构建带内支撑组织工程睾丸假体的实验研究

目的探讨以医用多孔高密度聚乙烯(high-density polyethylene,HDPE,商品名为Medpor)为内支撑,外裹聚羟基乙酸(polyglycolic acid,PGA)的支架,接种软骨细胞后,于裸鼠体内构建组织工程睾丸假体的可行性及特点。方法取新生雌性长枫杂交仔猪1只,取四肢大关节表面软骨,制备密度为5×107/ml的软骨细胞悬液。将其接种于长短半径分别为6mm和4mm的Medpor,外裹2mm PGA的支架,体外培养2周。取4周龄BALB/C裸鼠10只,随机分为两组(n=5)。实验组:采用制备的细胞-支架复合物植入裸鼠背部皮下;对照组:采用Medpor-PGA复合支架植入裸鼠皮下。8周后处死裸鼠取材,行大体观察、组织学及免疫组织化学观察。结果大体观察:实验组标本形状与体积未发生变化,色泽及弹性与正常软骨相似,软骨与Medpor接合紧密;对照组无软骨形成,外包裹纤维样组织。实验组:HE染色见软骨内存在大量成熟的软骨陷窝,无血管长入,部分PGA尚未降解完全;甲苯胺蓝染色示细胞外基质具有异染特性;藏红花染色示基质中大量蛋白聚糖沉积;型胶原免疫组织化学染色呈强阳性表达。对照组:Medpor被大量富含血管的纤维组织包裹。结论利用Medpor与PGA复合的支架,接种软骨细胞后,可于体内构建出具有预构睾丸形态且组织学良好的Medpor-软骨复合体。     

组织工程小血管摩擦力测量方法的研究与应用

目的设计一套用于组织工程小血管内壁摩擦力测量的装置并对组织工程血管的材料进行初步的测量,以验证装置的可靠性和相关结论。方法根据血液动力学的原理,对血管的力学模型进行分析,确定组织工程血管内皮细胞摩擦力的测量方法,从而设计完成整套装置并对弹性元件进行测量,并进行组织工程降解材料聚羟基乙酸PGA构成的管状支架进行摩擦力的测量。结果设计完成了测量组织工程血管内壁摩擦力的实验装置,弹性元件的牵拉力与位移的关系呈良好的线性关系。聚羟基乙酸PGA管状支架的摩擦力随流速的增加而增加。结论测量组织工程血管内壁摩擦力的实验装置是可行的,聚羟基乙酸PGA管状支架的摩擦力与流速基本呈现线性关系。     

四肢小口径组织工程血管的实验研究

目的研究以小肠黏膜下层组织（small—calibu tissue，SIS）为血管支架，在体内血流条件下培养小口径组织工程血管的可行性。方法自犬隐动脉分离出血管种子细胞，与Ⅰ型胶原蛋白凝胶均匀混合，种植于SIS膜表面，包绕3mm聚乙烯棒制成3层管状支架，为实验组；制成单层无细胞管状支架，为对照组。两种支架作为血管移植物，分别植入15只犬两侧股动脉缺损处进行桥接吻合。术后进行彩超、组织学评价血管的形成过程。结果术后12周，14个3层血管支架保持通畅，通畅率为93．3％，有明显的血管生物结构形成。单层血管支架5个出现部分狭窄，只有3个完全通畅，通畅率为52．6％。结论SIS膜制成的3层血管支架能直接修复血管缺损，并能在体内环境中培形成生物化的小口径组织工程血管。     

生物可降解材料聚乳酸/聚羟基乙酸复合壳聚糖在人工冠状动脉血管支架制备中的应用

第一代金属裸支架和第二代涂层支架介入治疗冠状动脉粥样硬化性心脏病(冠心病)已得到广泛应用。由于长期存在金属支架异物刺激及其携带的药物扰乱血管壁各层细胞生长,引起支架内再狭窄和血管栓塞,远期仍有较多的主要心血管不良事件发生和需要再血管化治疗。因此,由聚酯、聚碳酸酐及聚磷酸酯等高分子材料制备的完全可生物降解吸收支架及药物洗脱支架应运而生,其中聚乳酸(poly-lactic acid,PLA)、聚羟基乙酸(poly-glycolicacid,PGA)、壳聚糖、聚己内酯(poly-caprolactone,PCL)及一些共聚物如聚乳酸/聚羟基乙酸共聚物(poly-lactic-co-glycolic acid,PLGA)材料制备的心血管植入支架的安全性、组织及血液相容性已得到证实,然而这些支架具有各自的缺点,如PLA降解较慢质硬易断裂柔韧性不足,PGA降解较快质软支撑力不足,支架降解太快或者太慢,均难以达到有效支撑,支架植入后容易出现血管损伤、弹性回缩,导致血管再狭窄及血栓形成,远期效果不佳。通过优化组合不同摩尔比的PLA和PGA及壳聚糖涂层,可以获得具有更好的生物相容性、适度的降解速率(约3～6个月完全降解)、足够的机械强度、较低的炎症反应和伸展度良好的复合材料,从而为制备完全生物可降解冠状动脉支架奠定实验基础。     

应用骨髓基质干细胞体外构建组织工程化管状软骨的实验研究

目的以骨髓基质干细胞(bone m arrow strom a cells,BMSCs)为种子细胞,接种于管状聚羟基乙酸(PGA)支架上,在体外构建组织工程化管状软骨。方法取长枫杂交仔猪髂骨骨髓,在低糖DMEM完全培养液培养2周,传代后以浓度为5×107/m l细胞悬液均匀接种于管状PGA支架上,以高糖DMEM低血清特定培养液诱导(含胰岛素2 mg/L、转铁蛋白3 mg/L、丙酮酸100mg/L、地塞米松10-7mol/L、TGF-β10ng/L、葡萄糖4.5 mg/m l、2%胎牛血清),连续诱导培养10周,从大体、组织学和Ⅱ型胶原免疫组化对再生组织进行评价。结果6周时染色见BMSCs-PGA复合物表层为2~4层成纤维样细胞组成的软骨膜,下层为较成熟的软骨组织,软骨细胞包埋在软骨陷窝内,有很多散在PGA纤维,而在中间部分,组织量较少,结构较构散。10周时BMSCs-PGA复合物外观呈乳白色软骨样,管壁较厚,有一定的弹性,但中间部管腔塌陷较明显,苏木素-伊红染色见实验组管状BMSCs-PGA和6周时相似,但结构更致密和规则,细胞数量较正常软骨组织少,还可见少量的未降解的PGA纤维。免疫组化证实形成的组织有Ⅱ型胶原分布。结论管状BMSCs-PGA复合物在特定培养液诱导下,在体外能形成管状软骨,这为将来临床应用BMSCs作为种子细胞,修复软骨缺损或构建复合组织气管提供了实验基础和技术参数。     

小口径组织工程血管体外构建的研究

目的 探讨间充质干细胞体外构建组织工程血管的可行性.方法 将体外培养扩增的犬骨髓间充质干细胞(MSCs)定向分化为平滑肌样细胞和内皮样细胞,接种于ε-己内酯/L-丙交酯(PCLA)支架上,将其置于生物反应器内,在搏动性力学(100±20/55±20)mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)刺激条件下培养.3 d后行血管组织学检测.结果 血管支架拉伸强度6.1 MPa;骨髓间充质干细胞成功定向分化为平滑肌样细胞和内皮样细胞;血管腔内表面完全为细胞覆盖,表面的细胞沿液体流动的方向分布;种植的部分细胞已经渗透入血管壁内.结论 骨髓间充质干细胞可作为种子细胞,与PCLA支架在生物反应器内构建组织工程血管.     

组织工程学方法体外构建血管的研究

目的 探讨用组织工程学方法构建血管的可行性。方法 实验组：将体外培养、扩增的人脐带动脉平滑肌细胞与用可降解的生物材料聚乙醇酸(PGA)制成的管状结构结合，体外培养1周后植入裸鼠背部皮下。分别于2、4、5、6、11周取材进行大体及组织学检测；对照组：将没有细胞的单纯管状PGA植入裸鼠背部皮下，于相同时间点进行检测。结果 实验组在观测点均形成一内壁光滑的管状结构，组织学检测表明，该结构随观测时间的延长组织学成分也有明显的变化，从开始以PGA为主向平滑肌细胞及其分泌的胶原为主要成分过渡。而对照组则随着PGA的降解管状结构逐渐丧失。结论 组织工程学方法可形成具有一定张力及组织成分的管状结构。该方法用于构建血管是可行的。     

生物衍生骨复合骨髓基质干细胞修复山羊胫骨缺损的血管化研究

目的研究生物衍生骨与骨髓基质干细胞(marrow stromal stem cells, MSCs)复合修复山羊胫骨缺损的血管化过程,了解其修复长段管状负重骨缺损的血管化情况. 方法制备生物衍生骨作为支架材料,培养、诱导MSCs作为种子细胞,二者在体外复合构建组织工程骨.20只山羊双侧胫骨中段制备成20 mm长的骨-骨膜缺损模型,采取自身左右侧对照,实验侧(右侧)缺损处植入组织工程骨,对照侧(左侧)植入单纯支架材料,采用钢板内固定.术后2、4、6及8周用墨汁灌注透明标本及血管面积图像分析方法观察血管化过程,组织学观察血管形成及成骨情况. 结果术后2、4周,实验侧血管形成较对照侧少(P<0.05);术后8周,两侧均完全血管化,差异无统计学意义(P>0.05).实验侧于术后6、8周新骨形成逐渐增加,材料降解吸收较对照组快;对照侧术后8周材料孔隙内仍无明显新骨形成. 结论生物衍生骨作为骨组织工程的支架材料,能够较快发生血管化;组织工程骨成骨能力较单纯支架材料强.     

应用胶原支架构建组织工程心脏瓣膜的初步研究

目的 探讨应用胶原支架构建组织工程心脏瓣膜的可行性。方法 行兔皮下包埋实验。分别于4、6、8、12周观察材料的生物相容性和降解率。将犬主动脉壁间质细胞和主动脉内皮细胞种植于胶原膜上，进而将此瓣叶植入犬腹主动脉内3个月，观察材料吸收和瓣叶结构的变化。结果 胶原膜呈网孔状结构，孔径107μm。皮下包埋实验显示，材料生物相容性好，完全降解时间为12周。体内实验显示，材料于12周末被间质细胞合成的细胞外基质所取代，瓣叶表面有内皮细胞覆盖。结论 以胶原膜为支架构建组织工程心脏瓣膜是可行的，但材料在强度和组织相容性方面尚需改进。     

仿生型人工小血管支架的构建与体内降解研究

目的 以复合成型工艺构建可降解仿生型人工小血管支架,观察其体内降解过程及组织反应.方法 模仿天然血管的三层结构,使用可降解的聚埘二氧环己酮(PDS)编织支架作为中间弹力层、以小肠黏膜F层(SIS)为外层、内层用共混硫酸软骨素胶原海绵涂层构建复合型人工小血管支架,将支架材料植入比格犬背部脊柱两侧肌肉内,于2、4、12、24周取材,行组织学和透视电镜观察.结果 所有实验动物术后活动正常,切口I期愈合.2～4周时,SIS与胶原结构基本保持,日J见较多的炎细胞浸润,胶原海绵网孔结构开始破坏融合,形成板层结构.12周时,自身纤维结缔组织完全取代胶原海绵材料,纤维组织广泛长人网材孔间隙内,PDS发生了部分的降解,炎细胞浸润明显消退.24周时,支架材料完全吸收,被新生纤维组织填充,炎细胞和和异物巨噬细胞少见.降解过程中未见材料周围组织变性、坏死或肉芽肿异常增生现象.结论 本实验制备的仿生型人工小血管支架组织反应轻,降解时间合适,满足体内组织再生要求,可用于下一步实验.     

体外组织工程血管支架内皮化的实验研究

目的：研究兔血管内皮细胞种植于组织工程血管支架内腔面的生长状况。方法：（1）将聚羟基乙酸（Plyglycolic acid,PGA)纤维无纺网和胶原纤维相混合，设计构建组织工程血管支架材料。（2）采用酶消化法从兔主动脉中分离培养兔血管内皮细胞并传代，纯化，接种于组织工程血管支架的内腔面，体外培养，并行电镜等观察。结果：该支架具有一定弹性和韧性，内皮细胞在其内表面形成较完整内皮细胞层，生长状况良好。结论：胶原包埋处理的PGA支架可以作为组织工程人工血管研究的较理想支架材料。为组织工程方法构筑具有分层结构的组织工程血管打下实验基础。     

血管内皮细胞与平滑肌细胞复合构建组织工程人工血管的实验研究

目的：构建既具有活性血管平滑肌细胞（VSMC）中膜层，又有血管内皮细胞（VEC）内皮化的复层结构组织工程血管支架材料。方法（1）将聚羟基乙俊（PGA）纤维无纺网，VSMC和胶原纤维相混合，设计构建VSMC活性的组织工程血支架材料。（2）采用酶消化法从兔主动脉中分离培养兔VEC并传代，纯化，接种于组织工程人工血管支架的内腔，体外培养，并行电镜观察。结果：构建的支架材料具有一定弹性和韧性，VEC在其内表达形成较完整内皮细胞层，且VSMC能够保持活性，生长状况良好。结论：经胶原包埋处理的PGA支架可作为组织工程化人工血管研究较理想支架材料，为组织工程方法构建具有分层结构的组织工程血管奠定实验基础     

组织工程人工血管支架的预构

目的：探讨具有血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells,VSMCs）活性的组织工程人工血管支架的构建方法。方法：①将聚羟基乙酸（polyglycolic acid,PGA）纤维无纺网支架材料、血管平滑肌细胞和胶原纤维相混合，构建组织工程血管。②将VSMCs置入胶原凝胶中，观察VSMCs的生长状况。③观察VSMCs胶原悬液滴入该支架材料中的生长。结果：①VSMCs在胶原凝胶中的位置固定，分布于不同层次，约3－4h逐渐形成多个胞质突起。随时间推移，胞质突起继续伸展，部分细胞呈梭形、纺锤形。②VSMCs胶原悬液滴入胶原包埋处理的PGA支架中后，大部分细胞随胶原凝胶状态的形成，滞留于支架材料网孔中，细胞可沿PGA纤维表面生长。结论：胶原包埋处理的PGA纤维无纺网是良好的携带VSMCs的多孔生物降解材料。     

含内皮祖细胞的组织工程皮肤体外构建及裸鼠移植研究

目的构建含内皮祖细胞（EPC）和成纤维细胞的组织工程复合皮，初步研究EPC在组织工程皮肤移植中促血管发生的作用。方法采用免疫磁珠法从人脐血中分离培养CD133＋血管内皮祖细胞，以聚羟基乙酸（PGA）为真皮基质，接种EPC和成纤维细胞，其上覆盖表皮细胞膜片，构建组织工程复合皮，覆盖裸鼠背部全层皮肤缺损创面。结果EPC和成纤维细胞能均匀贴附于PGA支架纤维材料上，并逐渐伸展为梭形或多极状。裸鼠移植实验表职，实验组创面愈合早于对照组，可见EPC参与大量新生小血管形成，真皮支架5周完全降解。结论EPC参与血管重建，具有促进血管新生，加速缺血组织血管化的作用。应用PGA＋纤维蛋白凝胶，制备含EPC和成纤维细胞的活性真皮替代物，具有良好的生物相容性、降解特性。     

小口径动脉移植修复大口径动脉缺损的观察

目的 探讨小口径动脉移植复大口径动脉缺损的可能性及效果。方法 应用二级大白鼠５０只,取长为７ｍｍ,口径为０．３～０．４ｍｍ的尾动脉移植修复口径为１．０～１．４ｍｍ的颈动脉缺损。分别于手术后３周及５,１０,１２个月观察移植物的通畅情况及病理变化。结果 术后１年移植物的通畅率为９５％（１９／２０）。内膜增生于术后３击主要存在于邻近吻合口部位的血管内膜,术后５个月移植动脉全长内膜增生严重,且比较均匀,术     

First successful clinical application of tissue engineered blood vessel

With this tissue engineering (TE) technique, the peripheral pulmonary artery was successfully reconstructed, using the patient's own venous cells in a 4-year-old girl, 2 years after Fontan procedure. A 4-year-old girl was given a diagnosis of single right ventricle, double-outlet right ventricle and pulmonary atresia. She underwent left modified Blalock-Taussig shunt at a month old, pulmonary artery angioplasty at a year and 3 months old, and bidirectional cavopulmonary shunt at 2 years and a month old. She underwent again pulmonary artery angioplasty and Fontan operation at 3 years and 3 months. An angiographical examination 7 months after the operation revealed total occlusion of the right intermediate pulmonary artery. TE technique using autologous cells was indicated. The application of this procedure was approved by the ethical committee in Tokyo Women's Medical University. The patient's parents were thoroughly informed and signed a consent form. Approximately 2 cm of the peripheral vein was explanted under sterile conditions. The tissue was minced, placed in tissue culture dishes and cultured at 37 degrees C, 100% humidity and a 5% CO2 atmosphere for almost a month. The number of cells substantially increased to reach 12 millions for almost a month. The culture medium was changed every 3 days. The polymer tube that served as a scaffold for cells was composed of the copolymer of PCL-PLA (50:50) with reinforcement by woven PGA. The polymer conduit, 10 mm in diameter, 20 mm in length and 1 mm in thickness, was designated to biodegradate within 8 weeks. The number of seeded cells was approximately a million/cm2. The graft transplantation was performed 10 days after seeding cells. The occlusive right intermediate pulmonary artery was reconstructed with the TE vessel graft under extracorporeal circulation with a pump-oxygenator. The patient followed a satisfactory postoperative course. The postoperative angiography demonstrated that the graft was not constricted and dilated but that it preserved good patency. Long-term follow-up are necessary. We plan to continue to use the TE technique using autologous cells in the low pressure system like venous or pulmonary circulation. Because our results even in early experimental phase were valuable and promising, we believe that the TE approach may play an important role in the near future as an another alternative, together with transplantation and artificial organ, especially in the field of cardiovascular surgery that mostly needs replants.     

采用组织工程方法体外构建血管模型的初步实验研究

目的　探索体外构建组织工程化人工血管的可行性。方法　通过酶消化法分离牛主动脉血管内皮细胞,培养、传代,纯化。采用交联胶原包埋处理聚羟基乙酸纤维无纺网(PGA),将第3～7代血管内皮细胞接种于上述材料上,通过特制的旋转装置,缓慢动态旋转培养10天,使内皮细胞在管腔内表面附着生长,扫描电镜观察,采用6-酮-前列腺素-1α放射免疫测试药盒测定管形材料中内皮细胞释放前列环素量。结果　培养血管内皮细胞VIII因子相关抗原抗体染色呈阳性,内皮细胞在管腔内表面贴附良好,细胞之间融合成片,经10天培养,形成较完整内膜层,覆盖率为(91.2±1.5)%,前列环素生成率为（4.6±0.5）μg/cm     

组织工程技术构建小口径血管的实验研究

目的 探讨运用组织工程技术构建血管组织的方法。方法 将体外培养、扩增的新生婴儿脐静脉血管内皮细胞与平滑肌细胞接种于片状聚羟基乙酸材料上,形成细胞-材料复合物,将该复合物包绕于硅胶管使成管状结构后移植于裸鼠皮下,第2及第6周后行大体及组织学检测。结果 组织工程技术构建的血管组织大体结构与天然血管相似,免疫组化显示组织工程化血管最内层有Ⅷ因子阳性细胞覆盖,管壁内有大量细胞外基质及散在的α-平滑肌肌动蛋白阳性细胞存在。结论 运用组织工程技术可形成具有与正常血管组织学结构相似的血管。