initiationfactor 4E,eIF4E)的表达,探讨其对乳腺癌细胞凋亡和生长周期的影响。方法化学合成eIF4E基因的siRNA,转染人乳腺癌Bcap37细胞,采用Western blotting法及RT-PCR法检测转染前后Bcap37细胞中eIF4E蛋白和mRNA表达;应用流式细胞技术检测转染前后细胞周期的变化;AO/EB双染色法检测细胞凋亡;酶标仪检测caspase-3活性。结果 RT-PCR与Western blot-ting法检测结果显示,转染eIF4E-siRNA-3#组细胞eIF4E基因的mRNA和蛋白表达均明显下降(P<0.01);eIF4E-siRNA转染组G1期细胞比例显著增加,S期细胞比例相对减少,差异显著(P<0.05);转染eIF4E-siRNA可诱导细胞凋亡,caspase-3活性亦增强。结论 eIF4E-siRNA可下调eIF4E基因在乳腺癌Bcap37细胞中的表达水平,诱导细胞凋亡。     

胃癌组织中eIF4E、C—myc及CyclinD1的表达及临床意义

目的 研究胃癌组织中真核细胞起始因子4E(eukaryotic initiation factor 4E,eIF4E)、C-myc及Cyclin D1蛋白的表达以及与胃癌临床病理的关系.方法 采用免疫组织化学方法检测91例胃癌组织和30例正常胃黏膜组织中eIF4E、C-myc及Cyclin D1的表达情况,并结合其临床病理资料进行综合分析.结果 与正常胃组织相比,eIF4E、C-myc及Cyclin D1蛋白在胃癌组织中均呈现高表达(P＜0.01).eIF4E、C-myc及Cyclin D1的阳性表达率与患者的年龄、性别以及肿瘤分化程度均无明显相关性(P＞0.05),而与肿瘤的浸润深度、淋巴转移及临床分期有关(P＜0.05).eIF4E与C-myc,eIF4E与Cyclin D1的表达呈正相关(r=0.824,r=0.780,P＜0.01).结论 eIF4E、C-myc 及 Cyclin D1的表达与胃癌的侵袭、转移密切相关,eIF4E表达与C-myc及Cyclin D1显著相关.     

自噬相关蛋白4EBP1与eIF4E在几种常见脑瘤组织中的表达

目的：探讨自噬相关蛋白4EBP1与eIF4E在星形细胞瘤、脑膜瘤、少突胶质细胞瘤、胆脂瘤和正常脑组织中的表达及其差异。方法应用逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）法检测4种脑瘤中4EBP1和eIF4E mRNA的表达情况,采用免疫组化SABC法和Western blotting检测4EBP1和eIF4E在4种脑瘤组织中的表达情况,并应用SPSS 17．0统计软件,分析4EBP1和eIF4E在4种脑瘤以及正常脑组织中的表达差异。结果4种脑瘤细胞均转录4EBP1和eIF4E mRNA,表达4EBP1、eIF4E蛋白,同时伴随着自噬标志蛋白LC-3的表达和LAMP-2A的高表达。免疫组化结果显示,与正常组织相比,4EBP1和eIF4E在4种肿瘤中的表达量明显升高,方差分析结果表明4EBP1和eIF4E在4种肿瘤组织与正常脑组织中的表达差异有统计学意义（P＜0．01）。结论自噬相关蛋白4EBP1和eIF4E在4种脑肿瘤组织中的表达明显上调,说明4EBP1和eIF4E及其自噬信号通路在肿瘤发生、发展中可能发挥重要作用,可作为脑瘤治疗的潜在靶标以及为临床诊断提供一种新的依据。     

eIF4E和cyclinD1在结直肠癌中的表达和临床意义

目的探讨eIF4E和cyclinD1蛋白表达在结直肠癌的发生发展中的临床意义。方法用EnVision二步法检测80例原发性结直肠癌、30例结直肠腺瘤和20例正常结直肠黏膜eIF4E和cyclinD1蛋白表达。结果①eIF4E蛋白在结直肠黏膜、腺瘤和腺癌组中的阳性率分别为10.0%,83.3%,92.5%,腺癌组和腺瘤组阳性率均高于黏膜组(P<0.01)。eIF4E蛋白在结直肠癌中的表达与肿瘤浸润深度、淋巴结转移、TNM分期和5年生存有显著相关性(P<0.05);②cyclinD1蛋白在结直肠黏膜、腺瘤和腺癌组中的阳性率分别为0、46.7%,55.0%,腺癌组和腺瘤组阳性率均高于黏膜组(P<0.01)。cyclinD1蛋白在结直肠癌中的表达与组织学分级(P<0.05)、淋巴结转移和TNM分期(P<0.01)有显著相关性;③结直肠癌组织中eIF4E与cyclinD1蛋白表达呈正相关(r=0.914,P<0.01)。结论①eIF4E蛋白表达上调可发生结直肠癌发展的全过程,提示eIF4E在结直肠癌的发生发展中起重要作用。eIF4E蛋白高表达的结直肠癌大多浸润深、淋巴结转移较多,患者预后较差,eIF4E可作为临床上结直肠癌的预后评价指标;②结直肠癌中eIF4E与cyclinD1蛋白表达呈正相关,提示两者存在协同关系。     

沉默HERC4表达可抑制宫颈癌细胞的增殖、凋亡和迁移

目的 探讨HERC4对宫颈癌细胞生物学功能的影响及其分子机制.方法 设计特异HERC4siRNA干扰序列,Lipofectamine2000法转染Hela细胞,Western blotting检测转染特异siRNA后Hela细胞HERC4蛋白的表达水平;CCK-8法检测转染后Hela细胞的增殖能力;Annexin V-FITC/PI双染法检测转染后Hela细胞凋亡率的变化;划痕实验检测转染后Hela细胞迁移能力.Western blotting检测转染后Hela细胞CyclinD1、Bcl-2表达变化.结果 转染特异siRNA后Hela细胞HERC4蛋白表达量明显下降,差异有统计学意义(P＜0.01).与对照组相比,干扰组Hela细胞生长速度明显减慢,细胞凋亡率增加,迁移能力明显下降,差异有统计学意义(P＜0.01).转染后Cyclin D1和Bcl-2在蛋白水平的表达显著下调(P＜0.01).结论 siRNA可有效降低宫颈癌Hela细胞中HERC4的表达,并通过抑制Cyclin D1表达抑制宫颈癌Hela细胞的增殖和迁移能力,抑制Bcl-2表达增加细胞凋亡能力.     

细胞周期素E的干扰RNA对HeLa细胞增殖的抑制作用

目的 利用RNAi技术下调宫颈癌HeLa细胞中cyclin E mRNA水平,研究对HeLa细胞增殖及周期的影响.方法 构建针对cyclin E基因的RNAi真核表达载体,脂质体转染HeLa细胞下调细胞中cyclin E mRNA含量.RT-PCR检测抑制效果;MTT检测细胞生长情况;流式细胞仪分析HeLa细胞周期变化.结果 成功构建针对cyclin E基因的RNAi真核表达载体,可以特异下调cyclin E mRNA含量,并抑制细胞恶性增殖.细胞周期分析显示干扰使细胞停留在G0～G1期,S期细胞明显减少.结论 RNAi能特异地下调HeLa细胞中cyclin E mRNA含量,抑制宫颈癌细胞恶性增殖,提示cyclin E可能成为宫颈癌基因治疗中的一个新的靶点.     

siRNA沉默eIF4E诱导人喉癌Hep-2细胞凋亡及其机制

目的:观察真核细胞翻译起始因子4E(eIF4E)基因的靶向小干扰RNA(siRNA)对喉癌Hep-2细胞中eIF4E基因表达的影响,探讨其诱导喉癌细胞凋亡的作用机制。方法:采用脂质体LipofectamineTM2000将siRNA-eIF4E转染入人喉癌Hep-2细胞(siRNA-eIF4E组),同时设空白对照组和空质粒组。MTT法检测siRNA对Hep-2细胞增殖的抑制作用,罗丹明染色检测转染后细胞内线粒体膜电位的变化,TUNEL染色法检测细胞凋亡,RT-PCR和Western blotting法检测凋亡相关基因转录和蛋白表达水平的变化。结果:与空白对照组及空质粒组比较,siRNA-eIF4E组Hep-2细胞中eIF4E基因转录和表达水平明显下调(P<0.01),Hep-2细胞生存率下降(P<0.05),细胞线粒体膜电位降低(P<0.05),细胞凋亡率增加(P<0.05),凋亡相关基因Bim、Bid及Caspase-3表达上调(P<0.05)。结论:siRNA-eIF4E在体外可抑制人喉癌Hep-2细胞增殖,其机制可能是通过激活线粒体凋亡途径诱导Hep-2细胞凋亡。     

高危HPVE6/E7mRNA对宫颈病变诊断价值的研究

目的 探讨高危HPV E6/E7 mRNA对宫颈病变的临床诊断价值。 方法 根据病理诊断结果的不同分为两组,其中慢性宫颈炎、宫颈上皮内瘤变(CIN)Ⅰ级患者共48例为对照组,高级别宫颈病变(包括CINⅡ级、CINⅢ级及宫颈浸润癌)共42例患者为观察组,分别对上述宫颈细胞标本进行HPV DNA分型检测和高危HPV E6/E7 mRNA检测。 结果 慢性宫颈炎、CINⅠ组中高危HPV DNA的检出率(29.1%)明显高于高危HPV E6/E7 mRNA(8.3%),高级别宫颈病变组中高危HPV E6/E7 mRNA的检出率(85.7%)明显高于高危HPV DNA(64.3%),差异有统计学意义(P<0.05);高危HPV E6/E7 mRNA检测的敏感度、特异性、阳性预测值、阴性预测值(85.7%、91.7%、90.0%、88.0%)均高于HPV DNA分型检测(64.3%、70.8%、65.9%、69.3%),差异有统计学意义(P<0.05)。 结论 高危HPV E6/E7 mRNA检测在临床诊断过程中大大降低过度检查和治疗的机会,避免了高频率和重复感染给患者带来的经济负担和精神压力。     

纳米板转导HPV18 E7siRNA对宫颈癌细胞增殖的抑制作用

目的 通过纳米板转导HPV18 E7 siRNA进入HPV18 E7宫颈癌转基因鼠皮肤组织,探讨纳米板转导siRNA的效率及转导的siRNA对宫颈癌细胞增殖的抑制作用.方法 纳米板转导FITC标记的寡聚DNA(代替siRNA)进入小鼠皮肤,观察荧光变化,判断DNA是否被转导进入皮肤细胞中;纳米板转导DiI标记脂质体与siRNA复合物进入小鼠皮肤,测定转导前后和残留在皮肤上的荧光强度,计算纳米板转导siRNA进入组织细胞的效率;纳米板转导E7 siRNA和脂质体的复合物于转基因鼠皮肤中后,BrDU免疫组化检测siE7对宫颈癌细胞增殖的抑制作用.结果 纳米板转导寡聚DNA后绿色荧光逐渐分散变多,表明DNA已逐渐进入小鼠皮肤细胞中.纳米板转导DiI标记脂质体与siRNA进入小鼠皮肤后,通过荧光强度计算得出转染率为50.23％.纳米板转导E7 siRNA进入HPV18 E7宫颈癌转基因鼠皮肤后,能有效抑制宫颈癌细胞增殖.结论 纳米板能高效的转导siRNA进入组织细胞,并且转导进入细胞的siE7能有效抑制宫颈癌细胞增殖.