EBV-LMP2A重组腺病毒体外转染树突状细胞激发特异性CTL的研究

目的：用EBV潜伏膜蛋白2A(EBV-LMP2A)重组腺病毒转染树突状细胞(DC)激发特异性细胞毒性T细胞(CTL)，分析CTL的特性。方法：用AdS-LaMP2A重组腺病毒转染EBV健康携带者及鼻咽癌患者的DC，与自体来源的外周血单个核细胞(PBMC)混合培养，激发LMP2A特异性CIL。用LDH释放法检测CIL杀伤活性；流式细胞术(FACS)检测培养细胞群体中CD3^ 、CD4^ 、CD8^ 、CD56^ 细胞的组成；生物活性法检测细胞培养上清中IFN-γ含量；RT-PCR分析CTL的FasL mRNA表达。结果：EBV健康携带者及鼻咽癌患者的PBMC，经AdS-LMP2A转染的自体DC两次刺激后，都能诱导出显著的EBV-LMP2A特异的CIL。EBV健康携带者CTL的杀伤活性，随DC刺激次数的增加而逐渐增强，诱导的CTL细胞群体以CD^4 和CD8^ 细胞组成为主，且CD4^ 细胞比例高于CD8^ 细胞，另含少量CD56^ 细胞；在不同时段所诱导的CTL上清中，均含一定量的IFN-γ并随刺激次数和诱导时间的延长呈上升趋势；RT-PCR研究表明，所诱导的CTL有FasL mRNA的表达。结论：以腺病毒载体介导EBV-LMP2A基因转染的成熟DC，在体外能激发较强的LMP2A特异的功能性CTL，可用于EBV相关NPC的免疫治疗。     

含H5N1-HA基因重组腺病毒疫苗的构建及其诱导免疫应答的初步探讨

目的 构建包含H5N1-HA基因的重组腺病毒疫苗并探讨其免疫效果.方法 用Admax系统构建包含H5N1-HA基因的重组腺病毒疫苗,并用PCR、Western-Blot等方法对重组病毒疫苗进行鉴定;疫苗免疫小鼠后,通过HI实验和ELISPOT实验检测其体液免疫和细胞免疫反应,评价其免疫效果.结果 成功得到了含有H5N1-HA基因的重组腺病毒疫苗;基因表达鉴定表明,HA基因能够在细胞中进行表达;血凝抑制实验结果显示小鼠产生的针对HA抗体滴度在1:320和1:640之间;ELISPOT结果显示实验组和对照组(PBS)相比斑点数量差异有统计学意义(P<0.05),以上免疫结果表明重组腺病毒载体疫苗可以诱导小鼠产生良好的特异性体液和细胞免疫反应.结论 含H5NA-HA的重组腺病毒疫苗可以诱导小鼠产生良好的免疫反应,为研制人禽流感疫苗打下基础.     

腺病毒重组疫苗载体构建的研究进展

腺病毒(Ad)基因组E_1、E_3、以及E_4区和右侧端插入性末端重复(ITR)之间的区段,均存在外源基因插入位点。本文论述了外源保护性免疫原基因插入Ad基因组上述不同位点构建各类重组疫苗载体的研究进展。     

Ad-LMP2重组腺病毒疫苗在恒河猴体内免疫效果的研究

目的观察带有EBV-LMP2的非复制型Ad-LMP2重组腺病毒疫苗免疫恒河猴诱导的针对EBV-LMP2的特异性细胞和体液免疫应答。方法分别使用高剂量(4·5×1011VP/kg)、中剂量(1·5×1011VP/kg)、低剂量(0·5×1011VP/kg)三个剂量的Ad-LMP2重组腺病毒,肌内注射免疫恒河猴,每5d免疫一次,共免疫6次,第7周时使用ELISPOT方法检测猴外周血细胞毒性T细胞应答,同时应用免疫酶方法检测血清中抗LMP2抗体。结果3个剂量免疫恒河猴均可以诱导出有效的细胞免疫应答及一定的抗体应答,免疫应答水平的高低与病毒剂量的高低有一定的关系,较高剂量产生的细胞及体液免疫应答水平比低剂量的要高。抗腺病毒中和抗体和抗LMP2抗体免疫2周后就可以检测到,其中抗LMP2抗体在免疫3~4周时滴度较高,7周时则与3~4周时接近或有所下降。结论非复制型Ad-LMP2重组腺病毒疫苗可以有效的诱导恒河猴产生EBV-LMP2特异性细胞和体液免疫反应。     

EB病毒潜伏膜蛋白2 DNA疫苗的构建及其初步免疫效果观察

目的：以EB病毒潜伏膜蛋白2（latent membrane protein 2,LMP2)为靶基因,构建EBV－LMP2的侯选DNA疫苗,并初步探讨其在小鼠体内诱导特异性细胞毒方面的作用,为研制鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma,NPC)等EB病毒相关肿瘤的治疗性疫苗提供有益资料。方法：将EB病毒LMP2全cDNA片段克隆至含CMV早期启动子的真核表达载体pCDNAⅢ,构建CMV启动子EB病毒LMP2DNA疫苗,在体外将重组质粒转染COS细胞,以RT－PCR和间接免疫荧光法检测重组质粒在转染的COS细胞中的转录和表达,采用50μg,100μg,200μg3种质粒剂量进行初步的小鼠后可诱发机体产生会对LMP2蛋白的特异性体液免疫和细胞免疫,50μg,100μg,200μg 3种免疫剂量产生的抗体水平差异不大。在免疫接种6周后,重组质粒免疫的小鼠产生针对LMP2的特异性CTL均明显高于空载体免疫小鼠,3种剂量的CTL结果显示：在100μg,200μg免疫组,小鼠诱导产生的CTL水平要略高于50μg免疫组。结论：EB病毒重组质粒LMP2免疫小鼠可以诱发小鼠产生特异的体液和细胞免疫应答,这些结果为研制鼻咽癌DNA疫苗提供有益的资料。     

Epstein—Barr病毒潜伏膜蛋白2A重组痘苗病毒转染DC及特异性CTL的体外诱导

通过ＥＢ病毒ＬＭＰ２Ａ重组痘苗病毒转染的ＤＣＳ体外诱导ＬＭＰ２Ａ特异性ＣＴＬ,并通过ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－４和ＴＮＦ－ａ培养体系,我们诱导出了人外周血单核细胞来源的ＤＣ。同时选用在鼻咽癌患者中表达的ＥＢ病毒潜伏蛋白之一ＬＭＰ２Ａ作为靶基因,利用重组痘苗病毒转染诱导的ＤＣＳ。ＤＣＳ与自体ＰＢＭＣＳ混合培养,在ＩＬ－２的刺激作用下获得特异性ＣＴＬ。结果如下：１．人外周血单核细胞经ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－４、ＴＮＦ－ａ的混合培养,１０天可获得成熟的功能性ＤＣＳ。ＦＡＣＳ检测显示ＤＣ表面相对特异性标志ＣＤ８３…     

狂犬病病毒核蛋白基因-重组犬2型腺病毒的构建研究

目的获得具有感染性的狂犬病病毒核蛋白-犬2型腺病毒,并对重组病毒生物学和免疫学特性进行初步探讨。方法对克隆的犬2型腺病毒全基因组E3区进行部分缺失后,插入由CMV启动子、狂犬病病毒SRV9株核蛋白基因和牛生长激素polyA构成的长2392bp的表达盒,然后通过AscⅠ和PvuⅠ双酶切,游离重组全基因组,转染犬肾细胞系。结果盲传5代后,细胞产生典型病变。经鉴定,确定得到了狂犬病病毒核蛋白-重组犬2型腺病毒（CAV-2-RN）。Western blot检测表明,狂犬病病毒核蛋白在重组犬2型腺病毒中得到了表达。结论重组病毒可以诱导受试犬产生针对犬2型腺病毒和狂犬病病毒核蛋白的特异性抗体。     

重组B7—2腺病毒载体的构建及其诱导小鼠抗肝癌免疫的初步研究

探讨重组腺病毒介导的Ｂ７－２基因转染对小鼠肝癌细胞免疫原性的影响。构建Ｂ７－２的重组腺病毒载体，通过重组腺病毒介导，将Ｂ７－２和ｌａｃＺ基因分别转染小鼠肝癌细胞Ｈｅｐａｌ－６，并在不同时相检测Ｂ７－２和ｌａｃＺ基因的表达水平，建立小鼠肝癌肿瘤模型，在小鼠体内观察Ｂ７－２基因转染对小鼠肝癌免疫原性的影响。成功地构建了Ｂ７－２的重组腺病毒载体，用Ｂ７－２及ｌａｃＺ重组腺病毒分别转染小鼠肝癌细胞，转染后     

抗原基因修饰的树突状细胞诱导机体产生特异性免疫应答的实验研究

目的：探讨腺病毒介导的肿瘤抗原基因修饰的树突状细胞（ＤＣ） 体内免疫后对抗原特异性抗肿瘤免疫反应的诱导作用。方法：以βｇａｌ 为模拟抗原,以转染有ＬａｃＺ基因并稳定表达βｇａｌ 的淋巴瘤细胞Ｅ２２ 为肿瘤细胞模型,用携带编码βｇａｌ的ＬａｃＺ基因的重组腺病毒载体（ＡｄＬａｃＺ） 转染小鼠骨髓ＤＣ,检测转染的效率及ＬａｃＺ基因修饰ＤＣ刺激Ｔ细胞增殖的能力,观察皮下免疫ＬａｃＺ基因修饰ＤＣ后小鼠引流区淋巴结细胞数量和组分的变化以及诱导产生ＣＴＬ和抵抗Ｅ２２ 细胞再攻击的能力。结果：ＬａｃＺ基因修饰后２４ 、４８ 、７２ ｈ,均能检测到８０％ 以上的ＤＣ表达βｇａｌ,此基因修饰的ＤＣ可有效刺激同基因型小鼠脾脏Ｔ淋巴细胞增殖反应;将其皮下免疫小鼠１ ｗ 后再接种Ｅ２２ 细胞,小鼠的存活期较其他ＤＣ免疫小鼠显著延长,但对Ｂ１６ 黑色素瘤细胞的攻击无免疫保护作用。此外,ＬａｃＺ基因修饰的ＤＣ免疫小鼠的引流淋巴结细胞数量显著增加,且产生了针对Ｅ２２ 的而非ＥＬ４ 或Ｂ１６ 的特异性ＣＴＬ。结论：腺病毒介导的肿瘤抗原基因修饰的ＤＣ能有效诱导机体产生特异的抗肿瘤免疫反应。     

汉坦病毒嵌合基因G2S0.7与CTL多表位重组腺病毒的构建及免疫学分析

目的:构建含有汉坦病毒M基因(编码糖蛋白G2)和部分S基因(编码核蛋白主要抗原区段)以及S基因的多个CTL表位的多种重组腺病毒表达载体,并对这些重组腺病毒的免疫学特性进行研究。方法:构建含目的基因的重组腺病毒载体,并在VeroE6细胞中进行表达,利用纯化后的重组腺病毒免疫BALB/c小鼠,通过ELISA、微量细胞中和试验、T淋巴细胞增殖实验及CTL杀伤实验等方法检测免疫反应。结果:成功表达出可被抗汉滩病毒核蛋白及糖蛋白G2的特异性单克隆抗体(mAb)所识别的融合蛋白;重组的腺病毒可以有效诱导针对汉坦病毒NP及GP的体液免疫应答和细胞免疫应答;同时我们发现含有CTL表位的重组腺病毒比不含CTL表位的重组腺病毒可以诱导小鼠产生更为有效的细胞免疫反应。结论:构建的含CTL多表位的重组腺病毒可以有效的提高嵌合基因刺激细胞免疫应答的能力。     

人IL-2重组腺病毒转染人肺腺癌细胞的体外生物学特性及体内抗肿瘤研究

目的 :研究感染hIL 2重组病毒的人肺腺癌细胞 (Anip973)的体外生物学特性及小鼠体内抗肿瘤作用。方法 :将携带有hIL 2基因的重组腺病毒 (rAd hIL 2 )感染人肺腺癌细胞系 ,通过细胞生长实验、克隆形成实验等观察其对Anip973肿瘤细胞的作用 ;利用PCR技术对转染后的细胞进行检测并应用ELISA试剂盒检测转染后的细胞IL 2的分泌量 ;通过肿瘤局部注射rAd hIL 2的方法观察其在小鼠体内的抗肿瘤作用。结果 :rAd hIL 2经扩增、纯化后 ,滴度可达 10 1 0 PFU ml,当病毒量为30MOI时 ,对Anip973细胞的转染率达 90 %以上。转染的Anip973肿瘤细胞其生长能力、克隆形成率等无明显变化。 2 4小时细胞培养上清IL 2的分泌量为 2 0pg 1ml 2× 10 5细胞。体内实验表明注射rAd hIL 2的小鼠肿瘤生长缓慢 ,体积明显小于对照组 (P <0 0 5 ) ,生存期显著延长。结论 :腺病毒介导的细胞因子基因hIL 2转染的Anip973肿瘤细胞体外生物学特性未见明显变化 ,而体内实验则有明显的抗肿瘤作用。     

Ad5F35-LMP2重组腺病毒的构建及鉴定

目的：构建Ad5F35-LMP2重组腺病毒.方法：分别以EcoR Ⅰ单酶切pSH-LMP2和pDC316,将LMP2目的基因片段和线性化的pDC3l6连接,克隆构建pDC3l6-LMP2,以PCR和酶切的方法鉴定插入方向正确.pDC3l6-LMP2与腺病毒骨架pBHG-fiber5/35共转染293细胞构建重组腺病毒Ad5F35-LMP2,PCR及间接免疫荧光进行鉴定.结果：经PCR和酶切鉴定证实pDC3l6-LMP2构建成功.pDC3l6-LMP2与腺病毒骨架共转染293细胞后见明显的毒斑,说明二者在293细胞中同源重组并包装成功.经PCR证实重组腺病毒Ad5F35-LMP2构建完成,间接免疫荧光鉴定LMP2蛋白能在细胞膜上有效表达.结论：本实验成功构建了含EB病毒LMP2全序列的Ad5F35-LMP2重组腺病毒,为下一步进行该重组病毒生物安全性能和生物学功能研究及今后应用Ad5F35-LMP2重组腺病毒对鼻咽癌患者进行基因免疫治疗奠定了基础.     

EB病毒潜伏期膜蛋白2A重组腺病毒的制备及表达

目的 :构建EB病毒潜伏期膜蛋白 2A重组腺病毒 ,研究EB病毒相关肿瘤治疗性疫苗。方法 :利用RT PCR扩增出EB病毒B95 8株潜伏期膜蛋白 2A(LMP2A)全部编码蛋白的基因 ,并克隆至pGEM T载体中。并将LMP2AcDNA插入E1、E3区替代的腺病毒载体pAX1CW ,选择正确的克隆pAX1CW LMP2A与Ad5DNA 末端肽复合体共转染 2 93细胞 ,通过同源重组获得复制缺陷型的重组腺病毒。提取重组腺病毒转染的 2 93细胞DNA ,通过酶切初步鉴定。选择阳性克隆感染CV1细胞 ,通过流式细胞仪和激光共聚集显微镜分析LMP2A蛋白表达情况。结果 :挑选同源重组 17个克隆中有 9个为阳性克隆 ,扩增到的病毒滴度为 2 3× 10 8pfu/ml。用MOI =10 0的重组腺病毒感染CV1细胞 ,48h后在激光共聚焦显微镜下可见LMP2A蛋白表达于CV1细胞膜上 ,经流式细胞仪检测LMP2A蛋白表达阳性细胞数为 94 4 %。结论 :重组腺病毒能有效地介导LMP2A基因的表达 ,为进一步研究该基因功能及其工程疫苗打下了基础。     

双特异性重组腺病毒Ad-HT对肝癌细胞的体内、外抑制效应

目的:探讨双特异性抗肿瘤重组腺病毒Ad-HT对肝癌细胞的体内、外抑制作用和作用方式。方法:运用噻唑兰法检测重组腺病毒Ad-HT对BEL-7402细胞的抑制作用;应用AO/EB染色法、DAPI染色法、Annexin V检测、Caspase检测、线粒体膜电位检测和活性氧检测等多种方法分析Ad-HT对BEL-7402细胞抑制作用的方式和途径;构建C57BL/6小鼠荷H22肿瘤模型,瘤内注射重组腺病毒,通过非放射性乳酸脱氢酶细胞毒性检测方法,检测NK活性、CTL活性,利用酶联免疫吸附方法检测IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ等细胞因子水平,探讨Ad-HT对体内实体肿瘤的抑制作用和对免疫系统的影响。结果:Ad-HT能够抑制BEL-7402细胞生长,且其作用具有一定时效和剂效关系趋势;Ad-HT感染导致BEL-7402细胞磷脂膜外翻、细胞核皱缩、细胞膜通透性增加、Caspase酶活性增强、线粒体膜电位下降和活性氧水平升高;Ad-HT实验组模型动物平均期在30天以上,显著高于对照组;另外,Ad-HT具有增强NK和CTL活性,上调IL-2和IFN-γ等细胞因子水平的功能。结论:Ad-HT能够通过诱导细胞凋亡,抑制BEL-7402肿瘤细胞增殖,而这种抑制作用可能通过线粒体途径实现。另外,Ad-HT能够有效延长模型动物平均生存期,活化免疫功能细胞,并使免疫趋向Th1优势。     

EB病毒LMP2A特异性CTL的体外诱导及分析

用EBV LMP2A重组痘苗病毒 (rVV LMP2A )转染人树突状细胞 (DC ) ,转染后的DC分别在第 1、 7、 14天刺激相同MHC背景的T细胞 ,在IL 2作用下诱导LMP2A特异性CTL。用LDH释放法检测CTL杀伤活性 ;流式细胞术 (FACS )检测CTL诱导分化过程中CD3+ 、CD4 + 、CD8+ 、CD5 6 + 等细胞的分群变化 ;RT PCR检测细胞分化过程中FasLmRNA表达 ;生物活性法检测功能性细胞因子IFN γ的分泌。结果显示本法诱导的CTL对靶细胞有特异性杀伤活性 ,第 2次和第 3次DC刺激后杀伤活性有所上升 ;在CTL诱导分化的第 7、 14、 2 1天细胞分群以CD4 + 、CD8+ 细胞为主 ;RT PCR证实所诱导的细胞内有FasLmRNA的表达 ;随细胞培养天数的增加IFN γ分泌增加 ,在第 14天达到较高水平。研究表明重组痘苗病毒载体rVV LMP2A转染的DC刺激T细胞可诱导出EBV LMP2A特异性CTL。     

锌指蛋白ZBTB20基因重组腺病毒表达载体的构建和鉴定*

 目的：构建含锌指蛋白ZBTB20基因的重组腺病毒载体,以研究锌指蛋白ZBTB20的生物学功能。方法：将带有FLAG标签的ZBTB20 cDNA片段（ZBTB20-FLAG）克隆至pAdTrack-CMV载体,将该载体与pAdEasy质粒进行细菌内同源重组从而获得重组腺病毒载体pAd-ZBTB20,之后在293细胞中进行包装以及扩增,并对病毒滴度进行检测;采用肝脏组织特异性ZBTB20基因敲除小鼠的原代肝细胞和肝脏组织模型,分别于离体和在体水平鉴定所制备的重组腺病毒Ad-ZBTB20介导的ZBTB20 蛋白表达情况;并采用报告基因技术检测过表达的ZBTB20蛋白的功能活性。结果：成功制备了锌指蛋白ZBTB20重组腺病毒,该重组腺病毒感染原代肝细胞和小鼠肝脏组织能过表达ZBTB20蛋白,并且此ZBTB20蛋白能抑制其下游靶基因甲胎蛋白的转录。结论：所构建的ZBTB20重组腺病毒可以介导ZBTB20的过表达并具备转录调节活性,为今后研究ZBTB20的相关生物学功能奠定了基础。     

含E型沙眼衣原体MOMP基因的重组腺病毒和DNA疫苗联合免疫效果的研究

目的探讨E型沙眼衣原体（Ct）主要外膜蛋白（MOMP）DNA疫苗和重组腺病毒联合免疫小鼠诱导的免疫效应。方法构建、纯化重组腺病毒Ad-MOMP及重组真核表达质粒pVAX1-MOMP。设计4种免疫方案,分别为DNA免疫（ DNA组）、重组腺病毒免疫（ Ad组）、DNA初次免疫-重组腺病毒加强免疫（ DNA/Ad组）、重组腺病毒初次免疫-DNA加强免疫（ Ad/DNA组）。末次免疫后2周检测小鼠血清特异IgG、IgG1、IgG2a、IgA抗体,阴道分泌物SIgA抗体及脾淋巴细胞分泌IFN-γ、IL-10水平。结果DNA组诱导较弱免疫应答,未产生SIgA抗体及Th1反应。 Ad组诱导出Th1反应及SIgA抗体,且血清抗体显著高于DNA组。联合免疫均能诱导明显强于单独免疫的黏膜SIgA、血清抗体及Th1反应。 Ad/DNA组的Th1反应强于DNA/Ad组;而DNA/Ad组的血清抗体和黏膜抗体水平强于Ad/DNA组。结论Ad-MOMP能诱导黏膜免疫及Th1细胞免疫应答,DNA/Ad及Ad/DNA联合免疫产生的特异性免疫应答明显强于单独免疫。其中Ad/DNA的Th1反应优势更明显,DNA/Ad的血清抗体和黏膜抗体反应更强。接种顺序会影响联合免疫的强弱及类型,这为Ct疫苗的设计研究提供新的思路和实验依据。     

汉滩病毒G1S0.7嵌合基因重组腺病毒的构建及鉴定

目的在本室前期工作的基础上构建汉滩病毒M基因G1片段与S基因0.7kb片段嵌合基因的重组腺病毒。方法构建含有汉滩病毒G1S0.7嵌合基因的转移载体pShuttle-G1S0.7,然后通过特异性的酶切将嵌合基因与腺病毒DNA相连,电转化E.coli JM109,获得重组腺病毒Adeno-G1S0.7 DNA,转染HFX293细胞得到重组腺病毒。进一步对重组腺病毒的滴度和表达产物进行鉴定。结果构建的含G1S0.7嵌合基因的重组腺病毒,滴度可达10^13～10^15 PFU／L;该重组腺病毒感染Vero-E6细胞后,表达出可被抗汉滩病毒核蛋白及糖蛋白G1的特异性单抗（mAb）所识别的融合蛋白。结论利用腺病毒表达系统,成功地表达同时具有核蛋白及糖蛋白G1生物学活性的融合蛋白,为进一步研究其免疫学特性奠定了基础。     

EB病毒潜伏膜蛋白2A基因重组逆转录病毒载体和稳定表达细胞株的构建及鉴定

目的:克隆EB病毒(EBV)潜伏膜蛋白2A(LMP2A)全长基因, 并构建含有该目的基因的重组逆转录病毒载体pGEZ-LMP2A, 转染真核细胞后获得稳定表达LMP2A的细胞株.方法:采用RT-PCR技术从B95.8细胞中获得EB病毒LMP2A全长基因, 克隆到测序载体pMD18-T中, 经测序后再亚克隆到逆转录病毒载体pGEZ-Term中, 与两辅助病毒载体PHIT456、 PHIT60通过Lipofectamine2000共转染包装细胞293T, 测定产生的重组逆转录病毒滴度并感染小鼠成纤维细胞L929, 经Zeocine筛选后得到稳定的细胞克隆, 用RT-PCR和Western blot法检测细胞中LMP2A mRNA和蛋白表达情况.结果:重组逆转录病毒载体pGEZ-LMP2A经测序鉴定正确;转染后上清中病毒的滴度为5×108 cfu/L, 感染L929细胞后用Zeocine筛选出稳定的细胞克隆;RT-PCR和Western blot检测结果表明筛选出的细胞克隆能稳定表达EBV-LMP2A.结论:表达EBV-LMP2A细胞株的构建为蛋白制备与纯化奠定了物质基础, 也为后续的EBV相关性疾病疫苗的研究提供了新思路.